专利名称：：锰氧化细菌芽孢杆菌菌株wh4及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及环境微生物领域。具体地，本发明涉及一种金属氧化物生物合成的菌种材料，即芽孢杆菌菌株WH4(^7"7/msp.WH4)，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2007年6月14日，保藏号是CGMCCNo.2089。本发明还涉及其应用。
背景技术：
：锰(Mn)在地壳中含量丰富(居第10位)，是丰度仅次于铁的最常见重金属元素。锰氧化物(包括锰的氧化物、羟化合物和氢氧化合物)(Teboetal.，2004)是具有高度反应活性的矿物形式，作为天然强氧化剂之一，锰氧化物广泛地参与自然界中有机和无机化合物的氧化还原反应；同时锰氧化物具有很大的比表面积和很强的吸附能力，能吸附多种重金属和微量元素，决定着这些有毒和重要元素在陆地表层系统中的分布及其生物有效性，一直被誉为"海洋的清道夫"。长久以来，锰氧化物一直被作为重要的矿产资源开采利用。目前自然界已发现30多种锰的氧化物/氢氧化物矿物，被用于许多领域，包括水处理和污水处理；土壤和沉积物中金属和有机物质的修复；金属的去除和回收。如锰绿砂(即含不同价态锰氧化物的海绿石)被广泛用作饮用水的过滤介质以及专门去除Mn(II)、Fe(II)、硫化氢和砷的吸附剂(Casaleetal.2002);另如通过添加磷和锰氧化物隐钾锰矿可以显著地提高土壤和残矿区样品中铅的固定(Hettiarachchieta1.，2000)。作为重要的矿产资源，锰氧化物还被广泛应用于工业生产中。如锰作为去氧剂和脱硫剂是制钢业和高强度合金制造中的关键成份。当前世界上钢铁工业中的锰矿用量占了锰矿总产量的80-90%;钢铁中锰的含量平均达0.6%(重量百分比)，在高强度的钢材中则达到10。/。甚至还要更高(Lankfordetal.,1984)。天然的锰氧化物还被用作锌-碳干电池的负极材料。最近几年，以人工合成的、电解的锰氧化物为材料生产的碱性电池也迅速占据了电池市场。此外，锰氧化物还被用于特殊铝合金、涂料和催化剂等的生产。锰氧化矿物广泛分布于大陆和大洋底，大洋底的储量是陆地上相应储量的几十到几千倍，开采难度较大。至1996年，我国陆地已查明锰矿区有213处，保有锰矿石储量5.66亿t，居世界第6位。但总的说来，我国的锰矿资源分布不均，矿产规模较小；213处锰矿区中，大型的只有7处，其余均为中、小型矿床；矿石质量较差，且以贫矿为主，富锰矿储量只占6.4%;矿石组份复杂，矿床多属沉积或沉积变质型，开采利用难度大。锰氧化物的形成包括非生物氧化和生物氧化。Mn(II)的非生物氧化包括化学氧化、表面催化及歧化反应，主要受Eh和pH影响。普遍认为Mn(II)氧化为Mn(VI)由两步组成，先生成Mn(III)，如Mn304、y-MnOOH，然后经歧化或质子化生成Mn(VI)(Teboetal.,1997)。虽然化学氧化Mn(II)离子形成Mn(III)/Mn(IV)矿物是热力学的自发过程，但氧化过程的动力学速度较慢。微生物，特别是细菌可强烈催化Mn(II)的氧化及锰氧化物的生成，使Mn(IV)的生成速率比表面化学催化快得多(快至IO万倍)(Teboetal.,1991;1997;2004)。因此生物氧化被认为是控制环境中锰氧化物形成的主导因素。目前已从海洋和湖泊环境中分离得到了一些锰氧化细菌菌株，并对其中三类模式菌株，即盘状丝发菌(丄印tof/zn'xtfcco;/7ora)SS-l和SP-6、恶臭假单胞菌(尸化w6fowo"w/M^b)MnBl禾QGB-1、芽孢杆菌CSac/〃wsp.)SG-l进行了广泛的研究。研究结果表明，由微生物催化合成的锰氧化物(称为生物氧化锰)与环境中自然形成的锰氧化物具有相似的特征，有许多不同的矿物结构(包括层状的或隧道状的结构)，其主要成份为4价的低结晶态的叶状矿物如水合软锰矿(S-MnOJ，酸性水钠锰矿或似水锰矿等。