专利名称：：革兰阴性需氧菌鉴定板及其制备方法革兰阴性需氧菌鉴定板及其制备方法仅小'狄喂本发明涉及生物制剂。具体涉及一种革兰阴性需氧菌鉴定板及其制备方法。
背景技术：
：近20年来，由于临床上广泛大量地使用种类繁多的抗菌药物，细菌的耐药性越来越普遍，有的细菌可同时耐2-7种药物，耐药菌株的广泛传播给临床治疗带来很大困难，特别是对于医院内感染的细菌。医院内感染的特点在于是出现在医院环境中的感染，并发生流行，故又可将其称为医院获得性感染(Hospitalacquiredinfection)。虽然发生医院感染的病情有轻有重，但都给病人增加了额外的痛苦、经济负担和不幸，同时也会由于延长住院时间而加重医疗和护理工作的负担，影响病床周转。严重的医院感染往往使病人所患的疾病不能达到预期的疗效，甚至产生难以治疗的后遗症或死亡。据美国的一次不完全统计资料报告，其住院病人中约有5%发生医院感染，平均延长住院45d，每年约有10万人死亡于医院感染，估计每年由于医院感染要多消耗20余亿美元。从引起医院感染的微生物来看，固然有些仍是我们所熟悉的致病性很强的微生物，但是近年来医院感染的病原体种类有明显变化的趋势，革兰氏阴性菌已取代了原来为主要病原的革兰氏阳性球菌，其中肠杆菌科及假单胞菌约占医院感染的60%-65%，并且主要为多耐药性细菌。由于广泛地应用抗生素，细菌的不断变迁，助长了医院内感染的存在和发展，今日的临床微生物学最重要的特点是向医院感染方面转变。微生物鉴定及药敏分析系统是主要应用于临床实验室的高科技体外诊断产品，对辅助临床各科室诊断治疗具有重要意义。目前在国际上，对细菌的快速鉴定和药敏分析巳经取得了很大的进展，微生物自动化检测产品逐步替代了手工检测，而国内的同类研究尚处在探索阶段。目前，国际上同类产品主要有法国生物-梅里埃公司的VITEK-AMS微生物分析系统、美国Dade-MicroScan公司的MicroScan自动微生物鉴定和药敏测试系统以及英国TrekDiagnosticSystemLtd.的SENSTITRE荧光法快速微生物鉴定和药敏分析系统。它们的工作原理相近，主要是根据细菌理化性质的差异，采用光电比色，测定细菌生长分解底物导致PH值改变而产生的不同颜色和浊度变化来判断反应情况，从而给出鉴定药敏结果。国内也有少数厂家正在研究开发类似产品，如湖南天地人的微生物系统等。但是由于此类项目技术含量较高，资金投入大，尤其是菌库的积累耗时耗力，所以目前国内类似产品还很不成熟。在临床推广上，微生物鉴定主要存在以下几个方面的问题(1)鉴定时间偏长，需要16-24小时给出结果；(2)鉴定范围比较狭窄，可以鉴定的细菌只有300余种。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种快速准确革兰阴性需氧菌鉴定板。本发明的鉴定检测实验基于下列原理根据目前微生物鉴定领域权威的伯杰细菌鉴定手册，细菌的鉴定主要通过检测细菌对各种营养物质的利用情况，即通过检测细菌生化反应特性来鉴定细菌。而细菌利用营养物质发生生化反应的过程中，会发生一系列的氧化还原反应，这些氧化还原反应中会产生NADH，而NADH能够把四唑紫(2，3，5-triphenyltcuazAJiiuiiii丄i/]曰/j、刀'jm乂LtC^tnj羊V!Kj王^r7又yv糸tTitnj^bJ眾生okuiHj仏们使用四唑紫作为细菌发生生化反应的指示剂，来检测细菌的生化反应特性，从而达到细菌鉴定的目的。不同细菌利用不同碳源或氮源进入新陈代谢过程，而对其他一些碳源或氮源则无法利用，这些特性是细菌的遗传物质所决定的。目前现有的微生物鉴定板最多只有30个生化反应，因此对于鉴定细菌的种类方面比较狭窄，可以鉴定的革兰阴性菌种类最多只有200余种,且不同种类的细菌需要使用不同种类的板条进行鉴定，同时需要通过补充实验进行验证才能得出鉴定结果，操作比较繁琐。