专利名称：新型细菌表面展示系统、方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及细菌表面展示技术领域，特别是 指一种新型细菌表面展示系统、方法及应用。
背景技术：
细胞表面定位分子在自然界中普遍存在，其表面定位过程由不同的细胞表面蛋白 调控，并形成了很多生物学现象，比如细胞间的识别，信号转导，表面吸附，定殖， 免疫反应等等。研究人员利用这些表面蛋白作为锚定元件将外源的多肽和蛋白与其融 合，将其展示到细菌或病毒的表面从而达到一定的研究和应用目的。将外源蛋白定位 表达在细菌表面后，可以直接用重组微生物进行后续实验操作，免去了目标蛋白的产 物提取，纯化等一系列操作，而且如果展示的是抗原蛋白，由于抗原暴露在细胞表面， 所以更有利于免疫系统的识别，而且外膜上的脂多糖等因子可以增强免疫反应，还可 能作为锚定在细胞表面的目标蛋白的辅助因子而发挥作用(Lee J.S., Shin K.S.， Pan J.G., and Kim C丄2000. Surface-displayed viral antigens on 5W,"e〃a carrier vaccine. Nat. Biotechnol. 18: 645-648 )。第一篇关于将外源多肽或蛋白利用遗传学方法融合到 载体蛋白上，从而成功将它们展示的报道是在1986年分别由Freudl等(Freudl R., Maclntyre S., Degen M., Henning U., 1986. Cell surface exposure of the outer membrane protein OmpA of Esc/zenc/z& co// K-12. J. Mol. Biol. 188, 491—494)以及Charbit等 (Charbit A.， Boulain J.C., Ryter A., Hofnung M. 1986. Probing the topology of a bacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitope; expression at the cell surface. EMBO J. 5, 3029-3037)完成的。之后，许多不同的细菌表面展示系统被研究 和开发出来，使得表面展示技术得到迅速的发展。
在所有被开发和研究的表面展示系统中，应用最广泛的 一 个系统是Lpp-OmpA系 统，它是Georgiou和他的合作者在1992年构建的，他们利用Lpp-OmpA融合子成功的 将(3-内酰胺酶展示到大肠杆菌表面(Francisco J.A., Earhart C.F., Georgiou G. 1992. Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of 5"/zer/c/ /fl co//.Proc Natl Acad Sci U S A 89(7):2713-7 ),该系统由两部分组成1) E co/!'主要外膜脂 蛋白Lpp信号肽以及N端的九个氨基酸；2) ￡. co/;外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸 (包含跨膜区B3-B7)，外源蛋白与此系统的C末端融合。之后，研究者利用该系统 展示了许多外源蛋白，使得该系统在生物催化，抗体制备，固定化细胞，生物传感器 制备等方面都有应用。由于该系统避免了夹心法融合外源蛋白进行表面展示对外源蛋 白的诸多限制，使得以五.co/z'为宿主用该系统进行展示的外源蛋白的大小达到了 70 kDa ( Wan H.M., Chang B.Y., Lin S.C. 2002. Anchorage of cyclodextrin glucanotransferase on the outer membrane of Esc/zm'c/z/a co/f. Biotechnol Bioeng 79(4):457-64 )。利用该系统进行表面展示还有很多优点，比如，Lpp-OmpA系统具有 高效的分泌信号肽和独特的跨膜结构，并提供了适宜的目标蛋白融合位点，而且其坚 固的锚定结构能够准确的将外源蛋白定位在细胞表面。
鳗弧菌是一种重要的鱼类细菌性病原，可以在全世界范围内引起海水鱼和淡水鱼 的流行性疾病，对鱼类养殖造成很大的损失。在鳗弧菌强毒林MVM425基础上通过 DNA重组技术构建的鳗弧菌减毒林MVAV6203 (保藏号为CCTCCNO: M204066,保 藏曰为2004年9月15日，具体请参见中国专利ZL200410089496.0,申请日为2004年12 月14日)，该减毒林毒力减弱了 10000倍，对靶标和非靶标动物安全无毒，并对弧菌 病具有较高的免疫保护力，是一林优秀的减毒活菌疫苗候选抹。
因此，本发明人尝试构建并开发高效的细菌表面展示系统，旨在将来源于其他病 原微生物的保护性抗原因子展示于该鳗弧菌减毒林表面，构建安全高效的鳗弧菌的多 效价载体疫苗。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种新型细菌表面展示 系统、方法及应用，该新型细菌表面展示系统能在细菌细胞表面成功展示目标蛋白， 可用于活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催 化方面，特别用于在鳗弧菌减毒抹的基础上构建安全高效的鳗弧菌多效价载体疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种新型细菌表面展示系统，包括细菌跨膜定位转 运序列和编码目标蛋白的基因序列，所述细菌跨膜定位转运序列包括大肠杆菌外膜脂 蛋白信号肽的核香酸序列，其特点是，所述细菌跨膜定位转运序列还包括鳗弧菌核苷