与人工化学合成的氧化锰矿物相比，生物氧化锰结晶弱，粒径小，Mn价态高，结构中八面体空穴多，因而具有更强的吸附、氧化等表面活性(Toneretal.,2005;2006)。U(VI)进入正在生长的生物锰氧化物，形成与钙锰矿相似的生—物锰矿，而人工合成的层状锰矿却不能发生类似转变(Teboetal.,2004)。Pl^+在盘状丝发菌SS-1生成的锰氧化物上的吸附量远大于人工合成锰矿物(Nelson，etal.,1999a;199%)。恶臭假单胞菌MnBl生成的锰氧化物吸附的Zn"位于空穴的上下方，最大吸附量达4.1mol/kg，与其中的总空穴数非常吻合；生物被膜等在锰氧化物饱和吸附后才吸附Zn2+，吸附量可达总吸附量的38。/。(Tonereta1.,2006)。更多的研究还表明生物合成的锰氧化物对Co2+，Ni2+，A^等金属元素也有较强的吸附能力，是具有极大开发潜能的新型吸附剂、离子交换剂和催化剂材料(Nelsonetal"1999a;2002;Tanietal.,2004;Villalobosetal.,2005)，是目前国际研究的热点领域。具有锰氧化能力的微生物种类丰富，广泛分布于自然环境中，但目前国际上对于锰的生物氧化合成的研究仅限于从海相分离的锰氧化微生物，对土壤铁锰结核来源的锰氧化微生物的研究将为生物合成锰氧化物提供新的菌种资源。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的锰氧化物合成菌株及生物合成锰氧化物的制备方法，为生物氧化锰的合成提供菌种资源和方法，本发明还包括上述菌株的应用。在本发明的一个方面中，本发明提供芽孢杆菌(^7"7/wsp.)WH4菌株，其保藏号为CGMCCNo.2089。在本发明的一个方面中，本发明提供所述菌株用于生物合成锰氧化物的应用。在本发明的一个实施方案中，所述锰氧化物包括锰的氧化物，羟化合物和氢氧化合物。在本发明的另一个实施方案中，所述锰氧化物用于有毒金属元素或有机污染物的治理。在本发明的另一个实施方案中，其中所述锰氧化物用于制备金属元素的吸附剂。在本发明的另一个实施方案中，其中所述锰氧化物用于制备金属元素的离子交换剂。在本发明的另一个实施方案中，其中所述锰氧化物用于制备金属元素的催化剂。本发明实现的技术方案包括如下几个步骤a.细菌分离培养制备寡营养培养基，将铁锰结核样品进行表面消毒后研磨成粉状，以无菌水作10倍系列稀释后涂布于培养基上培养2周后挑取单菌落进行分离纯化。b.锰氧化菌株筛选将纯化的菌株以联苯胺进行显色反应，选取反应阳性的菌株进行锰氧化物合成试验，筛选锰氧化能力较高的菌株。c.扫描电镜观察结合能谱分析(SEM-EDX)确认菌株对锰的氧化能力。d.菌种鉴定形态特征结合16SrDNA序列分析进行。发明的效果经过对大量富集培养的单菌落进行分离纯化及联苯胺测定，共获得3个显阳性菌株，将这3个菌株在含不同浓度MnCl2的液体培养基中培养作进一步筛选，结果如图l所示，在l至40mM的MnCl2浓度范围内，3个菌株(WH4，WH21禾BWH12)都能检测到Mn"的生成，但菌株WH4合成的Mn02的浓度显著高于另外两个菌株，其在20mM的MnCl2浓度下生成的MnC^的浓度最高达2000(iM，对锰的氧化能力为100Mn/天，明显高于文献报道的从水相获得的锰氧化细菌的氧化能力在10mM的初始MnCl2浓度下最高为25-35(iMMn/天(Fernandesetal,,2005)。在40mM的Mn(^浓度下，菌株WH4生成的Mn02浓度较20mM时有所降低，为1719pM;当MnCl2浓度达60mM时，WH4对锰的氧化能力明显降低至45)iM。在自然环境中，Mr严的浓度一般不超过1-5pM，当环境中Mi^+的浓度大于10时，Mr^即对细菌产生毒性而抑制细菌生长(Chapnicketal.,1982)。以往报道的从海相环境获得的锰氧化细菌氧化Mn2+的最佳浓度范围在10-10mM之间(Nealson，2006;Fernandesetal.,2005)。