专利名称：采用转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种采用转化鲨烯合成酶基 因ls提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方法。
背景技术：
银杏(Ginkgo biloba L.)是侏罗纪的孑遗植物，基本保持了l. 5亿年前的生态特 征，因而成为一科一属一种的特殊植物，被达尔文称为"活化石"。银杏标准提取 物是广泛用于治疗早期阿尔茨海默病、血管性痴呆等疾病的植物药。银杏叶提取物 中具有药理作用和治疗效力成分主要为黄酮类和内酯类化合物，后者包括银杏内酯
和白果内酯。目前从银杏中分离得到的二内酯有5个，即银杏内酯A、 B、 C、 J、 M。 银杏内酯具有独特的二十碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和六个五元环，包括一个螺 [4， 4]壬垸， 一个四氢呋喃环和三个内酯环，是一类罕见的天然化合物，至今尚 未发现存在于其他植物中。银杏内酯是在银杏中含量很低的一类组分， 一般在千分 之几左右，且提取分离手续复杂。由于银杏内酯的分子立体结构复杂，人工合成途 径的技术难度很大，因此，它们主要是从天然银杏植株中提取，但天然植物体内含 量极其微少，使得银杏内酯来源困难。银杏中内酯的含量还受到植株发育阶段、细 胞分区、组织分化和环境的影响，仅从天然植物中提取银杏内酯远远不能满足市场 需求。愈伤组织和细胞培养系统为生产银杏内酯带来了希望。
经对现有技术的文献检索发现，国内外科学家尝试了采用各种方法，包括优化 培养条件(Boonkaew， Boonkaew T. In vitro culture of Ginkgo biloba L， PhD Thesis, 2001， UMI 3031078， ETH， Ann Arber， USA)、加入前体物质和使用化学或 生物诱导子(戴均贵，朱蔚华，吴蕴祺，胡秋，张大勇.前体及真菌诱导子对银杏悬浮 培养细胞产生银杏内酯B的影响.药学学报，2000， 35:151-155)来提高银杏组织培 养物中银杏内酯的含量。如Boonkaew对银杏组织培养的培养基条件进行了研究，比
较了不同的激素配比和培养基类型，选择了MS培养基和l. 0mg/La -萘乙酸和l. Omg/L 激动素作为最优培养条件，发现使用O. 8%植物凝胶作为凝结剂培养愈伤组织能提高 根衍生愈伤中的叶绿素、银杏内酯和白果内酯，根衍生的愈伤组织比叶衍生的愈伤 组织中的含量高，叶衍生愈伤中总银杏内酯的含量为25吗/g干重，根衍生愈伤中为 34^g/g干重，而使用其他凝结剂如琼脂等几乎检测不到银杏内酯的存在。
虽然尝试了多种办法来提高银杏愈伤组织和细胞培养物中的银杏内酯含量，但 到目前为止，通过愈伤组织和细胞培养系统来产生银杏内酯，其含量依然太低不具 商业前景。代谢工程为改变植物细胞或愈伤组织的组成成份和增加植物细胞或愈伤 组织银杏内酯产量提供了一条诱人的方法。为了更有效地生产银杏内酯，开展银杏 内酯生物合成途径及其催化酶基因的表达与调控研究，以及开展银杏内酯代谢工程 研究将是提高银杏内酯含量并最终解决银杏内酯产品稀缺的有效方法。
鲨烯合成酶(lev叩imaradiene synthase, LS)是银杏内酯生物合成途径中的关 键酶，是银杏内酯代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，将鲨烯合成酶编码基 因ls转化银杏，打破银杏内酯生物合成限速瓶颈，获得银杏内酯高产的银杏愈伤组 织。目前尚未发现转化ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用转ls基因提高银杏愈 伤组织内酯含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分 子检测、内酯提取及含量测定、半定量RT-PCR分析用于本发明，建立了提高银杏愈 伤组织内酯含量的方法，为银杏愈伤组织大规模工厂化生产奠定坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明从银杏中克隆ls基因，构建含ls基
因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ls基因导入银杏细胞并再生出愈伤组织；
PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因ls的整合和表达情况，高效液相色谱-蒸发光 散射检测器(HPLC-ELSD)测定银杏愈伤组织中银杏内酯含量，筛选银杏内酯含量提 高的转基因银杏愈伤组织。 本发明包括如下具体步骤
(1) 采用基因克隆方法获得银杏关键酶基因1S;
(2) 把ls基因可操作性地连于表达调控序列，形成含ls基因的植物表达载体；
(3) 将含ls基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化银杏的含ls基 因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
(4) 利用所构建的根癌农杆菌菌株转化银杏细胞，获得经PCR检测的转基因愈伤 组织；
(5) 半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中银杏内酯生物合成相关基因的表达；
(6) 对获得的转基因愈伤组织中银杏内酯含量进行HPLC-ELSD测定，筛选银杏内 酯含量显著提高的转基因银杏愈伤组织。
所述的经PCR检测的转基因愈伤组织是指，分别设计合成ls基因的检测引物，进 行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性组织即为转基因银杏愈伤组织。
