专利名称：五味子活性成分多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种五味子功能活性成分五味子多糖的生产方法。
背景技术：
五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Tarcz.)Baill.的成熟果实， 首载于《神农本草经》，列为上品，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能。 从20世纪50年代开始，中国、日本、前苏联等国学者运用现代科学手法， 作了大量研究，证明五味子可以降低肝炎患者血清中谷丙转氨酶；治疗肝脏的化 学毒物损伤；对中枢神经有兴奋作用，能增强肌体对非特异性刺激的防御能力； 使低血压患者血压升高，但不会使正常血压升高；影响大脑皮层的兴奋和抑制， 改善人的智能，增加记忆力；增强肾上腺皮质功能，促进心脏活动。其功能 主要源于它的活性成分多糖、木质素等。前人研究结果表明其水提液具延缓衰 老的作用；乙醇提取液具安眠镇静作用；木脂素具有保肝护肝作用。
长期以来，我国的科技工作者大多研究的是五味子的栽培和驯化，这些技 术也日益成熟，从而，五味子的产量剧增，其深加工形势严峻。其加工主要集 中在多糖和木质素中，国内外也有文献报道。对于五味子多糖，刘放(中医药 学报.1994. (3): 43-44);张兰杰(鞍山师范学院学报.2002-03. 4(1): 58—60.); 薛梅，(陕西中医.9. 003. 24(3)1267—268.);吕子涛(黑龙江医药，1997， 10(2): 190-191)，韩学忠(中国医药学报，2005， 33 (6): 35-36)。仰榴青等人 申请发明采用提取木脂素后的渣料提取多糖物质(申请号200610041566.4)。
但是，以上的研究和专利有关五味子多糖的报道，都是对五味子整果的报 道，而且，大部分都是研究的五味子干果，未见鲜果的报道。鉴于五味子的功 能性成分木质素和多糖，不同的部位中，含量具有重要的差异，五味子多糖多 集中于果肉中，木质素90%都集中在种子中，利用整果提取多糖，不仅不利于 活性成分的分离，而且容易浪费资源。另外，以上报道都是利用热水浸提方法 提取多糖，对脱除蛋白的方法也很少有报道，有采用三氯乙酸脱除蛋白的，由 于其酸性强，容易破坏多糖结构，不利于保护多糖的生理活性。本发明采用籽 果分离技术将果肉和果核进行分离后，并采用生物酶解技术提取五味子多糖，提高提取率。
发明内容
本发明的目的是提供一种依据其不同部位提取不同活性物质的方法，将五 味子的果肉和果核分离，利用生物酶解方法提取五味子多糖，利用超声波等方 法提取和纯化木脂素，使五味子的药用成分得到合理的利用开发。
技术方案如下
一、 原料处理
1. 五味子鲜果清洗，喷淋，除去杂质和发霉果等，加热到60°C 80°C，多 道打浆机打浆，将果浆、种子分离开来，果浆备用，种子用于提取木脂素类活 性物质。
2. 五味子干果拣选，清洗，按干果重5 10倍水浸泡3 12h，加热到60 80°C，多道打浆机打浆，将果浆、种子分离开来，果浆备用，种子用于提取木 脂素类活性物质。
所述五味子为北五味子、南五味子均可用。
二、 多糖提取
1. 单酶提取和水提相结合
① 纤维素酶提取将果浆在30 50℃条件下，加入果浆固形物总量1.5 3.0%的纤维素酶(5万单位/g)，酶解l 5h;升温至90℃灭酶10min，冷却至室 温，离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水使料液比1: 5 15，温度70 100℃， 提取2 5h，冷却至室温，离心，得上清液和沉淀；沉淀再用水提1 3次，离 心，合并提取液。
② 或用果胶酶提取将果桨在30 50℃条件下，加入果浆固形物总量1.5 3.0%的果胶酶(5万单位/g)，酶解1 5h;升温至90℃灭酶10min，冷却至室温， 离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水使料液比l: 5 15，温度70℃ 100℃， 提取2 5h，冷却至室温，离心，得上清液和沉淀；沉淀再用水提1 3次，离 心，合并提取液。
2. 双酶提取和水提相结合