可见，菌株WH4不仅具有较强的锰氧化能力，对锰的耐受能力也很强，可作为锰氧化物合成的良好材料。以往的研究结果显示，锰氧化细菌通过不同的方式如分泌锰氧化因子进入培养基、在细胞膜外形成多糖-蛋白质复合物或通过分布于孢子外壁上的酶参与锰的催化氧化过程(Teboetal.，2004)。扫描电镜结合能谱分析的结果如图2及表1所示，在菌株WH4的菌体上能检测到较高的氧化锰含量，达28.48%。可见菌株WH4能在孢子外壁形成锰氧化物的聚集体，其可能通过分布于孢子外壁上的蛋白因子参与锰的氧化过程。菌种鉴定结果菌株WH4菌落乳白色，在含MnCl2的培养基上培养2周后，由于形成的氧化锰在菌体周围富积，菌落逐渐转变为棕色至褐色，且随培养时间延长菌落颜色加深。革兰氏阳性菌，细胞杆状，大小0.4-0.6pmx1-2(im，产芽孢，芽孢柱状。该菌株的16SrDNA序列与GenBank中序列的同源性分析显示，GenBank中与之序列同源性达90%以上的菌种主要是芽孢杆菌(Sac/〃w)，且芽孢杆菌(5ac/〃wsp.41KF2b,Sac/〃wsp.ROO40B)及短小芽孢杆菌(&c/〃Mp膽z7附)与菌株WH4的序列相似性达100%(表2)，所以确定该菌为芽孢杆菌，暂定名为芽孢杆菌WH4(&"7/wsp.WH4)。图1显示分离到的菌株在不同MnCV浓度下对锰的氧化能力。图2显示芽孢杆菌WH4在含1mMMnCl2的固体培养基上培养20天后的扫描电镜图(5000X)及标记点对应的能谱分析图。其中，箭头所示为标记点。图3显示芽孢杆菌WH4的16SrDNA序列(1460bp)。下面的实施例进一步阐明本发明的方面。然而，它们决不限制如本文给出的本发明的教导或者公开内容。实施例1.材料准备A.寡营养培养基(改进的L2培养基):实施例Peptone(蛋白胨)2gNaCl:8.766gMgS04:6.162g微量元素lmlpH7.5微量元素Yeastextract(酵母提取物)0.5gKC1:0.373gCaCl2:0.555g蒸馏水1L琼脂1.5%(m/v)ZnS04.7H20:44mMCoCl2.6H20:20mMNa2Mo04.2H20:13mM培养基配制完成后以NaOH调节pH至7.5，115'C湿热灭菌30min，待培养基冷却至60。C左右时加入过滤灭菌(0.25)im)的HEPES(pH7.5)和MnCl2溶液，使HEPES和MnCl2的终浓度分别为20mM和1mM。混匀后制备平板。以上述成份不加琼脂配制得相应的液体培养基。B.铁锰结核样品样品取自湖北武汉的粘磐湿润淋溶土亚表层，成土母质为下蜀黄土(Q3)。以无菌镊子将铁锰结核样(直径5-9mm，近球形)从土壤中挑出放入自封袋，于冰上运回实验室，4'C存放。实施例2.细菌分离培养.-将铁锰结核样品用无菌水洗数次去除结核表面土壤，以无菌滤纸吸去多余的水份后，取10g样品以0.P/。的NaC10进行表面消毒1min，再用无菌去离子水洗数次以洗去残余的NaClO，无菌条件下用研钵将样品研磨成粉状，加入10ml无菌水，混匀后取1ml到9ml无菌水作10倍系列稀释后取0.2ml悬液涂布于上述培养平板，25。C培养2周。选取菌落数为30-100的培养皿挑取具有不同菌落特征的单菌落，划线分离培养，培养条件同上。实施例3.具有锰氧化活性的细菌菌株筛选A.联苯胺定性检测新配制的联苯胺(还原态)溶液为淡蓝色，当周围有Mn"存在时，Mn4+将还原态联苯胺氧化后显深蓝色，向平板培养2周的细菌菌苔上滴加1。/。(m/v)的新配制的联苯胺溶液，菌苔随之变为深蓝色者为阳性，表示有Mn"生成。经检测，共获得3个显阳性菌株(WH4，WH21和WH12)。B.LBB(Leukoberbelinblue)显色法定量筛选微生物合成的生物氧化锰主要为水合态或羟基化的Mn02，因此Mn02的含量可以表征合成的生物氧化锰的多少。