一方面为了克服上述不足之处，达到鉴定我们要求细菌的目的，需要选择一组合适的碳源和氮源。因此本发明人选择了500多种碳源和氮源，对多种细菌进行检测，通过对这些数据的分析整理,最终确定目前板条的碳源和氮源的组合(见下表)。该种鉴定板上的47个碳源和氮源组合可鉴定的革兰阴性菌种类有300余种，可以鉴定阴性肠杆菌科、弧菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、窄食单胞菌属、阴性苛养菌等多种不同种类的细菌，且不需要进行补充实验就可以得出鉴定结果，操作简单。革兰阴性需氧菌鉴定板底物表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>所述肉汤培养基由下列成分组成(V/V)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</tabl本发明的另一目的是提供了革兰阴性需氧菌鉴定板的制备方法。由于革兰阴性需氧菌鉴定板可以鉴定不同种类的细菌，包括一些营养成分要求比较高的苛养菌，因此必须有一种合适的营养物质来满足各种不同种类细菌生长的需要。本发明人通过以下实验对混合试剂中的成分组成进行了选择，研制发明了一种混合试剂，该混合试剂有多种细菌生长所需的营养物质混合组成。1、实验方法选取无机盐基础、氨基酸、磷酸缓冲液、维生素、蛋白胨、牛肉膏、麦芽膏等多种细菌生长营养物质按不同的组合方式和适当的比例混合配置成试剂，然后选取不同种类的细菌进行试验，以确定合种组合方式可以满足各种不同种类细菌的生长。2、实验结果本实验选取了大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、木糖氧化产碱杆菌、、脑膜炎奈瑟菌、副溶血弧菌、嗜血杆菌不同种类细菌加入不同混合试剂配置的鉴定板条中进行实验，实验结果如下-<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通过上述实验表明组合5的混合试剂可能满足不同种类细菌生长的需要，因此本发明人确定了混合试剂的组合方式，该混合试剂的各物质按下列比例混合配置<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本发明方法包括下列步骤1、配置鉴定板反应底物原液根据下列配置浓度要求配置各反应底物的原液(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、配置肉汤培养基(1)、下列各物质的按比例混合配置GN/MT(革兰阴性菌盐贮液)(重量%浓度)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)、按下列物质配置浓度要求配置GN(革兰阴性)混合贮液(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(3)、根据下列配置浓度要求配置以下几种物质的水溶液(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>、按下列各物质的比例混合配置肉汤培养基(V/V)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3、分装(1)根据板条批量生产的数量要求将合适的步骤1配置的反应底物原液分装到96支试管中。(2)根据板条批量生产的数量要求将合适的步骤2配置的肉汤培养基加入到(1)的试管中。