专利名称：：一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种双试剂，具体涉及一种酶法测定唾液酸液体双试剂及其应用。
背景技术：
：唾液酸又称N-乙酰神经氨酸(SialicAcid,SA),是细胞膜糖蛋白的重要组成部分，以与细胞膜糖蛋白、糖脂结合两种形式存在。唾液酸与生物体的许多生物学功能有关，当细胞代谢异常时，唾液酸脱落进入体液，以致血中唾液酸升高。测定血清唾液酸浓度，可作为癌肿诊断辅助性指标和疗效观察指标，癌症患者SA水平动态变化与病情相关，可以用于早期发现肿瘤的转移和复发，对肝硬化的诊断及预后判断有重要意义，SA升高也是心血管疾病的危险因素之一，近年来SA含量与疾病的关系研究更涉及到糖尿病肾病等临床诊断应用中。除此之外，SA含量检测也可应用在食品安全和健康领域，如燕窝、奶粉中的唾液酸含量检测。唾液酸的检测方法主要有HPLC、酶法、化学比色法(常见的硫代巴比妥酸法、间苯二酚法)。HPLC法具有灵敏度高、特异性好，但仪器昂贵且不适合临床批量检测，化学比色法虽然价糾氐廉，但特异性较低、操作复杂，需高温萃取，不适合自动化分析，其试剂成分具有一定的腐蚀性及对人体的危害性。酶分析法具有特异性高、操作简单快捷、准确安全，可自动化分析，酶法中最常用的是偶联乳酸脱氢酶的紫外法，由于以往自动化分析仪未普及试剂用量大、干粉试剂复溶后稳定时间短、适用机型少，用户使用成本高、无法满足临床检测需求。
发明内容本发明的目的在于(1)提供一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂；(2)提供一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂在制备肺瘤筛查或唾液酸斥企测试剂中应用。本发明的目的是通过以下技术方法来实现的本发明人经过对试剂的主要成分神经氨酸苷酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶、还原型辅酶NADH特性进行仔细研究发现(见图1、2,唾液酸测定试剂中几个重要成份的特性)，进口的干粉单一试剂成本过高原因，主要是单一试剂的系统设计无法满足上述反应成分的最佳条件，主要表现在1、本反应的关键工具酶神经氨酸苷酶在其反应条件下活性只有最佳状态的50%活性左右，由于神经氨酸苷酶价格十分昂贵，致使试剂成本过高；2、还原型辅酶NADH在其反应条件下不稳定，必须制成干粉试剂才能达到长期保存稳定，复溶后须尽快使用，否则在保存过程中NADH降解很快对试剂性能造成影响，由于进口干粉单一试剂都是大包装，中小用户使用复溶后如不及时用完，造成试剂浪费增力n成本。本发明的技术方案如下一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂，由试剂1和试剂2组成，试剂1包括神经氨酸苷酶0.01-50KU/L乳酸脱氢酶0.1-50KU/L緩冲液25-100mmol/L试剂2包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶0.1-50KU/L还原型辅酶NADH0.05-5mmol/L葡萄糖脱氢酶0.1-10000U/L葡萄糖0.1-500mmol/L緩冲液25-100mmol/L所述的緩沖液选自Trh类緩冲液、磷酸盐緩冲液、焦磷酸盐緩沖液、甘氨酸緩冲液、柠檬酸盐緩沖液、二乙醇胺、三乙醇胺类緩冲液、碳酸盐緩冲液、MES緩沖液、Good's緩沖液或硼酸类緩冲液，其PH值在3.0至11.0,试剂1、试剂2中还包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂，所述的稳定剂选自Mg离子、NaCl、KC1、CaCl2、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素、鳌合剂EDTA类、聚乙二醇、二糖类、多元醇、双甘肽及抗氧化剂，抗生素选自氯霉素、红霉素、青霉素、庆大霉素，二糖类选自山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖，多元醇选自乙二醇、丙三醇、丙二醇，表面活性剂选自Tween系列、TritonX-100等非离子表面活性剂，防腐剂选自庆大霉素、麝香草酚、羟基苯曱酸、氮化钠等。一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂，由试剂1和试剂2组成，试剂1包括100mmol/L240U/L10KU/LMES緩冲液pH6.2神经氨酸苷酶乳酸脱氢酶试剂2包括Tris緩冲液pH8.75N-乙酰神经氨酸醛缩酶还原型辅酶NADH葡萄糖脱氢酶葡萄糖50mmol/L10KU/L0.3mmol/L15U/L20mmol/L。