酸序列，所述鳗弧菌核苷酸序列连接所述大肠杆菌外膜脂蛋白信号肽的核苷酸序列和
所述编码目标蛋白的基因序列，所述鳗弧菌核苷酸序列编码的蛋白包括鳗弧菌外膜蛋 白的跨膜锚定序列。
所述大肠杆菌外膜脂蛋白为Lpp蛋白，所述鳗弧菌外膜蛋白为Omporfl蛋白， OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述细菌跨膜定位转运序列是编码所述L p p蛋白的信号肽及N端的前9个氨基酸 的核苷酸序列和编码所述Omporf 1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\编码OmpU蛋白 的180-238位氨基酸的核苷酸片段\编码Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片 段。
所述目标蛋白是迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白。
在本发明的第二方面，提供了 一种利用上述的新型细菌表面展示系统在细菌的细 胞表面展示目标蛋白的方法，其特点是，包括以下步骤
a. 将所述新型细菌表面展示系统构建入表达载体上，获得重组表达载体；
b. 将所述重组表达载体导入宿主菌中进行表达，获得融合蛋白，所述融合蛋白 包括所述信号肽、所述跨膜锚定序列和所述目标蛋白。
所述大肠杆菌外膜脂蛋白为Lpp蛋白，所述鳗弧菌外膜蛋白为Omporf 1蛋白， OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述细菌跨膜定位转运序列是编码所述Lpp蛋白的信号肽及N端的前9个氨基酸 的核苷酸序列和编码所述Omporf 1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\编码OmpU蛋白 的180-238位氨基酸的核苦酸片段\编码Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片 段，所述宿主菌为大肠杆菌或鳗弧菌。
所述表达栽体是pUC18,所述宿主菌为大肠杆菌ToplO或鳗弧菌减毒林 MVAV6203,所述目标蛋白是迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白。
在本发明的第三方面，提供了上述新型细菌表面展示系统在活疫苗开发，抗体制 备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面的应用。
所述活疫苗是鳗弧菌多效价载体疫苗。
本发明的有益效果如下
1)本发明属于基于鳗弧菌自身元件的表面展示系统，采用大肠杆菌外膜脂蛋白Lpp 蛋白和鳗弧菌外膜蛋白Omporfl, OmpU或Omp26La的融合子为载体，利用Lpp 的N-端信号肽，Omporfl， OmpU或Omp26La的跨膜锚定序列，成功将迟钝爱 德华氏菌的EseB抗原蛋白展示到鳗弧菌减毒林MVAV6203的细胞表面，为进一步开发安全高效的鳗弧菌多效价载体疫苗打下了坚实的基础。
2)利用本发明的新型细菌表面展示系统，通过Lpp的N-端信号肽，Omporfl， OmpU 或Omp26La的跨膜锚定序列，可以将异源蛋白(特别是具有免疫保护力的抗原蛋 白)成功地展示到细胞表面，以增强和优化目标蛋白的生物学功能，增加所用 宿主菌林的生物学功能，本发明在抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂 的开发和全细胞生物催化方面等其他众多领域具有潜在的应用价值。
图l为本发明的质粒pUC18AE的载体图谱，是将pUC18载体多克隆位点中的 五coR I位点的第四位碱基通过无义点突变的方法从T变为C，从而使得五coR I位点被 去掉的产物。
图2为本发明的质粒pLorfI、 pLU和pL26La的载体图谱，是将/p; 基因片段和omporfl，ompU或omp26La基因片段overlap后的片段选用Sac I -SamH I酶切位点与图 l所示的质粒pUC18AE连接得到的产物，其中在pLorfI、 pLU和pL26La基因片段 下游引物中引入了NsiI,EcoRI和BamHI的位点。
图3是本发明的质粒pLUG和pL26LaG的载体图谱，是将目的基因她片段选用 五coR I -Sa wH I酶切位点分别与图2所示的质粒pLU或pL26La连接得到的产物。
图4是本发明的质粒pLorflB、 pLUB和pL26LaB的载体图谱，是将目标基因"e5 片段选用五coR I -SamH I酶切位点分别与图2所示的质粒pLorfl， pLU或pL26La连接 得到的产物。
图5是本发明的图3所示的重组质粒pLUG和pL26LaG的构建流程图。
图6是本发明的图4所示的重组质粒pLorf 1B的构建流程图。