所述的对获得的转基因愈伤组织中银杏内酯含量进行HPLC-ELSD测定，方法为 色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈甲醇水，乙腈甲醇水的体积比为 8:69:23，柱温3(TC,流速l. 0 mL/min，进样量2C^L，蒸发光散射检测器漂移管温 度为5(TC，放大系数(gain)为9，空气气压4. 5PSI。银杏内酯含量根据峰面积由标准 品曲线换算。
所述的半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中银杏内酯生物合成相关基因的表达， 方法为设计合成ls基因和看家基因18S rRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，用 相对定量法分析基因相对表达量。
与现有技术相比，本发明的采用转ls基因提高银杏愈伤组织内酯含量的方法， 采用基因工程方法，将关键酶基因ls导入银杏愈伤组织中，获得了银杏内酯含量显 著提高的银杏愈伤组织，其中，转基因愈伤组织中银杏内酯的含量最高是非转化对 照愈伤组织的4. 8倍，对解决银杏内酯药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需 要具有重要意义。
所述的根癌农杆菌的公开方式为市场有公开出售的生物材料，可以从多家公 司如澳大利亚CAMBIA公司(CAMBIA， GPO Box 3200, Canberra, ACT 2601， Australia。 商品名称根癌农杆菌菌株如EHA105，商品编号Gambar 1)购得。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进 行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下
述的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l
银杏ls基因的克隆1. 组织分离
将银杏种子用75。/。乙醇浸泡lmin，再用2% NaC10浸泡10 min，无菌水冲洗3-4次， 用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS (Murashige and Skoog， 1962)固 体培养基中，25°C、 12h/12h光照培养，即可获得银杏无菌苗，待苗长至5cm左右后， 切取叶片和茎段用于RNA提取。
2. RNA的分离
称取0.5g所述的银杏无菌试管苗，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有 1 mL CTAB缓冲液[3% CTAB (W/V) ， 3% PVP (W/V) (Mw 40000), 25 mM EDTA, 2.0 M NaCl， 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 g/L spermidine和O. 1% DEPC (V/V)]的 1.5 mL E卯endorf管中，充分振荡后，于室温下放置5 min，力卩20(VL氯仿，用力振 荡15 sec，室温放置2-3 min后，于4。C、 12， 000g离心15 min;将上清液(约60(VL) 吸入干净的l. 5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置 10 min后，于4。C、 12， 000g离心10 min;弃上清，力Q1 mL 75%乙醇清洗，振荡后， 于4。C、 7，500g离心5 min;室温干燥15-20 min后溶于适量(5(VL) RNAase-free水 中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3. 基因克隆
将所获的银杏总RNA通过反转录酶XL (AMV)反转录获得第一链cDNA,根据所述银 杏ls基因的编码序列(序列表中的序列l)，设计扩增出完整编码框的上下游引物， 并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以 便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测 定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所 克隆的序列与GenBank中所报道的银杏ls基因的编码序列(序列表中的序列l) 一致。
本实施例采用基因克隆方法从银杏中获得序列正确的银杏内酯生物合成关键酶 基因ls，为通过转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量提供了一个重要关键酶 基因。
实施例2
含ls基因的植物表达载体pCAMBIA1304: :p35S-ls-nos的构建
以pCAMBIA1304为表达载体，用实施例l中ls基因替换其上的gfp+gus基因。具体 地，Bgl II/BstEII双酶切pMDT-simple + ls和pCAMBIA1304，回收ls和pCAMBIA1304 大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。结果表明，ls 基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304中，从而获得含ls基因的植物表达载 体pCAMBIA1304::p35S-ls-nos。