将果浆在30 50℃条件下，加入果浆固形物总量1.0 2.0%的纤维素酶(5 万单位/g)和1.0 2.0%的果胶酶(5万单位/g)，酶解l 5h;升温至9(TC灭酶 10min，冷却至室温，离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水使料液比l: 5 15，温度70 10(TC，提取2 5h，冷却至室温，离心，得上清液和沉淀；沉淀再用
水提1 3次，离心，合并提取液。
三、 乙醇分级
将提取液浓縮至体积的1/5 1/4冷却，将浓縮液加入到浓縮液体积3 5倍 的95%乙醇溶液中，4。C下，醇沉12 16h;离心，收集沉淀。
四、 脱除蛋白
将沉淀用5 20倍的水溶解，离心，反复溶解3 5次，收集上清液，合并。 用柠檬酸调pH为4.5 5.0，加入溶液重0.05-0.15%的酸性蛋白酶(2万单位/g)， 50 55"酶解1 4h脱蛋白，90。C灭酶10分钟后，冷却至室温，离心，上清液 再用Sevag法脱除蛋白3 6次后(多糖液脱蛋白液=5: 1，脱蛋白液为氯仿 和正丁醇的混合物，氯仿正丁醇=5: 1)，得到脱蛋白后的多糖液。
五、 醇沉
将脱蛋白后的多糖液浓縮到1/4 1/3体积左右，加入到3 5倍体积95%乙 醇溶液中，4。C下静置过夜，离心，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醇洗涤， 得到多糖沉淀。
六、 干燥
将多糖沉淀置于真空干燥设备中，真空干燥得到五味子多糖。 本发明所具有的优点是
(1) 工艺合理，注重合理利用原料，采用不同的部位提取成分不同，节约 提取剂和酶制剂等辅料，使五味子的开发更为经济。
(2) 本发明还发明了利用鲜果直接提取制备五味子活性成分的方法，节约 了将鲜果烘干成干果的能源。
(3) 本发明在提取五味子多糖过程中，利用酶解技术，温和条件下除去大 量纤维素和果胶，大大地提高了提取率，使多糖的得率超过10% (干基比)。
(4) 在纯化多糖的过程中，采用将多糖浓縮液加入到乙醇溶液中的方法， 使多糖尽可能的沉淀下来，比通常采用的向乙醇溶液中添加多糖溶液沉淀效果 好，提高得率。
(5) 发明了利用酸性蛋白酶与Sevag法相结合脱除五味子多糖中的蛋白质 的方法，脱除次数减少，操作过程简化。
具体实施例方式
实例1
将北五味子鲜果500g，清洗，喷淋，除去杂质和发霉果，加热到60。C，多 道打浆机打浆，得到果浆380g。加入0.4g (固形物总量的1.5%)的纤维素酶(5 万单位/g)， 30。C时，酶解5h;升温至90。C灭酶10min，冷却至室温，4000r/min 离心10min，得上清液和沉淀；沉淀80g加水1200g，温度70'C，提取5小时， 冷却至室温，4000r/min离心10min，得上清液和沉淀；沉淀50g，加水250g， 温度100。C，提取2小时，4000r/min离心10min，沉淀再加水250g提1次， 合并提取液共1500g。浓縮至体积为300ml (原体积的1/5)，缓慢将浓縮液加入 到900ml的95%的乙醇溶液中，4。C下，醇沉12h;离心，得到沉淀32g。将沉 淀溶于640g水中溶解，离心，得上清液和沉淀。沉淀再溶于320g水中，溶解， 离心，沉淀溶于160g水中，离心，合并上清液共1045g。用柠檬酸调pH为4.5， 加入0.53g (0.05%)的酸性蛋白酶(2万单位/g)， 50℃酶解4h脱蛋白，90。C灭 酶10mni后，离心，上清液1020g，用氯仿和正丁醇脱蛋白液200ml，脱除蛋白 3次后，得到脱蛋白后的多糖液960g。浓縮至320g，加入到1600ml的95%乙醇 溶液中，4。C下静置过夜，离心，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醇洗涤， 得到多糖沉淀，真空干燥，得到多糖粉12.8g，采用苯酚硫酸法检测多糖含量为 37.3%。
实例2