图7a是分别含有质粒pLUG和pL26LaG的重组菌Top 10/pLUG和Top 10/pL26LaG 被展示到细胞表面的ELISA验证结果。OM:外膜蛋白组分；CP:胞内蛋白组分；E/LUG: 菌林ToplO/pLUG; E/L26LaG:菌抹T叩10/pL26LaG; E/G: GFP胞内表达菌抹ToplO/pG。
图7b是分别含有质粒pLUG和pL26LaG的重组菌Top 10/pLUG和T(jp 10/pL26LaG 被展示到细胞表面的Western-blot验证结果。OM:外膜蛋白组分；CP:胞内蛋白组分； E/LUG:菌抹ToplO/pLUG; E/L26LaG:菌林ToplO/pL26LaG; E/G: GFP胞内表达菌 抹ToplO/pG。
图8a是分别含有质粒pLorf 1B 、 pLUB和pL26LaB的重组菌Top 10/pLorf 1B 、
ToplO/pLUB和ToplO/pL26LaB被展示到细胞表面的ELISA验证结果。OM:外膜蛋白 组分；CP:胞内蛋白组分；E/LorflB:菌林ToplO/pLorflB; E/LUB:菌林ToplO/pLUB; E/L26LaB:菌抹ToplO/pL26LaB; E/B: EseB胞内表达菌抹ToplO/pB。
图8b是分别含有质粒pLorf!B 、 pLUB和pL26LaB的重组菌Topi0/pLorflB 、 ToplO/pLUB和ToplO/pL26LaB被展示到细胞表面的Western-blot验证结果。OM:外膜 蛋白组分；CP:胞内蛋白组分；E/LorflB:菌4朱Topl0/pLorflB; E/LUB:菌抹 ToplO/pLUB; E/L26LaB:菌抹ToplO/pL26LaB; E/B: EseB胞内表达菌抹ToplO/pB。
图9a是分别含有质粒pLorflB, pLUB和pL26LaB的重组菌AV/pLorflB、 AV/pLUB 和AV/pL26LaB被展示到细胞表面的ELISA验证结果。OM:外膜蛋白组分；CP:胞内 蛋白组分，A/LorflB:菌林AV/pLorflB; A/LUB:菌株AV/pLUB; A/L26LaB:菌林 AV/pL26LaB; A/B: EseB胞内表达菌林AV/pB。
图9b是分别含有质粒pLorflB, pLUB和pL26LaB的重组菌AV/pLorflB、 AV/pLUB 和AV/pL26LaB被展示到细胞表面的Western-blot验证结果。OM:外膜蛋白组分；CP: 胞内蛋白组分，A/LorflB:菌抹AV/pLorflB; A/LUB:菌抹AV/pLUB; A/L26LaB: 菌林AV/pL26LaB; A/B: EseB胞内表达菌林AV/pB。
具体实施例方式
本发明首先构建新型细菌表面展示系统，首先获得所需的细菌跨膜定位转运序列 以及目标蛋白基因序列，然后依次连接，获得融合序列。
所述目标蛋白基因序列是指编码所希望在细胞表面展示的蛋白的基因序列。
上述的细菌跨膜定位转运序列包括的大肠杆菌外膜脂蛋白信号肽的核苷酸序列 和鳗弧菌核苷酸序列，以及目标蛋白基因序列的获得可以采用PCR扩增、直接合成或 其他合适方式获得，可以采用酶切连接、over-lap PCR扩增或其他合适方式将上述序 列连接获得融合蛋白。
本发明的Lpp蛋白来源于大肠杆菌五"/^n'c/z/a co//. (￡. co/!'),鳗弧菌外膜蛋白 Omporf 1 、 OmpU或Omp26La来源于鳗弧菌F/6n'o awgw7/"rww MVM425 >该菌抹具有 以下特征
兼性厌氧，弧形状，极生单鞭毛，革兰氏阴性，最适生长温度25 28。C, 0%NaCl 和高于6 7。/。NaCl不生长，过氧化氢酶和氧化酶阳性，可利用柠檬酸盐，赖氨酸脱羧 酶和鸟氨酸脱羧酶阴性，葡萄糖不产气，蔗糖发酵产酸，可产淀粉酶、脂酶和酪蛋白
酶，脲酶阴性，青霉素抗性阳性，Ol血清型。
本发明所用的Lpp蛋白的信号肽和N端的前9个氨基酸如SEQ ID NO:l所示，所用 的Omporfl蛋白的分子量为7.4 kDa,其6-50位氨基酸如SEQ ID NO:2所示，OmpU蛋白 的分子量为35.4kDa,其180-238位氨基酸如SEQ ID NO:3所示，Omp26La蛋白的分子 量为28.2 kDa，其80-158位氨基酸如SEQ IDNO:4所示。
利用上述的新型细菌表面展示系统在宿主菌的细胞表面展示目标蛋白时，实现方 式可以将其置于载体上，比如质粒pUC18;所用的宿主菌可以是大肠軒菌、鳗孤菌或 其它细菌宿主，比如大肠杆菌Top 10或鳗弧菌减毒林MVAV6203 。
本发明利用大肠杆菌外膜脂蛋白和鳗弧菌外膜蛋白构建的一 系列新型细菌表面 展示系统，能将目标蛋白成功展示到细菌表面，可增强和优化目标蛋白的生物学功能， 或增加所用宿主菌抹的生物学功能。本发明拓宽了鳗弧菌减毒林的应用范围，为构建 减毒活疫苗提供了技术支持，也拓展了细菌表面系统的开发研究，为其在众多领域的 广泛应用打下了基础。
为更好的理解本发明的内容，下面以大肠杆菌外膜脂蛋白Lpp和鳗弧菌外膜蛋白 Omporfl, OmpU或Omp26La为例，作进一步说明。 实施例l 新型细菌表面展示系统的构建和目标蛋白表面展示的检测 1.新型细菌表面展示系统的构建
1.1选取要构建展示系统的各基因片段并通过PCR克隆；
1.2回收各基因片段