本实施例将银杏内酯生物合成途径关键酶基因ls可操作性地连于表达调控序 列，形成含ls基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高银 杏愈伤组织中银杏内酯的含量。
实施例3
含ls基因植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例2中含ls基因的植物表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公 开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并 进行PCR验证。具体地，首先制备感受态根癌农杆菌(如EHA105):摇根癌农杆菌至 菌液O. D6。。=0. 5，将菌液冰浴30min后，取菌于l. 5ml Eppendorf管中，于4。C 5000rpm 离心5rain，去上清；用抽滤灭菌的O. 1M CaCl2(预冷)400nl悬浮菌体(用移液枪轻轻 打匀)后于冰上放置30min， 5000rpm离心5min，去上清，用lOOpl预冷的O. 1M CaCl2 悬浮菌体后于4'C保存10h备用。然后，采用以下方法获得含ls基因的植物表达载体
(pCAMBIA1304: :p35S-ls-nos)的根癌农杆菌工程菌株取一管100nl的感受态， 加10nl质粒DNA (pCAMBIA1304: :p35S-ls-nos)，轻轻混匀后，于冰上放置5min和液 氮中放置8min后，放入37。C水浴中热激5min;加入800nl无抗生素的YEB液体培养 基，轻轻混匀；振荡培养活化(28。C， 200rpm)4h后，于室温离心(4000 rpm) 10min,
去上清，余下20(V1菌液重悬菌体混匀；将混匀的200)Lll重悬活化菌液均匀涂布到加
相应抗生素[卡那霉素(Kan) 100吗/ml+链霉素(Str) 25ng/ml+利福平(Rif) 40ng/ml]的YEB固体培养基平板上，于28'C培养箱中倒置培养2天后，挑选抗性单菌落在含相 应抗生素的YEB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度后做目的基因ls的PCR检测。 结果表明，含ls基因植物表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。 实施例4
1. 根癌农杆菌介导ls基因转化银杏
1.1. 外植体的预培养
剥去白果的中种皮(硬壳)，在超净台内用75X(V/V)酒精消毒1分钟，再用15 X(V/V)次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，剥开胚乳用镊子取出幼胚置于预培养基 (MS+3。/。蔗糖+4g/L植物凝胶)上，25'C暗培养1 d。
1.2. 农杆菌与外植体的共培养
挑取含所述的含ls基因植物表达载体的根癌农杆菌工程菌单菌落于培养基[YEB 液体培养基+2(VM乙酰丁香酮+10mM MES(pH=5. 8)+卡那霉素(Kan) 100pg/ml+利福平 (Rif)4(^g/ml]中在28。C摇床上180rpm摇过夜，第二天当菌液浓度达到0D60(M). 5 时，5000rpm离心10分钟后倒掉上层培养液，重悬沉淀在底部的农杆菌，在28'C摇床 (180rpm)上活化30分钟，把在预培养24h的银杏幼胚从根部剪成两半，把每一半再 横剪成两半，把剪好的外植体放进上述菌液中侵染15分钟，把菌液倒掉，用无菌吸 水纸洗干胚上多余的菌液，置于共培养培养基(MS + 3。/。蔗糖+琼脂10g/L)上于25'C 暗培养3天，使农杆菌充分侵染银杏幼胚。以浸泡在不带有根癌农杆菌的幼胚外植体 为对照。
1.3. 愈伤组织的诱导和继代培养
共培养后，把胚外植体转接到恢复培养基(MS +蔗糖3X +1. Omg/L NAA+0. 2mg/L 6-BA+4g/L植物凝胶+ 250mg/L羧苄霉素)上进行愈伤组织诱导和脱菌培养，于25 。C暗培养4周后转接到筛选培养基(MS +蔗糖3X + 1.0mg/L NAA+0. 2mg/L 6-BA+ 4g/L植物凝胶+250mg/L羧苄霉素+ 10mg/L潮霉素)上进行抗性愈伤组织的筛选培 养，将起源于不同细胞的每个愈伤组织作为一个无性系，接种于继代培养基(MS + 蔗糖3% + 1. Omg/L NAA+0. 2mg/L 6-BA+4g/L植物凝胶+ 10mg/L潮霉素)上继代筛 选，每三周继代培养一次。
2. 转基因银杏愈伤组织的PCR检测 首先采用常规CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium bromide,十六烷基三甲基溴 化胺)方法提取转基因银杏潮霉素抗性愈伤组织的DNA，然后，根据目的基因所在 表达盒pCAMBIA1304::p35S-ls-nos序列p35s和ls分别设计正向弓|物T35SF和反向引 物TLSR，用PCR方法对转基因银杏抗性愈伤组织中的目的基因ls进行检测。PCR反应 条件为94。C变性5min—30循环(94。C 45sec—58°C 45sec—72°C lmin)—72°C 6min。结果表明，利用所设计的PCR特异引物扩增转基因银杏愈伤组织DNA，能扩增 出与预期结果一致的特异目的片段(0. 5kb)，而以非转化银杏基因组DNA为模板时， 没有扩增出任何片段。说明ls基因己经整合到银杏基因组中。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化银杏的含ls基 因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化银杏细胞， 获得经PCR检测的转基因愈伤组织。转基因银杏愈伤组织的获得为筛选获得银杏内酯 含量提高的银杏愈伤组织提供了直接素材。
实施例5
