专利名称：木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法，是一种促进限制性 内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme-mediated integration, REMI)构建
的木霉菌突变株高产分生孢子的发酵方法。主要用于防治温室蔬菜土传病害。
背景技术：
长期以来，蔬菜病害以化学防治为主，而频繁施用化学农药控制病害，不仅 成本高，费工费时，而且造成蔬菜中农药过量残留，对人体健康和生态环境造成 危害。因此开发高效生物农药具有重要意义。木霉菌为一类应用历史悠久的生物 防治活性真菌，目前国际上已开发注册的木霉菌产品己有50余种，大多数都可 用于防治作物土传病害或部分叶部病害和促进作物生长，然而在木霉菌应用过程 中防效不稳定，持效性差。因此通过限制性内切酶介导的基因整合技术，创制木 霉菌REMI突变株和优化相应的发酵工艺，进而研制出防病增产和修复环境的新 型生物菌剂具有重要意义。由于木霉菌突变株容易出现菌丝生长过于旺盛，而产 孢量不足的问题，而突变株分子孢子的产量与菌剂的质量密切相关，因此需要研 究开发一种能够解决木霉菌REMI突变株高产分生孢子的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种木霉菌突变株分生孢子 的固体发酵方法，能产生大量的分生孢子，可直接用于开发高效木霉菌生物农药， 有效防治植物土传病害。
为实现这一目的，本发明首先对限制性内切酶介导基因整合技术构建的木 霉菌突变株进行稳定性检测，然后筛选出产孢量大、且对多种病原菌有较强抑制 作用的生物工程突变株。单孢分离后转移至试管斜面内作母菌种，进而经马铃薯 葡萄糖琼脂培养基、发酵种子液培养基培养获得二级菌种，再经优化的固体发酵 方法使其产生分生孢子。发酵所用的固体发酵培养料由麦麸、腐殖酸钠、玉米渣、 稻壳、稻草粉构成，通过优化固料配比和发酵条件，发酵所获得的孢子-基质混 合物经干燥后可直接用于生产。
本发明的方法具体包括如下步骤
1、 突变株稳定性检测
将在抗性培养基上生长的木霉菌单个菌落在含有220-260微克/毫升潮霉素 的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上转代3-4次，再移入不含有潮霉素的马铃薯葡萄糖 琼脂培养基，经过7-8次转代培养，再移入含有230-260微克/毫升潮霉素的马铃 薯葡萄糖琼脂培养基，将能够正常生长的菌株确定为稳定的转化子。将性状表现 稳定的突变株进行单孢分离后，转移至试管斜面内保存作为母菌种。
2、 孢子悬液的制备
在无菌室内将木霉菌突变株母菌种转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，26-28°C 下培养5-7天，用接种针刮下分生孢子，配成孢子量为(1-2) 乂106个/毫升的孢 子悬液。
3、 二级菌种制备
取马铃薯200-250克、葡萄糖20-25克、MgS04.7H20 0.4-0.5克、 FeS04.7H20 0.0075克、MnS04 0.0025克、ZnS04 0.002克、KH2P04 3.83克、 NaN03 1.42-1.50克、(NH4)2S04 1.1-1.2克、CaCl2 1-1.25克，水1000毫升，配 制成发酵种子液培养基，调节pH值为6-7，在12rC下灭菌20-30分钟，以1-1.5
%的接种量向发酵种子液培养基接种孢子悬液，于摇床中振荡培养。培养条件是 27-28°C， 140转/分，培养5-6天，获得二级菌种。
4、 发酵液制备
配制固体发酵培养料，其组分以重量百分比计算为麦麸腐殖酸钠玉米 渣:稻壳:稻草粉=15.0-16.0 : 0.75-1.0 :3.0-3.5: io-ii : io-ii，固料与水的重
量比为1-1.5 : 0.5-1.0;固体发酵培养料在发酵罐中的厚度为6-8厘米，二级菌种 的接种量为15-20%，培养温度为27-29'C，湿度为33-34%，通气量为20-25升/ 分钟，搅拌发酵5-7天，至固体发酵培养料变成绿色即获得木霉菌突变株分生孢子。
5、 菌剂制备
将长满木霉菌突变株分生孢子的固体发酵培养料，在35-4(TC下干燥后制备 成菌剂。
取本发明发酵培养所得的菌剂6-8wt^与土壤或基质混合，在植物定植前后
和生长期间，通过穴施、混土或随流灌根，可直接用于防治植物土传病害。
本发明方法可产生大量的木霉菌分生孢子，最大分生孢子量可达(1-2) X
10"个/克，可穴施或直接随流水进行浇灌，直接用于保护地蔬菜生产。孢子繁殖
速度快，易在根围形成微生物膜，起到很好的生物防治效果。分生孢子菌剂对于