从所要研究的对象上回收目标基因片段，采用TIANGEN公司的胶回收试剂盒进 行回收。琼脂糖凝胶电泳结束后，EB染色，在长波紫外灯上迅速切下目的条带，装 入Eppendorf管并称取重量，加入3倍体积的溶胶液PN， 50°C水浴放置10分钟，其间不 断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；将得到的溶液加入吸附柱中离心 (12,000卬m离心30 sec),倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向 吸附柱中加入70(Hil漂洗液PW， 12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，再用500 nl漂洗液 PW12,000rpm离心30 sec,倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心2 min,尽量出去漂洗液，再将吸附柱置于室温或50。C温箱数分钟，彻底地晾干后，将 其放到一个干净地离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加不少于30 nl的洗脱緩冲液 EB buffer,室温放置2 min, 12,000 rpm离心1 min收集含目的片段的DNA溶液，电泳 检测回收DNA浓度。
1.3将pUC18栽体多克隆位点中的5②R I位点的第四位碱基通过无义点突变的方法 从T变为C。扩增4/HII-Sac I位点中的pUC18片段，并在PCR扩增的下游引物中将EcoR I位点处的第四位石威基从T变为C,再将此片段通过4/7III-Sflc I双酶切，将pUC18也通
过这两个酶切，回收纯化大片段和含有4/mi-s"ci位点的目的片段，将目的片段与切
割后的质粒用T4 DNA连接酶16'C连接过夜，CaCl2转化法转化Top10,得到质粒载体 pUC18厶E。
1.4将/; ;7基因和ow/wr/7， owpf/或om/ 26i^基因同时正向与pUC18AE质粒连接。将/; p 和0附; 0//7， ow/ C/或ow/ 26i^基因通过overlap PCR的方法连接到一起，再将这些连接 片段分别通过Sac I和5awH I酶切，将pUC18AE也通过这两个酶切，回收纯化大片段 和含有&c I -5awH I位点的目的片段，将目的片段与切割后的质粒用T4 DNA连接酶 16。C连接过夜，CaCl2转化法转化Top10，得到质粒pLorfl, pLU和pL26La,将质粒pLorfl: pLU和pL26La分别用EcoR I和5a附H I酶切，将也用这两个酶切并回收纯化后的目的 基因片段与切割后的质粒用T4 DNA连接酶16'C连接过夜，CaCl2转化法转化Top10, 得到大肠杆菌重组菌。 1.5鳗弧菌重组菌的构建
接种鳗弧菌MVAV6203于5 ml高盐LB培养液中过夜培养，再按1:100转接100 ml 高盐LB培养液，于30。C以200 rpm振荡培养至OD6oo的值为0.6时，离心收集菌体，将 菌体在冰浴中放置一段时间，使细胞尽可能接近0。C,并用272mM的蔗糖緩冲液洗涤 菌体三次，再用适量蔗糖緩冲液(1 ml)悬浮菌体，使其菌液浓度为lxl0"m1,得到 电转化感受态细胞。取100 pl感受态菌悬液于一个0.2 cm的电转化杯(Bio-Rad公司产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNAIO (Lil，混匀后在冰浴上放置IO min,用 GenepulserTM型电脉沖仪(Bio-Rad公司产品)进行电脉沖。电脉沖参数选定为脉〉中 场强V-2kV/cm,脉冲时间为3ms。电脉沖完毕后，加入800 pl LB培养液于电转杯 中，并转入1.5 ml的离心管中在30 。C200rpm恢复培养3 h后，涂布于LB琼脂抗性平板， 置于30 。C培养。氨苄为200 pg/ml。 2目标蛋白表面展示的^r测
2.1将上述得到的鳗弧菌重组菌进行外膜蛋白组分的抽提
菌体蛋白由以下方法制备将含有质粒的大肠杆菌ToplO菌抹接种在含lOO 吗/ml氨卡青霉素的LB低盐液体培养基，200 rpm 37 。C培养过夜，作为一级种，第二 天将一级种按1:100( v/v )接种于含有50 ml工作浓度的LB低盐(Amp )培养基的250 ml 三角瓶中，作为二级种，37 °C 200卬m摇床培养至00600=0.6，加入诱导剂IPTG至终 浓度0.5 mmo1/1，于37 。C诱导表达12 h，收获菌体。对含有质粒的鳗弧菌MVAV6203 菌林接种在含200叫/ml氨苄青霉素的LB高盐液体培养基，200 rpm 30 。C培养过夜， 作为一级种，第二天将一级种按I:IOO( v/v)接种于含有50 ml工作浓度的LB高盐(Amp) 培养基的250 ml三角瓶中，作为二级种，30°C 200rpm摇床培养24h,收获菌体。对 收获的菌体IOOOO g离心2 min, PBS洗涤三次以后，重悬在1.5 ml Tris-HCl-NaCl (50 mM， pH 8.0, containing 0.3% NaCl)緩冲液中，将此重悬液在冰浴中超声破菌5 min至菌 体完全破碎，将得到的菌体裂解液在4 。C 10000 g离心5 min以去除未裂解的细胞和细 胞碎片。为得到全部的膜蛋白，将上清液在4 。C 20000 g超速离心l h( Sigma， Osterode, Germany),则得到的上清为可溶的胞内蛋白成分，沉淀为全部的膜蛋白。为了得到 外膜成分，将沉淀重悬在0.4mlHEPES(10mM, pH7.4)緩冲液中，再和0.4 ml含有20/0 SLS的HEPES緩冲液(IO mM， pH 7.4)混匀以溶解内膜，将此混合液在室温下放置30 min后再在4 。C 20000 g超速离心l h，从而得到外膜蛋白颗粒，上清中为内膜蛋白，再 重复一次外膜成分的提取步骤将得到较纯的外膜蛋白。