半定量RT-PCR检测转基因银杏愈伤组织中ls基因的表达
1. 引物的设计和合成
设计合成ls基因和看家基因18SrRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，PCR产物 凝胶电泳后与对照愈伤组织对比其表达量。
2. RNA的提取
参照实施例l中所述方法，从银杏愈伤组织中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因 组DNA，用反转录酶XL (AMV)进行第一链cDNA的合成，再以第一链cDNA为模板进行半 定量RT-PCR。
3. 半定量RT-PCR检测看家基因18S rRNA基因的表达
为调整各样品间在RNA抽提和逆转录过程中反应效率的差异，检测目的基因表达 量的同时需检测看家基因18S rRNA基因的表达。
4. 半定量RT-PCR检测转基因银杏愈伤组织中ls基因的表达 用非转化普通愈伤作对照，用半定量RT-PCR测定ls基因的表达量。半定量RT-PCR
反应条件为50°C 30min—94°C 2min—30个循环(94°C 45sec—58°C 30sec—72°C 30sec)。结果表明，在相同的总RNA量和18srRNA基因表达水平下，相比未转化的愈
伤组织，大多数转基因愈伤组织中的ls基因转录水平有明显升高，表明目的基因ls 的转入显著提高了银杏愈伤中的ls的表达量。 实施例6
利用HPLC-ELSD测定转基因银杏愈伤组织中银杏内酯含量
1. HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC:采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱 (SymraetryShieldTM C18， 5 )nm， 250口4. 6 mm, Waters),流动相为乙腈甲醇水， 乙腈甲醇水的体积比为8 : 69 : 23，柱温30。C，流速l. 0 mL/min，进样量20 ^L， 灵敏度(AUFS=1.0)。
ELSD:采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度50。C,空 气气压4. 5PSI，放大系数(gain)为9。
. 分别精密称取银杏内酯A、 B、 C标准品(Sigma公司)20 mg用甲醇溶解并定溶于 20 ml，得到浓度为l mg/mL的银杏内酯A、 B、 C标准品溶液，保存于-20'C备用。
本发明中流动相为乙腈甲醇水，比例为8 : 69 : 23时，银杏内酯a、 b、 c的
保留时间分别为15. 757 min、 17. 642 min、 7. 735 min，峰型良好，可保证三种内酯 的良好分离。
2. 标准曲线的制作
将所述标准品溶液分别稀释l、 2、 5、 IO倍，在相应色谱条件下进样，记录图谱 及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X, mg/L)进行回归分析。银杏内酯A、 B、 C对照品的log-log线性回归方程分别为
YGA=1. 38e+000X+8. 68e_001r=0. 9993
YGB=3. 67e-001X+3. 44e+000r=0. 9991
YGC=1. 18e+000X+l. 18e+000r=0.9995
3. 样品的制备和银杏内酯含量的测定
将愈伤组织置于烘箱中6(TC干燥至恒重。每次称取研碎的愈伤组织0. 5 g进行 定量分析。用20ml甲醇超声l个小时后，布氏漏斗过滤，提取液在旋转蒸发仪中蒸干， 再用lml体积比为40:60的甲醇水复溶，上100mg的ds小柱(SUPELCO, USA)， 依 次2ml水、0.5ml体积比为20:80的甲醇水冲洗，再用0.4ml体积比为60:40的甲
醇水洗脱后收集，过0.45pm微孔滤膜，取20nl上样，用HPLC-ELSD法测量银杏内 酯的含量。
分别吸取所述对照品溶液和供试样品溶液各2(VL，注入高效液相色谱仪，记录 各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品中银杏内酯含量。
在本发明中转ls基因显著提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量。结果表明转基因 愈伤组织中总银杏内酯含量在不同程度上比对照有所增加，转基因愈伤组织和非转 基因对照愈伤组织中均检测不到银杏内酯A、 B，是由于愈伤中这两种内酯含量太低， 达不到最低检测范围；而转ls基因的转基因愈伤组织中银杏内酯C的平均含量为 0. 136mg/gDW，而对照中为O. 038mg/gDW，其中银杏内酯C含量最高的转基因愈伤组织 系L1中的银杏内酯C含量达到O. 182mg/gDW，其总银杏内酯和银杏内酯C含量是非转基 因对照的4. 8倍。
本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因银杏愈伤组织中银杏内酯含量。采用转 ls基因的代谢工程策略获得了银杏内酯含量提高的银杏愈伤组织，为规模化生产银 杏内酯并最终解决内酯匮乏提供了一种方法。
本发明涉及的序列表-〈110〉上海交通大学
〈120>转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方法
〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3.4
〈210〉 1 〈211〉 2622 <212〉 ■
〈213〉 银杏(Ginkgo biloba) 〈400〉 1