一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂在制备肿瘤筛查或唾液酸冲全测试剂中应用。本发明所公开一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂，其优点表现在使用方便无需溶解液复溶，瓶间差异小，其包装能适各类自动生化分析仪，可避免二次污染、简化生产工艺方法。图1:NADH在不同pH的稳定性研究，在高温40。C保存一周的加速试验结果，NADH在pH碱性有较好的稳定性。图2:唾液酸测定试剂中两个工具酶在不同pH下的活性情况。神经氨酸苦酶在pH6.O活性最高，相对干粉单一试剂pH7.9活性增强一倍左右；N-乙酰神经氨酸醛缩酶对不同pH都有较好的活性。图3:本发明试剂1神经氨酸苷酶的设计的反应条件处于最佳状态，比干粉商品试剂pH7.9i^作用提高一倍左右。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述，所提及的实施例是对本发明详细说明，而不是对本发明范围的限定。实施例1试剂1MES緩沖液pH6.2100mraol/L神经氨酸苷酶乳酸脱氢酶表面活性剂TritonX-100牛血清白蛋白NaN3试剂2Tris緩冲液pH8.75N-乙酰神经氨酸醛缩酶还原型辅酶NADH牛血清白蛋白葡萄糖实施例2试剂1包括神经氨酸普酶乳酸脱氬酶BES緩沖液pH6.0海藻糖苯曱酸试剂2包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶还原型辅酶NADH葡萄糖脱氢酶240U/L10KU/L1ml/L2g/L1g/L50mmol/L10KU/L0.3mmol/L2g/L15U/L20mmol/L10KU/L5KU/L100,1/L10g/L1.5g/L20KU/L0.25mmol/L100U/L8葡萄糖100IMOl/L甘氨酸緩沖液pH9.075mmol/L海藻糖10g/L羟基苯曱酸曱酯1.5g/L实施例3试剂1包括神经氨酸苷酶20KU/L乳酸脱氢酶15KU/L柠檬酸緩冲液pH6.080mraol/L聚乙二醇2g/L庆大霉素3g/L试剂2包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶10KU/L还原型辅酶NADH1mmol/L葡萄糖脱氢酶20U/L葡萄糖5O腿ol/LAMP緩沖液pH8.530画ol/L聚乙二醇2g/L庆大霉素3g/L实施例4试剂1包括神经氨酸苷酶1KU/L乳酸脱氬酶咪唑緩冲液pH6.215KU/L100mmol/L试剂2包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶还原型辅酶NADH葡萄糖脱氢酶葡萄糖CAPSO緩冲液pH9.21KU/L0.35mmol/L50U/L500咖ol/L100画1/L实施例5试剂2ATris緩冲液pH8.75N-乙酰神经氨酸醛缩酶还原型辅酶NADHNaN350mmol/L10KU/L0.3mmol/L1g/L干粉单一复溶试剂:神经氨酸苷酶N-乙酰神经氨酸醛缩酶乳酸脱氬酶还原型辅酶NADH0.27U/ml2.7U/ml8900U/ml0.13imnol/LTris緩冲液pH7.9100mraol/L将本发明试剂2A和干粉单一复溶试剂在4(TC一周做加速试验，一周后与新鲜制备试剂同时测定NADH含量，结果如下表，以新鲜试剂为100%,加速试验试剂相对值表示:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本实施例试剂2A的pH明显提升NADH残余量，考虑到过高的pH对N-乙酰神经氨酸醛缩酶的稳定性影响，最佳pH在8.75-9.0。实施例6由于N-乙酰神经氨酸醛缩酶、乳酸脱氬酶中的杂酶如NADH氧化酶会对NADH氧化作用生成NAD,长期保存，NADH会逐渐下降，本实施例在试剂2B中加入葡萄糖脱氢酶和葡萄糖将NAD重新生成NADH。试剂2BTris緩沖液pH8.7550咖ol/LN-乙酰神经氨酸醛缩酶10KU/L还原型辅酶NADHQ.3mmol/L牛血清白蛋白2g/L葡萄糖脱氢酶15U/L葡萄糖30mmol/L将本发明试剂2A和试剂2B在8'C保存九个月，九个月后与新鲜制备试剂同时测定NADH含量，结果如下表，以新鲜试剂为100y。