2.2 ELIS A检测外膜、胞内蛋白组分
胞内蛋白组分和外膜蛋白组分都先稀释到相同的OD ( OD280 = 1.0 )。然后在每个 ELISA板孔中加入50 pl各组分溶液，4 。C包被过夜，次日，弃去孔内溶液，用PBST 緩冲液洗3次，每孔加入200 nl含有3。/。BSA的PBST于37。C封闭l h,后弃去孔内溶液， 用PBST緩冲液洗3次，加入稀释到适当倍数的兔抗一抗，37。C孵育1.5 h，用PBST缓 冲液洗3次以后细胞抗体复合物再与1:5000 (v/v)稀释的辣根过氧化氢酶结合的羊抗 兔二抗(Jackson公司产品)37。C孵育l h, PBST洗3次以后，每孔加入IOO pl单组分 可溶型TMB底物显色液(天根公司产品)37 。C作用10-30 min,每孔再加入IOO pl 1M H2S04终止反应，每孔的吸光值用酶标仪(Bio-Red公司产品)于450nm的波长下检测。 其中以胞内表达该蛋白的菌为阴性对照。
2.3 SDS-PAGE凝胶的制备
取30%凝胶母液(29.2%丙烯酰胺，0.8%曱叉双丙烯酰胺)2ml， 1.5 M Tris-HCl， pH 8.8, 1.3 ml， 10% SDS 50 pl，超纯水1.6 ml， 10%过石危酸铵50 pi, TEMED 2 pl，混 匀后注入垂直板电泳制胶器中，加封一层水，于室温下聚合l h左右即为12。/。的分离 胶。倾去上层的水，取30%凝胶母液330 ^1, lMTris-HCl, pH 6.8， 250 10 % SDS 20^1,超纯水1.4ml， 10%过硫酸铵20 TEMED 2 混匀后注入分离胶上层，插 入电泳梳板，于室温下聚合1 h。 2.4 Western-blot检测各蛋白组分
将稀释到相同的OD( OD280 = 1.0 )的胞内和外膜蛋白组分取等体积和上样緩冲液 (10% SDS, 10% 2-硫醇，pH6.8 0.3MTris-HCl， 0.05%溴苯酚蓝，50%甘油)混 匀，在12%的SDS-PAGE胶中进行电泳，之后将切除浓缩胶的分离胶用电转仪(Bio-Red 公司产品)在90V电压下的电转緩冲液(25mmol/lTris-HCl， 192 mmol/l甘氨酸，20 %曱醇)中电转移3 h到PVDF膜上，将电转好的膜取出，在37 °C PBS-T-BSA溶液(含 0.05%土温和1% BSA的PBS緩沖液)中封闭l h之后进行免疫^r测将PVDF膜在37 。C与稀释到适当倍数的兔抗一抗孵育1.5 h,然后用l: 5000 ( v/v)稀释的辣根过氧化 氬酶结合的羊抗兔二抗标记，37 。C孵育lh,用PBS-T溶液洗过之后，加入100pl单组 分沉淀型TMB底物显色液，37 。C作用15 min进行显色，再用1 M 112804终止反应，观 察结果。其中以胞内表达该蛋白的菌为阴性对照。
实施例2绿色荧光蛋白的新型细菌表面展示系统的构建、展示与检测
根据所需要展示的目标蛋白和其它所需的核苷酸序列设计引物，并在引物两端引 入合适的酶切位点。以质粒pUC18为模板，引物pUCF和pUCR扩增得到pCU18质粒上 的一段序列，并在下游引物中将&oR I位点的第四位碱基进行突变，利用两端的4/ 111 和&cl位点将它连到经过同样酶切的pCU18片段中，得到突变了五coRl位点的 pCU18厶E (图l );以鳗弧菌MVM425基因组为模板，利用引物ompUF和ompUR扩增 得到所需的OmpU蛋白的一^f殳编码序列，利用引物omp26LaF和omp26LaR扩增得到所 需要的Omp26La蛋白的一段编码序列，以pTX101质粒(Francisco J.A., Earhart C.F., Georgiou G. 1992. Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Esc/^〃W /a co//. Proc Natl Acad Sci U S A 89(7):2713-7 )为模板，lppF和lppR为引物扩 增得到所需要的一段/; p序列，再通过overlap PCR的方法将/p; 片段和omp[/片段或 ow; 26Za片段融合到一起，Sac I和BawH I位点被用来将这两个融合片段分别连到 pCU18AE的相应位点内，得到重组质粒pLU和pL26La (图2);以mTn5gM"-; 她12 质粒为模板，gfpF和gfpR为引物扩增得到gfp序列，利用五coR I和5awH I位点，将它 连到质粒pLU或pL26La上，得到重组表达质粒pLUG和pL26LaG (图3 )。将pLUG和 pI^6LaG分别转入ToplO中。通过对表达的ToplO/pLUG和ToplO/pLS6LaG菌抽提外膜 蛋白组分并分别做ELISA (图7a)和Western-blot (图7b)验证知GFP蛋白被成功展示