由镰刀菌、立枯丝核菌等引起的温室蔬菜枯萎病、猝倒病等土传病害有良好的防
治效果，防效可达60%-75%。
本发明适用于大多数木霉菌生物工程突变株的大量生产分生孢子，方法简
单易行，市场前景广阔。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不 构成对本发明的限定。
实施例l
1、 突变株稳定性检测
将在抗性培养基上生长的木霉菌单个菌落在含有250微克/毫升潮霉素的 PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上转代3次，再移入不含有潮霉素的 PDA培养基，经过7次转代培养，再移入含有250微克/毫升潮霉素的PDA培养 基，将能够正常生长的菌株确定为稳定的突变株。将性状表现稳定的突变株进行 单孢分离后转移至试管斜面内作斜面母菌种。试管斜面培养基为常规PDA培养 基。该培养基主要成分马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂11克、水1000毫 升。
2、 孢子悬液的制备
在无菌室内将木霉菌突变株母菌种转入PDA培养基中，28'C下培养5天， 用接种针从培养基表面刮取分生孢子，配成孢子量为lXl()S个/ml的孢子悬液。
3、 二级菌种制备
取马铃薯200克、葡萄糖20克、MgS04.7H20 0.5克、FeS04.7H20 0.0075克、 MnS040.0025克、ZnS040.002克、KH2P043.83克、NaN03 1.42克、(NH4)2S04 1.1克、CaCl2 1克，水1000毫升，配制成发酵种子液培养基。调节pH值为6-7， 分装在250毫升三角瓶中，装液量为100毫升，在121。C下灭菌20-30分钟，以 1%的接种量向发酵种子液培养基接种配制好的孢子悬液，于摇床中振荡培养。
培养条件是28°C 140转/分，培养5天时间，即可获得二级菌种用于发酵使用。
4、 发酵液制备
所配制的固体发酵培养料组分以重量百分比计算，各种组分的配比是麦麸: 腐殖酸钠玉米渣稻壳稻草粉=15: 0.75: 3.0: 10.0: 10.0，固料与水的重量 比为l: 0.5，固体发酵培养料在发酵罐中的厚度为7厘米，二级菌种的接种量为 20%,培养温度为28°C。整个发酵过程如下将固体发酵培养料各组分按比例
称出， 一次发酵约需培养基3公斤(70升固体发酵罐)，按照发酵罐的使用方法
进行发酵程序空气过滤器及空气管道的消毒一空消一将培养料放入罐体一实
消一按20%的接种量接入二级菌种一培养将温度控制在28°C，湿度为33.3 %左右，通气量约为20升/分，搅拌时间为12小时/次，可通过主控制面板对温 度和湿度及转速加以控制。发酵时间为5天，至固体发酵培养料长满绿色分生孢 子，即获得木霉菌突变株分生孢子。
5、 菌剂制备
将长满木霉菌突变株分生孢子的固体发酵培养料，在35'C下干燥后制备成 菌剂，其分生孢子含量为lxlO"个/克以上。
将木霉菌菌剂以6wt^的比例与土壤混合，在黄瓜生长期间，通过穴施、混 土或随流灌根，可直接用于防治黄瓜镰孢菌枯萎病病害，防治效果可达70%以 上。
实施例2
1、 突变株稳定性检测
将在抗性培养基上生长的单个菌落在含有260微克/毫升潮霉素的PDA (马 铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基上转代3次，再移入不含有潮霉素的PDA培养基， 经过7次转代培养，再移入含有260微克/毫升潮霉素的PDA培养基，将能够正 常生长的菌株确定为稳定的突变株。将其性状表现稳定突变株进行单孢分离后转 移至试管斜面内作斜面母菌种。试管斜面培养基为常规PDA培养基。该培养基 成分为马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升。
2、 孢子悬液的制备
在无菌室内将木霉菌突变株母菌种转入PDA培养基中，27"C下培养6天，
用接种针从培养基表面刮取分生孢子，配成孢子量为2X 1()S个/ml的孢子悬液。
3、 二级菌种制备
取马铃薯250克、葡萄糖25克、MgS04.7H20 0.4克、FeS04.7H20 0.0075 克、MnS04 0.0025克、ZnS04 0.002克、1012 043.33克、NaN03 1.89克、(> 14)2804 2.2 g、 CaCl2 1.33克，水1000毫升，配制成发酵种子液培养基。调节pH值为 6-7，分装在250毫升三角瓶中，装液量为100毫升，在121'C下灭菌20-30分钟， 以1.5%的接种量向发酵种子液培养基接种配制好的孢子悬液，于摇床中振荡培 养。培养条件是27°C 140转/分，培养6天时间，即可获得二级菌种用于发
酵使用。
4、 发酵液制备