，试验试剂相对值表示<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本实施例试剂2B比试剂2A的MDH残余量得到明显提升。将实施例1制得的双试剂在日立7060的测定参数:Rl-240|u1，R2-80|u1,样品-8jal,波长340/405nm读点21-27点<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从上述与干粉试剂测定临床标本相关性实验结果看本发明试剂和干粉测定值的相关系数r=0.991,表明本发明试剂方法有良好的准确性。实施例1的试剂1神经氨酸苷酶的设计的反应条件处于最佳状态，比干粉商品试剂pH7.9^作用提高一倍左右(图3)，相应达到同等反应水平所需酶只需干粉试剂的一半左右。根据上述各种测定结果，表明本发明的唾液酸酶法测定试剂在稳定性上得到明显提高，满足检测需求，在降低成本30%左右其准确性仍能达到干粉试剂水平。权利要求1、一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂，由试剂1和试剂2组成，其特征在于试剂1包括神经氨酸苷酶0.01—50KU/L乳酸脱氢酶0.1—50KU/L缓冲液25—100mmol/L试剂2包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶0.1—50KU/L还原型辅酶NADH0.05—5mmol/L葡萄糖脱氢酶0.1—10000U/L葡萄糖0.1—500mmol/L缓冲液25—100mmol/L所述的缓冲液选自Tris类缓冲液、磷酸盐缓冲液、焦磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、二乙醇胺、三乙醇胺类缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液、Good′s缓冲液或硼酸类缓冲液，其PH值在3.0至11.0。2、根据权利要求1所述的双试剂，其特征在于试剂1、试剂2中还包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂，所述的稳定剂选自Mg离子、NaCl、KC1、CaCl2、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素、鳌合剂EDTA类、聚乙二醇、二糖类、多元醇、双甘肽中的一种，及抗氧化剂。3、根据权利要求2所述的双试剂，其特征在于所述的抗生素选自氯霉素、红霉素、青霉素、庆大霉素，二糖类选自山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖，多元醇选自乙二醇、丙三醇、丙二醇中的一种。4、根据权利要求2所述的双试剂，其特征在于所述的表面活性剂选自非离子表面活性剂，所述的非离子表面活性剂是Tween系列、TritonX-IOO中的一种。5、根据权利要求2所述的双试剂，其特征在于防腐剂选自庆大霉素、麝香草酚、羟基苯曱酸、氮化钠中的一种。6、根据权利要求l-5任一所述的双试剂，其特征在于试剂1包括MES緩冲液pH6.2神经氨酸苷酶乳酸脱氲酶试剂2包括Tris緩沖液pH8.75N-乙酰神经氨酸醛缩酶还原型辅酶NADH葡萄糖脱氢酶葡萄糖100mmol/L240U/L10KU/L50mmol/L10KU/L0.3mmol/L15U/L20mmol/L。7、根据权利要求1-5任一所述的双试剂在制备肿瘤筛查或唾液酸检测试剂中应用全文摘要本发明涉及一种双试剂，具体涉及一种酶法测定唾液酸液体双试剂及其应用。本发明的技术方案如下一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂，由试剂1和试剂2组成，试剂1包括神经氨酸苷酶0.01-50KU/L，乳酸脱氢酶0.1-50KU/L，缓冲液25-100mmol/L；试剂2包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶0.1-50KU/L，还原型辅酶NADH0.05-5mmol/L，葡萄糖脱氢酶0.1-10000U/L，葡萄糖0.1-500mmol/L，缓冲液5-100mmol/L。本发明优点表现在使用方便无需溶解液复溶，瓶间差异小，其包装能适各类自动生化分析仪，可避免二次污染、简化生产工艺方法。文档编号C12Q1/527GK101469344SQ20071017340公开日2009年7月1日申请日期2007年12月29日优先权日2007年12月29日发明者夏煜煜申请人:上海铂锦诊断用品有限公司