atggctgggg tgctctttgc犯atctgcct ttccggcaat ccactaatat tcttattcct gcacagcact gcgtccgttc tcacttaagg tcagctgcag agactcgtcc agatcagctt aatgcggatt atcatccagc tgtctggaag aattcccacg cgacatcgaa atcaagcgtc ttggtgaagg aaatccagtg ca/tgtttcag gcatatgata cagcttgggt ggcaagaatt tttccccaaa cgcttcaatg gattctgaac gagtgcattt ttctggcgta tgacagagtt aaaatatgga ataagggcga cattcaagtg atgg犯g犯a tgaaggacga agctgacaat cctgcaatgt tagatgaagc aaaaagcttg atctcccaaa tccaccetaaa gcgccagaaa
tgctcactgc aactctctcc aaaagttccc 60
tttcacaaga gatcctcatt tggatttaat 120
ctgagatgga attgtgtcgg gattcatgcc 180
ccacaggagg aacgctttgt gtcgagactt 240
gacgatttca tcgactctct aacatcccct 300
gatgagacaa tcaataaaag aatcceigaca 360
tccatgggcg acggtgaaac gaatccatct 420
ccgtcaattg acggctctgg tgcaccccaa 480
aatcaactgc cagatggctc gtggggtgag 540
ttaaacactc tcgcctgcct cctcactctc 600
cagaaagggg ttgagtttgt gagaaaacac 660
cacaggccaa gtggattcga ggtcgtgttt 720
ggattggatc ttccttatca cctccctttc 780
aagcttcaaa agattcccct caatgttctt 840cataaccatc agacggcgtt gctctactct ctggagggtt tgcaagatgt ggtggactgg 900
caagagatca caaatcttca atcaagagac ggatcatttt taagctcccc tgcatctact 960
gcttgtgtct tcatgcacac tcaaaacaaa cgatgcctcc actttctcaa cttcgtgctc 1020
agcaaatttg gcgactacgt tccttgccat tacccacttg atctatttga acgcctctgg 1080
gctgtcgata cagttgaacg cttgggaatc gatcgctatt tcaagaaaga aatcaaagaa 1140
tctctggatt acgtttatag gtactgggac gccgaaagag gcgtgggatg ggcaagatgc 1200
aatcctattc ctgatgtcga tgacactgcc atgggtctta gaatcctgag acttcatgga 1260
tacaatgtat cttcagatgt tctggagaat ttcagagacg agaaaggaga cttcttttgc 1320
tttgccggtc aaacgcaaat tggtgtgacc gataatctta acctttatag atgttcacaa 1380
gtatgttttc cgggagaaaa gataatggaa gaagctaaga ccttcactac aaatcatctc 1440
caaaatgctc ttgccaaaaa caacgcattt gataagtggg ctgtcaagaa ggatcttcct 1500
ggagaggtgg agtatgctat aaagtatccg tggcatagaa gtatgccaag attggaggca 1560
agaagttaca tagagcaatt tggatcaaat gatgtctggc tggggaagac tgtgtataag 1620
atgctatatg tgagcaacga aaaatatttg gagctggcca aattggactt caatatggtg 1680
caggccttac accaaaagga gactcaacac attgtcagct ggtggagaga atcgggattc 1740
aatgatctta cattcacccg ccagcggcct gtggaaatgt atttctcagt ggcggttagt 1800
atgtttgagc cagaattcgc tgcttgtaga attgcctatg ccaagacttc ttgcctcgca 1860
gttattctag acgatcttta cgacacccac ggatctctgg atgatcttaa attgttctct 1920
gaagcggtcc gaagatggga tatctctgtg ctggatagcg ttcgggataa tcagttgaaa 1980
gtttgcttcc tagggctgta caacacagtg aatggatttg gaaaagatgg actcaaggaa 2040
caaggccgtg atgtgctggg ctatcttcga aaagtatggg agggcttgct cgcatcgtat 2100
accaaagaag ccgaatggtc ggcagcaaag tatgtgccga cattcaacga atatgtggaa 2160