4、加样分装板条使用分装系统在96孔的相应位置对指定的鉴定板条加样，每孔加50ul;5、板条干燥上述板条常温干燥16-18小时；6、包装7、板条存IC由于本发明鉴定板上的47个碳源和氮源组合可鉴定的革兰阴性菌种类有300余种，可以鉴定阴性肠杆菌科、弧菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、窄食单胞菌属、阴性苛养菌等多种不同种类的细菌，且不需要进行补充实验就可以得出鉴定结果，操作简单，结果准确，因而，有较大的临床应用价值。具体实施例方式革兰阴性需氧菌鉴定板，批量生产375块产品的生产工艺流程如下1、配置鉴定板反应底物原液<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>硫酸铵[(NH4)2S04]8.456g十水合焦磷酸钠[Na4P2O7-10H20]0.071g(2)、根据配置浓度要求配置GN混合贮液物质名称纯水本批所需量(ml)药物本批所需量(g)GN混合试剂250.18425(3)、根据配置浓度要求配置以下几种水溶液物质名称纯水本批所需量(ml)药物本批所需量(g)0.5mM叶酸100.0022结晶紫750.6-0.825蛋白酶17.51.75-2.1酵母膏50.25(4)将下列各物质混合配置肉汤培养基物质名称药物本批所需量纯水643.75mlGN/MT219.5mlGN混合C液21.95ml0.5mM叶酸水溶液8.75ml的蛋白酶水溶液14.625ml酵母膏水溶液1.025ml结晶紫水溶液70.25ml3、分装(1)将配置的反应底物原液分装到相对应的96支试管中，每管加入6.675ml。(2)将配置的肉汤培养基加入到96支试管中，每管加入8.95ml。4、加样分装板条将配置好的％根试管装在加样机上，使用加样机对指定的鉴定板条加样，每孔加50ul。(在这之前要先运行分装系统；整个程序大约需要3个小时)。5、板条干燥将加样好的板条放入干燥间进行常温干燥，24小时后板条可干燥完毕。6、板条包装'将干燥好的板条从干燥间经传递窗送到包装间进行包装。7、板条存贮包装完毕的板条放入2-8'C冰箱进行保存。19权利要求1、一种革兰阴性需氧菌鉴定板，其特征在于该鉴定板由反应底物原液和肉汤培养基组成，所述反应底物原液在鉴定板上的位置及其各成分的浓度为g/ml位置溶液名称浓度A1，A7水100％A2，A8吐温806％A3，A9N-乙酰基-D-半乳糖胺2％A4，A10L-树胶醛糖4％A5，A11D-阿糖醇4％A6，A12D-纤维二糖4％B1，B7D-果糖8％B2，B8D-半乳糖4％B3，B9α-D-葡萄糖10％B4，B10甘油2％B5，B11α-D-乳糖4％B6，B12麦芽糖4％C1，C7D-甘露醇8％C2，C8D-蜜二糖4％C3，C9β-甲基-D-配糖物4％C4，C10D-阿洛酮糖4％C5，C11D-棉子糖4％C6，C12D-山梨糖醇4％D1，D7蔗糖4％D2，D8松二糖4％D3，D9丙酮酸甲基脂4％D4，D10单甲基琥珀酸4％D5，D11顺式乌头酸2％D6，D12二水合柠檬酸三钠2％E1，E7蚁酸钠2％E2，E82％DL-α-羟基丁酸钠2％E3，E9DL-β-羟基丁酸钠2％E4，E10γ-羟基丁酸钠2％E5，E112％P-羟基苯乙酸2％E6，E12D，L-乳酸钠2％F1，F7丙二酸2％F2，F8D-砂糖酸2％F3，F9L-丙氨酸氨基盐酸盐4％F4，F10L-丙胺酸2％F5，F11L-丙氨酰甘氨酸2％F6，F12L-天冬酰胺酸4％G1，G7L-谷氨酸钠4％G2，G8L-组氨酸盐酸盐2％G3，G9羟基-L-脯氨酸2％G4，G10L-亮氨酸3％G5，G11L-焦谷氨酸2％G6，G12D-丝氨酸2％H1，H7γ-氨基丁酸2％H2，H8肌苷2％H3，H9胸腺嘧啶脱氧核苷2％H4，H10腐胺二盐酸盐2％H5，H11D，L-α-甘油磷酸二钠2％H6，H12α-D-葡萄糖-1-磷酸盐2％所述肉汤培养基由下列成分组成v/v物质名称所占比例纯水65.8％GN/MT22.4％GN混合贮液2.24％0.5mM叶酸水溶液0.89％10％-12％蛋白酶水溶液1.49％5％酵母膏水溶液0.1％0.8％-1.1％结晶紫水溶液7.17％。