到外膜上。证明了系统Lpp-0mpU和L卯-0mpS6La都可以在大肠杆菌宿主中将外源胞 内蛋白展示到外膜上，在抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂的发展和全细胞 生物催化的发展等领域有潜在的应用价值。
设计合成的引物
pUCF: 5 ， -CCACATGTTCTTTCCTGCGT-3 ，；
pUCR: 5,-TCCGAGCTCGAGTTCGTAATCATGGTC-3';
反应条件为94 。C 30 s, 55 。C 30 s, 72 。C 55 s,共30个循环，72 。C 7 min。
lppF: 5'-GGTGAGCTCAATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGG-3，；
lppR: 5，-CGGGGTACCCCGCTGATCAATTTTAGCGTTG-3，；
反应条件为94。C30s, 55 。C 30 s, 72 。C 20 s,共30个循环，72 。C 7 min。
ompUF: 5，- CAGCGGGGTACCCCGAATGCAGATGGCTACTCT國3，；
AAGTACC陽3，；
反应条件为94。C30s， 50。C30s， 72 。C 20 s，共30个循环，72 。C 7 min。 omp26LaF: 5' -C AGCGGGGT ACCCCGTTCTTTGGT A AC AC AGG-3'; omp26LaR: 5，-CGGGATCCAGCCATGAATTCCGGATGCATGACATGGAAGTA GTTAACG-3，；
反应条件为94 。C 30 s, 50 。C 30 s, 72 。C 25 s,共30个循环，72 。C 7 min。 gfpF: 5，-CCGGAATTCATGGCTAGCAAAGGAG-3 ，； gfpR: 5'國CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCATGCCATG-3,; 反应条件为94。C30s, 51。C30s， 72 。C 55 s,共30个循环，72 。C 7 min。
实施例3EseB抗原蛋白的新型细菌表面展示系统的构建、展示与检测
迟钝爱德华氏菌是一种在淡水鱼类和海洋鱼类中可以引起出血性败血病的病原 菌，它在水环境中有一个很广泛的感染宿主范围，而且对于许多动物甚至人都有一定 的感染性。EseB蛋白来自于致病性的迟钝爱德华氏菌，为细菌III型分泌系统中的膜元 件蛋白，有报道称EseB蛋白的缺失可以使迟钝爱德华氏菌的毒性降低，证明其与细菌 致病性相关(Srinivasa Rao P. S.， Yamada Y., Tan Y.P., Leung K.Y. 2004. Use of proteomics to identify novel virulence determinants that are required for五d而油/e〃fl pathogenesis. Mol Microbiol 53 (2), 573-586 )。
根据所需要展示的目标蛋白和其它所需的核苷酸序列设计引物，并在引物两端引 入合适的酶切位点。以鳗弧菌MVM425基因组为模板，利用引物omporf 1 F和omporf 1R 扩增得到所需要的Omporfl蛋白的一段编码序列，利用实施例2方法得到所需的Lpp蛋 白的一段编码序列，再通过overlap PCR的方法将&; 片段和ow/ w/7片段融合到一起， Sac I和5awH I位点被用来将此融合片段连到pCU18AE的相应位点内，得到重組质粒 pLorfl(图2);根据实施例l的方法获得重组质粒pLU和pL26La;以克隆有迟钝爱德 华氏菌EseB蛋白编码基因eseB的质粒pPRoD为模板，利用引物eseBF和eseBR进行PCR 扩增w^的基因，获得符合预期大小(600 bp)的特异性扩增产物，回收该产物，利 用其两端的五coR I和5flwH I位点直接分别克隆到也经过相同酶切的pLorfl， pLU或 pL26La质粒上，得到含有融合基因// /Vo/n; (^/7/e^5， // / /owp[7/ew5或 /p/7/ow;^6丄a/e^B的重组质粒pLorflB, pLUB或pL26LaB (如图4所示)。将pLorflB, pLUB或pL26LaB分另'J转入Top10和鳗弧菌MVAV6203中。通过对表达的 ToplO/pLorflB , Topl0/pLUB ， ToplO/pL26LaB以及AV/pLorflB , AV/pLUB , AV/pL26LaB菌抽提外膜蛋白组分并分别做ELISA (图8a，图9a)和Western-blot (图 8b,图9b)验证知EseB蛋白不管是在大肠杆菌T叩10宿主中还是鳗弧菌MVAV6203宿 主中都被成功展示到外膜上，证明了Lpp-Omporfl系统在大肠杆菌或者鳗弧菌宿主中 都可以将外源蛋白展示到外膜上，同时证明了Lpp-OmpU和Lpp-Omp26La系统还可以 在鳗弧菌宿主中将外源胞内蛋白展示到外膜上，本研究将EseB作为一个潜在的具有保 护力的抗原蛋白，将其与Lpp-Omporf 1/OmpU/Omp26La展示系统相融合，并展示于鳗 弧菌减毒林的细胞表面，有望研制并开发出同时针对鳗弧菌和迟钝爰德华氏菌感染的 的多效价载体活疫苗，为构建鳗弧菌多效价减毒活疫苗打下了基础。
设计合成的引物