将北五味子100g干果拣选，清洗，加入500g水浸泡12h后，加热到80℃， 多道打浆机打浆，得到果浆480g。加入1.008g (固形物总量的3.0%)的纤维素 酶(5万单位/g)，50。C时，酶解lh;升温至9(TC灭酶10min，冷却至室温，4000r/min 离心10min，得上清液和沉淀；沉淀90g加水1000g，温度90。C，提取3h，冷 却至室温，4000r/min离心10min，得上清液和沉淀；沉淀60g，加水600g，温 度100℃，提取2h， 4000r/min离心10min，并提取液共1800g。浓縮至体积为 400ml (原体积的2/9)，缓慢将浓縮液加入到1600ml的95。/。的乙醇溶液中，4°C 下，醇沉12h;离心，得到沉淀38g。将沉淀溶于600g水中溶解，离心，得上 清液和沉淀。沉淀再溶于500g水中，溶解，离心，沉淀溶于200g水中，离心， 再溶解1次,合并上清液共1430g。用柠檬酸调pH为4.8，加入1.43g (0.1%)的 酸性蛋白酶(2万单位/g)， 53。C酶解2.5h脱蛋白，90。C灭酶10min后，离心，
上清液1400g，用氯仿和正丁醇脱蛋白液280ml，脱除蛋白5次后，得到脱蛋白 后的多糖液1300g。浓縮至325g，加入到1300ml的95%乙醇溶液中，4。C下静 置过夜，离心，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醇洗涤，得到多糖沉淀， 真空干燥，得到多糖粉11.6g，采用苯酚硫酸法检测多糖含量为32.9%。
实例3
将南五味子鲜果500g，清洗，喷淋，除去杂质和发霉果，加热到60'C，多 道打浆机打浆，得到果浆360g。加入0.58g (固形物总量的2.0%)的纤维素酶 (5万单位/g)， 4(TC时，酶解3h;升温至90。C灭酶10min，冷却至室温，4000r/min 离心10min，得上清液和沉淀；沉淀70g加水1000g，温度100°C，提取3h，冷 却至室温，4000r/min离心10min，得上清液和沉淀；沉淀48g，加水720g，温 度100。C，提取3h， 4000r/min离心10min，合并提取液共1750g。浓縮至体积 为440ml左右(1/4)，缓慢将浓縮液加入到2200ml的95%的乙醇溶液中，4°C 下，醇沉12h;离心，得到沉淀34克g，将沉淀溶于500g水中溶解，离心，得上 清液和沉淀。沉淀加入170g水，溶解，如实例l，反复溶解5次，离心，合并 上清液共1180g。用柠檬酸调pH为5，加入1.77g (0.15%)的酸性蛋白酶(2 万单位/g)， 55。C酶解lh脱蛋白，90。C灭酶10min后，离心，上清液1120g，用 氯仿和正丁醇脱蛋白液220ml，脱除蛋白6次后，得到脱蛋白后的多糖液1000g。 余下操作如实例l，得到多糖粉12.6克，采用苯酚硫酸法检测多糖含量为38.2%。
实例4
将南五味子100g干果拣选，清洗，加入1000g水浸泡3h后，加热到70℃， 多道打浆机打浆，得到果浆880g。加入1.05g (固形物总量的3.0%)的果胶酶 (5万单位/g)， 5(TC时，酶解lh;余下操作如实例l，得到多糖粉10.8g，采用 苯酚硫酸法检测多糖含量为33.7%。 实例5
将北五味子100g干果拣选，清洗，加入800g水浸泡8h后，加热到70℃， 多道打浆机打浆，得到果浆690g。加入0.675g (固形物总量的1.5%)的果胶酶 (5万单位/克)，4(TC时，酶解5h;余下操作如实例2，得到多糖粉11.2g，采 用苯酚硫酸法检测多糖含量为32.4%。
实例6
将北五味子鲜果500g，清洗，喷淋，除去杂质和发霉果，加热到80℃，多 道打浆机打浆，得到果浆390g。加入0.31g (固形物总量的1.0%)纤维素酶(5 万单位/g)和0.62g (固形物总量的2.0%)果胶酶(5万单位/g)， 50℃，酶解lh; 余下操作如实例3，得到多糖粉12.9克，采用苯酚硫酸法检测多糖含量为38.5%。
实例7
将南五味子100g干果拣选，清洗，加入1000g水浸泡3h后，加热到70℃， 多道打浆机打浆，得到果浆880g。加入1.05g (固形物总量的3.0%)的果胶酶 (5万单位/g)， 50℃时，酶解lh;余下操作如实例l，得到多糖粉10.8g，采用 苯酚硫酸法检测多糖含量为32.7%。
实例8