2、根据权利要求1所述一种革兰阴性需氧菌鉴定板，其特征在于所述肉汤培养基中的GN/MT由下列成分组成重量％浓度物质名称所占比例纯水[1120]61.082%二水合磷酸二氢钠[NaH2P04-2H20]10.6%磷酸氢二钠[Na2HP04]18.7%氯化钾[KC1]7.5%硫酸铵[(NH4)2S04]2.1%十水合焦磷酸钠[Na4P2O7-10H20]0.018%。3、根据权利要求1所述一种革兰阴性需氧菌鉴定板，其特征在于所述肉汤培养基中的GN混合贮液由下列成分组成的GN混合试剂加水配置而成重量％浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>4、根据权利要求1所述一种革兰阴性需氧菌鉴定板，其特征在于所述革兰阴性需氧菌鉴定板的底物及其在鉴定板上的位置为:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>5、一种革兰阴性需氧菌鉴定板的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤:(1)配置鉴定板反应底物原液根据下列配置浓度要求配置各反应底物的原液g/ml位置溶液名称浓度Al,A7水100%A2,A8吐温806%A3,A9N-乙酰基-D-半乳糖胺2%A4，A10L-树胶醛糖4%A5，AllD-阿糖醇4%A6，A12D-纤维二糖4%Bl，B7D-果糖8%B2，B8D-半乳糖4%B3，B9a-D-葡萄糖10%B4，B10甘油2%B5，Blla-D-乳糖4%B6，B12麦芽糖4%Cl，C7D-甘露醇8%C2，C8D-蜜二糖4%C3，C9e-甲基-d-配糖物4%C4，C10D-阿洛酮糖4%C5，CllD-棉子糖4%C6，C12D-山梨糖醇4%Dl，D7蔗糖4%D2,D8松二糖4%D3，D9丙酮酸甲基脂4%D4，D10单甲基琥珀酸4%D5，Dll顺式乌头酸2%D6,D12二水合柠檬酸三钠2%El,E7蚁酸钠2%E2，E82呢DL-a-羟基丁酸钠2%E3，E9DL-e-羟基丁酸钠2%E4,E10Y-羟基丁酸钠—2%E5，Ell2%P-羟基苯乙酸2%E6，E12D，L-乳酸钠2%Fl，F7丙二酸2%F2，F8D-砂糖酸2%F3，F9L-丙氨酸氨基盐酸盐4%F4，F10L-丙胺酸2%<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>,0.8°/。-1.1°/。的结晶紫7.17%;(3)分装①根据板条批量生产的数量要求将合适的步骤1配置的反应底物原液分装到96支试管中；②根据板条批量生产的数量要求将合适的步骤2配置的肉汤培养基加入到①的试管中；(4)加样分装板条使用分装系统在96孔的相应位置对指定的鉴定板条加样，每孔加50ul;(5)板条干燥上述板条常温干燥16-18小时；(6)包装(7)板条存贮。全文摘要本发明提供了革兰阴性需氧菌鉴定板。本发明鉴定板上的47个碳源和氮源组合可鉴定的革兰阴性菌种类有300余种，可以鉴定阴性肠杆菌科、弧菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、窄食单胞菌属、阴性苛养菌等多种不同种类的细菌，且不需要进行补充实验就可以得出鉴定结果，操作简单，结果准确，因而，有较大的临床应用价值。本发明提供了革兰阴性需氧菌鉴定板的制备方法。文档编号C12Q1/04GK101469341SQ20071017306公开日2009年7月1日申请日期2007年12月26日优先权日2007年12月26日发明者朱骏娜,邹艳芳,陈弛宇申请人:上海复星佰珞生物技术有限公司;上海复星医药(集团)股份有限公司