omporflF: 5'-CAGCGGGGTACCCCGATCGCACTATTAGCATCTT-3，；
omporflR: 5，國CGGGATCCAGCCATGAATTCCGGATGCAT TGCCGTTACTG TACCTACT-3，；
反应条件为94。C30s, 51。C30s, 72 。C 20 s,共30个循环，72 。C 7 min。
eseBF: 5 ，-CCGGAATTCATGACTGTCAATAC-3 ，；
eseBR: 5，-CGGGATCCTTAGCGGATATTCTGGG-3';
反应条件为94 。C 30 s, 57 。C 30 s， 72 。C 45 s,共30个循环，72 。C 7 min。
所以，利用Lpp-Omporf 1 、 Lpp-OmpU或Lpp-Omp26La的融合子作为载体，可以 将目标蛋白定位表达于细菌表面，既可增强和优化目标蛋白的生物学功能，也可增加 所用宿主菌抹的生物学功能，在活疫苗发展，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸 附剂的发展和全细胞生物催化的发展等众多领域都具有潜在的应用价值。
综上所述，本发明的新型细菌表面展示系统能在细菌细胞表面成功展示目标蛋 白，可用于活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生 物催化方面，特别用于在鳗弧菌减毒林的基础上构建安全高效的鳗弧菌多效价载体疫 苗。
需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每 一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例 及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对 本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发
明的范围内。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 新型细菌表面展示系统、方法及应用
<160> 4
<210> 1 <211> 42 <212> PRT
<213> 大肠杆菌(五sc/zer/c/n-fl co//) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(33)
<223> 外膜脂蛋白Lpp蛋白的信号肽和N端前9个氨基酸序列 <400> 1
Met Thr Met lie Thr Asn Ser Ser Ser Met Lys Ala Thr Lys Leu Val 15 10 15
Leu Gly Ala Val lie Leu Gly Ser Thr Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser 20 25 30
Asn Ala Lys lie Asp Gin Arg Gly Thr Pro 35 40
<210> 2 <211> 45 <212> PRT
<213> 綬弧菌(附Wo awgwz'〃ar扁) <220>
<221> TRANSMEM <222> (1)..(45)
<223> 外膜蛋白Omporfl蛋白的6-50位氨基酸序列 <400> 2
lie Ala Leu Leu Ala Ser Phe Ala Phe Gly Gly Val Ala Met Ala Ala 15 10 15
Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Ser Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly 20 25 30
Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Val Gly Thr Val Thr Ala 35 40 45
<210> 3
<211> 59
<212〉 PRT
<213> 縵弧菌(附〃'o朋gw/〃07"謹) <220>
<221> TRANSMEM
<222> (1)..(59)
<223> 外膜蛋白OmpU蛋白的180-238位氨基酸序列
<400> 3
Asn Ala Asp Gly Tyr 1 5
Gly Val Lys Leu Gly 20
Ala Ser Ser Asp Gin 35
Phe Tyr Phe Ala Gly 50
<210> 4
<211> 79
<212> PRT
<213> 缓弧菌(附"'o朋gw!'〃ar画)
<220>
<221> TRANSMEM <222> (1)..(79)
<223> 外膜蛋白Omp26La蛋白的80-158位氨基酸序列 <400> 4
Phe Phe Gly Asn Thr Gly Asp Val Val Asn Leu Gly Thr Tyr Uu Thr 15 10 15
Gly Ser Gly Val Thr Tyr Asp Gin Asp Ser Ala Asn Ser Val Lys Gly 20 25 30
Ser Leu Ser Ala lie Tyr Ala lie Gly Asp Thr
10 15
Ala Gly Tyr Ala Asp Gin Asp Thr Ala Ala Asn 25 30