将北五味子鲜果500g，清洗，喷淋，除去杂质和发霉果，加热到70℃，多 道打浆机打浆，得到果浆380g。加入0.61g (固形物总量的2.0%)纤维素酶(5 万单位/g)和0.31g (固形物总量的1.0%)果胶酶(5万单位/g)， 40℃，酶解3h; 余下操作如实例3，得到多糖粉12.5g，采用苯酚硫酸法检测多糖含量为38.9%。
实例9
将南五味子鲜果500g，清洗，喷淋，除去杂质和发霉果，加热到70℃，多 道打桨机打浆，得到果浆380g。加入0.31g (固形物总量的1.0%)纤维素酶(5 万单位/g)和0.61g (固形物总量的2.0%)果胶酶(5万单位/g)， 40℃，酶解3h; 余下操作如实例3，得到多糖粉12.4g，采用苯酚硫酸法检测多糖含量为38.1%。
实例10
将南五味子100g干果拣选，清洗，加入1000g水浸泡3h后，加热到70℃， 多道打浆机打浆，得到果浆880g。加入0.53g (固形物总量的1.5%)纤维素酶 (5万单位/g)和0.53g (固形物总量的2.0%)果胶酶(5万单位/g)， 45℃，酶 解3h;余下操作如实例2，得到多糖粉11.3g，采用苯酚硫酸法检测多糖含量为 38.0%。
权利要求
1、五味子活性成分多糖的制备方法，其特征在于制备工艺为原料果实打浆分除种子得果实浆；果实浆经纤维素酶或/和果胶酶酶解、离心、沉淀水提得多糖提取液；多糖提取液浓缩后用乙醇分级、离心得沉淀；沉淀用水溶解、离心取清液，调pH4.5～5.0后用酸性蛋白酶酶解、Sevag法脱蛋白得多糖液；再用乙醇进行醇沉得多糖沉淀；将其真空干燥得产品。
2. 根据权利要求1所述的五味子活性成分的制备方法，其特征在于制备工 艺的步骤为(1) 原料处理果实清洗、去杂后60 8(TC打浆，分除种子；(2) 多糖提取果浆于30 5(TC与果浆固形物总量1.5 3.0%的纤维素酶或果 胶酶酶解1 5h，灭酶，室温下离心，沉淀加5 15倍水，70 10(TC提取2 5h，沉淀用同方法重复水提取1 3次，提取液合并；(3) 乙醇分级浓縮提取液至原体积的1/5 1/4后冷却，将浓縮液加入到浓 縮液体积3 5倍的95%乙醇溶液中，4。C醇沉12 16h;离心，收集沉淀；(4) 脱除蛋白沉淀用5 20倍的水溶解，离心，反复溶解、离心3 5次， 上清液合并；用柠檬酸调pH为4.5 5.0，加入溶液重0.05-0.15%的酸性蛋白酶， 50。C 55。C酶解1 4h脱蛋白，灭酶，室温下离心，上清液再用Sevag法脱除 蛋白3 6次后得到脱蛋白后的多糖液；(5) 醇沉脱蛋白后的多糖液浓縮到原体积1/4 1/3，加入到3 5倍体积95% 乙醇溶液中，4。C下静置过夜，离心，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醇洗 涤，得到多糖沉淀；(6) 干燥将多糖沉淀置于真空干燥设备中，真空干燥得到五味子多糖。
3. 根据权利要求1或2所述的五味子活性成分的制备方法，其特征在于五 味子果实为干果，在原料处理中按干果重5-10倍水浸泡3 12h后再打浆。
4. 根据权利要求1或2所述的五味子活性成分的制备方法，其特征在于在多 糖提取工艺中，酶解是用纤维素酶和果胶酶共同进行酶解，其步骤是果浆于30 5(TC与果浆固形物总量1.5 3.0%的纤维素酶和果浆固形物总量1.5 3.0%的果 胶酶共同进行酶解。
5. 根据权利要求1所述的五味子活性成分的制备方法，其特征在于五味子 为北五味子和南五味子。
全文摘要
一种五味子活性成分的制备方法，包括原料处理、多糖提取、乙醇分级、脱除蛋白、醇沉、干燥的制备步骤。其中所述原料处理是利用鲜五味子或者干五味子浸泡后多道打浆，将果浆和种子分开；所述多糖提取是利用纤维素酶、果胶酶的一或两种进行酶解后，再用水浸提；所述乙醇分级是将多糖溶液加入到乙醇溶液中；所述脱除蛋白方法是利用酸性蛋白酶和Sevag方法相结合。本发明提供了一条从五味子中提取活性成分多糖的方法，特别是开辟了一条利用鲜果提取，以及采用籽果分离方法提取活性成分，不仅节约资源和能源、降低提取成本，为五味子的合理开发提供技术支撑。
文档编号C12P19/04GK101200749SQ20071015904
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者于运海, 朱蓓薇, 李冬梅, 毛丰美, 王丽辉, 董秀萍, 雪 阎 申请人:大连工业大学;凤城市大梨树科技有限公司