aatgccaaag tgtccatagc acttgcgaca gtcgtactaa actcaatctt tttcactgga 2220
gaattacttc ctgattacat tttacagcaa gtagaccttc ggtccaaatt tctgcatctt 2280
gtgtctttga ctggacgact aatcaatgac accaagactt accaggccga gagaaaccgt 2340
ggtgaattgg tttccagcgt acagtgctac atgagggaaa atccggagtg cacagaggaa 2400
gaagctctaa gtcatgttta tggtatcatc gacaacgcac tgaaggaatt gaattgggag 2460
ttggccaacc cagcgagcaa tgccccattg tgtgtgagaa gactgctgtt caacactgca 2520
agagtgatgc agctgtttta tatgtacaga gatggctttg gtatctctga caaagagatg 2580
aaagaccatg tcagccgaac tcttttcgat cctgtggcgt ag 262权利要求
1.一种采用转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方法，其特征在于，从银杏中克隆鲨烯合成酶LS基因，构建含ls基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ls基因导入银杏幼胚并诱导出愈伤组织，PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因ls的整合和表达情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定银杏愈伤组织中银杏内酯的含量，筛选银杏内酯含量提高的转基因银杏愈伤组织。
2. 根据权利要求l所述的采用转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方 法，其特征是，包括如下具体步骤-(1) 采用基因克隆方法获得银杏关键酶基因ls;(2) 把ls基因可操作性地连于表达调控序列，形成含ls基因的植物表达载体；(3) 将含ls基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化银杏的含ls基 因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；(4) 利用所构建的根癌农杆菌菌株转化银杏幼胚，获得经PCR检测的转基因愈伤 组织；(5) 半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中ls基因的表达；(6) 对获得的转基因愈伤组织中内酯含量进行高效液相色谱法及蒸发光散射检 测器测定，筛选银杏内酯含量提高的转基因银杏愈伤组织。
3. 根据权利要求2所述的采用转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方 法，其特征是，所述的经PCR检测的转基因愈伤组织，设计合成ls基因的引物，进行 DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性愈伤组织即为转基因银杏愈伤组织。
4. 根据权利要求2所述的采用转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方 法，其特征是，所述的对获得的转基因愈伤组织中内酯含量进行高效液相色谱法及 蒸发光散射检测器测定，方法为色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈甲醇: 水，乙腈甲醇水的体积比为8:69:23，柱温30。C，流速l. 0 mL/min，进样量2(VL， 蒸发光散射检测器漂移管温度为5(TC，放大系数为9，空气气压4.5PSI，银杏内酯含 量根据峰面积由标准品曲线换算。
5.根据权利要求2所述的采用转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方 法，其特征是，所述的半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中银杏内酯生物合成相关基 因的表达，方法为设计合成ls基因和看家基因18SrRNA的引物，进行半定量RT-PCR 扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。
全文摘要
本发明是一种生物技术领域的采用转ls基因提高银杏愈伤组织中银杏内酯含量的方法。本发明从银杏中克隆ls基因，构建含ls基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ls基因导入银杏细胞并再生出愈伤组织；PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因ls的整合和表达情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定银杏愈伤组织中银杏内酯含量，筛选银杏内酯含量提高的转基因银杏愈伤组织。本发明获得的转基因银杏愈伤组织中银杏内酯的含量显著提高，从而提供了一种提高银杏细胞培养物中银杏内酯含量的方法，也为生产具重要临床需求的银杏内酯提供了一种方法。
文档编号C12N15/09GK101186913SQ200710171218
公开日2008年5月28日 申请日期2007年11月29日 优先权日2007年11月29日
发明者唐克轩, 孙小芬, 洁 陆 申请人:上海交通大学