所配制的固体发酵培养料组分以重量百分比计算，各种组分的配比是麦麸 腐殖酸钠玉米粉稻壳稻草粉=16: 1.0: 3.5: 11.0: 11.0，固料与水的重量 比为l: 0.5，固体发酵培养料在发酵罐中的厚度为8厘米，二级菌种的接种量为 20%，培养温度为29°C。整个发酵过程如下将固体发酵培养料各组分按比例 称出， 一次发酵约需培养基4公斤(70升固体发酵罐)，按照发酵罐的使用方法 进行发酵程序空气过滤器及空气管道的消毒一空消一将培养料放入罐体一实
消一按15%的接种量接入二级菌种一培养将温度控制在29°C，湿度为33.3 %左右，通气量约为20升/分，搅拌时间为12小时/次，可通过主控制面板对温 度和湿度及转速加以控制。发酵时间为7天，至固体发酵培养料长满绿色分生孢 子，即获得木霉菌突变株分生孢子。
5、 菌剂制备
将长满木霉菌突变株分生孢子的固体发酵培养料，在4crc下干燥后制备成
菌剂，其分生孢子含量为lxl0H个/克以上。
将木霉菌菌剂以8城％的比例与土壤混合，在黄瓜生长期间，通过穴施、混 土或随流灌根，可直接用于防治黄瓜丝核菌苗病，在发病前或发病初期施用，防 治效果可达75.0%。
权利要求
1、一种木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法，其特征在于包括如下步骤1)将在抗性培养基上生长的木霉菌单个菌落在含有220-260微克/毫升潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上转代3-4次，再移入不含有潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，经过7-8次转代培养，再移入含有230-260微克/毫升潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将能够正常生长的菌株确定为稳定的突变株；将性状表现稳定的突变株进行单孢分离后，转移至试管斜面内保存作为母菌种；2)在无菌室内将木霉菌突变株母菌种转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，26-28℃下培养5-7天，用接种针刮下分生孢子，配成孢子量为(1-2)×106个/毫升的孢子悬液；3)取马铃薯200-250克、葡萄糖20-25克、MgSO4.7H2O 0.4-0.5克、FeSO4.7H2O0.0075克、MnSO4 0.0025克、ZnSO4 0.002克、KH2PO4 3.83克、NaNO31.42-1.50克、(NH4)2SO4 1.1-1.2克、CaCl2 1-1.25克，水1000毫升，配制成发酵种子液培养基，调节pH值为6-7，在121℃下灭菌20-30分钟，以1-1.5％的接种量向发酵种子液培养基接种孢子悬液，于摇床中振荡培养；培养条件是27-28℃，140转/分，培养5-6天，获得二级菌种；4)配制固体发酵培养料，其组分以重量百分比计算为麦麸∶腐殖酸钠∶玉米渣∶稻壳∶稻草粉＝15.0-16.0∶0.75-1.0∶3.0-3.5∶10-11∶10-11，固料与水的重量比为1-1.5∶0.5-1.0；固体发酵培养料在发酵罐中的厚度为6-8厘米，二级菌种的接种量为15-20％，培养温度为27-29℃，湿度为33-34％，通气量为20-25升/分钟，搅拌发酵5-7天，至固体发酵培养料变成绿色即获得木霉菌突变株分生孢子；5)将长满木霉菌突变株分生孢子的固体发酵培养料，在35-40℃下干燥后制备成菌剂。
2、 一种权利要求1所得菌剂的应用，其特征在于取该菌剂6-8wtX与土壤 或基质混合，在植物定植前后和生长期间，通过穴施、混土或随流灌根直接用于 防治植物土传病害。
全文摘要
本发明涉及一种木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法。首先对限制性内切酶介导基因整合技术构建的木霉菌突变株进行稳定性检测，然后筛选出产孢量大、且对多种病原菌有较强抑制作用的生物工程突变株。单孢分离后转移至试管斜面内作母菌种，进而经马铃薯葡萄糖琼脂培养基、发酵种子液培养基培养获得二级菌种，再经优化的固体发酵方法使其产生分生孢子。发酵所用的固体发酵培养料由麦麸、腐殖酸钠、玉米渣、稻壳、稻草粉构成，通过优化固料配比和发酵条件，发酵所获得的孢子-基质混合物经干燥后可直接用于生产。本发明方法可产生大量的分生孢子，可直接用于保护地蔬菜生产，对由镰刀菌、立枯丝核菌等引起的土传病害有良好的防治效果。
文档编号C12N1/15GK101195807SQ20071017328
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者刘力行, 晶 王, 捷 陈 申请人:上海交通大学