Tyr Met Leu Ala Ala Ser Tyr Ala lie Ser Asp 40 45
Thr Phe Val Asp Gly Gin 55
Met Asp Lys Arg Lys Ala Thr lie Asp Leu Gly Leu Asn Ala Asp lie 35 40 45
Ala Leu Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Tyr Phe Gin His Asp lie Leu 50 55 60
Asn Glu Asn Lys Gly Tyr Lys Thr Gly Val Asn Tyr Phe His Val 65 70 7权利要求
1.一种新型细菌表面展示系统，包括细菌跨膜定位转运序列和编码目标蛋白的基因序列，所述细菌跨膜定位转运序列包括大肠杆菌外膜脂蛋白信号肽的核苷酸序列，其特征在于，所述细菌跨膜定位转运序列还包括鳗弧菌核苷酸序列，所述鳗弧菌核苷酸序列连接所述大肠杆菌外膜脂蛋白信号肽的核苷酸序列和所述编码目标蛋白的基因序列，所述鳗弧菌核苷酸序列编码的蛋白包括鳗弧菌外膜蛋白的跨膜锚定序列。
2. 如权利要求l所述的新型细菌表面展示系统，其特征在于，所述大肠杆菌外膜脂蛋 白为Lpp蛋白，所述鳗弧菌外膜蛋白为Omporfl蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
3. 如权利要求2所述的新型细菌表面展示系统，其特征在于，所述细菌跨膜定位转运 序列是编码所述Lpp蛋白的信号肽及N端的前9个氨基酸的核苷酸序列和编码所述 Omporfl蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段、编码OmpU蛋白的180-238位氨基酸的 核苷酸片段X编码Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段。
4. 如权利要求3所述的新型细菌表面展示系统，其特征在于，所述目标蛋白是迟钝爱 德华氏菌的EseB抗原蛋白。
5. —种利用如权利要求l所述的新型细菌表面展示系统在细菌的细胞表面展示目标 蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤a. 将所述新型细菌表面展示系统构建入表达载体上，获得重组表达载体；b. 将所述重组表达载体导入宿主菌中进行表达，获得融合蛋白，所述融合蛋白 包括所述信号肽、所述跨膜锚定序列和所述目标蛋白。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌外膜脂蛋白为Lpp蛋白，所 述鳗弧菌外膜蛋白为Omporf 1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细菌跨膜定位转运序列是编码所述Lpp 蛋白的信号肽及N端的前9个氨基酸的核苷酸序列和编码所述Omporf 1蛋白的6-50 位氨基酸的核苷酸片段\编码OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\编码 Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段，所述宿主菌为大肠杆菌或鳗弧菌。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pUC18,所述宿主菌为大 肠杆菌ToplO或鳗弧菌减毒抹MVAV6203,所述目标蛋白是迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白。
9. 如权利要求l所述的新型细菌表面展示系统在活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛 选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面的应用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述活疫苗是鳗弧菌多效价载体疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种新型细菌表面展示系统，包括细菌跨膜定位转运序列和编码目标蛋白的基因序列，所述细菌跨膜定位转运序列包括大肠杆菌外膜脂蛋白信号肽的核苷酸序列，还包括鳗弧菌核苷酸序列，其连接大肠杆菌外膜脂蛋白信号肽的核苷酸序列和编码目标蛋白的基因序列，其编码的蛋白包括鳗弧菌外膜蛋白的跨膜锚定序列，大肠杆菌外膜脂蛋白为Lpp蛋白，鳗弧菌外膜蛋白为Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白，本发明的新型细菌表面展示系统能在细胞表面成功展示目标蛋白，可用于活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面，特别用于在鳗弧菌减毒株的基础上构建安全高效的鳗弧菌多效价载体疫苗。
文档编号C12N15/09GK101195823SQ20071017063
公开日2008年6月11日 申请日期2007年11月20日 优先权日2007年11月20日
发明者琴 刘, 张元兴, 朝 杨, 王启要 申请人:华东理工大学