还原态的Leukoberbelinblue(LBB)在有3价及3价以上的Mn(Mn3+，Mn"或Mn,存在时被氧化显蓝色，在620nm下具有最大吸光值，以KMn04为标准物作标准曲线，按40jLiM的KMnC^相当于100pM的Mn02即可换算得Mn02的含量(Kmmbein&Altmann,1973)。以接种环刮取A中3个阳性菌株的单菌落分别接种到上述液体培养基中培养36小时制得种子液，将种子液分别按2。/。(v/v)的比例接种到含0，1，5，10，20，40，60mMMnCl2的上述液体培养基，于25。C培养20天后分别取样，以LBB显色法测定培养液中Mn02的浓度，以不接种菌液的含相应浓度的MnCl2的上述液体培养基为空白对照，各处理设4个重复。结果参见图l:在l至40mM的MnCl2浓度范围内，3个菌株(WH4，WH21禾nWH12)都能检测到Mn"的生成，但菌株WH4合成的生物氧化锰中Mn(^浓度显著高于另外两个菌株，其在20mM的MnCl2浓度下生成的Mn02的浓度最高达2000^M，对锰的氧化能力为100^MMn/天，明显高于文献报道的从水相获得的锰氧化细菌的氧化能力在10mM的初始MnCl2浓度下最高为25-35Mn/天(Femandesetal.,2005)。实施例4.菌株WH4的扫描电镜观察(SEM)和能谱分析(EDX)刮取在含lmMMnCl2的寡营养培养基固体平板上培养20天的菌苔按生物样品电镜制备要求(应国华，1993)制备样品，进行扫描电镜观察和能谱分析(S-3000N，HITACHICo.,日本)。扫描电镜结合能谱分析的结果如图2及表1所示，在菌株WH4的菌体上能检测到较高的氧化锰含量，达28.48%。可见菌株WH4能在孢子外壁形成锰氧化物的聚集体，其可能通过分布于孢子外壁上的蛋白因子参与锰的氧化过程。表1能谱分析结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注'K指原子K层激发的能量，其余同。实施例5.细菌基因组DNA提取及16SrDNA序列分析以SDS碱裂解一酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，v/v/v)抽提一乙醇沉淀的方法(Maloy,1990)提取细菌基因组DNA。以细菌16SrDNA通用引物(27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG禾口1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，获得片段大小约1500bp的PCR产物，PCR产物纯化后送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。将测得的序列用DNAStar软件包进行序列拼接及人工校对后用NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)BLAST程序在GenBank中进行核苷酸同源性比较。结果显示GenBank中与菌株WH4同源性达90%以上的菌种主要是芽孢杆菌(^"7/船)，芽孢杆菌(万"c///^sp.41KF2b，B""7/wsp，1100408)及短小芽孢杆菌08""7/"^;mwz7w)与菌株WH4的序列相似性达100%(表2)，所以确定该菌为芽孢杆菌，暂定名为芽孢杆菌WH《^^'〃船sp.WH勺。表2菌株WH4的16SrDNA的BLAST分析结果GenBank中最相近的菌种GenBank中的登记号序列相似性芽孢杆菌(Soc;'〃zwsp.)41KF2bAJ8318421430/1430(100%)芽孢杆菌(/5"(:('//1sp.)ROO40BAYim401430/1430(100%)短小芽孢杆菌(5<^///2pw附'7"j)AB0985781430/1430(1000/。将芽孢杆菌WH4(^7c/〃wsp.WH4)于2007年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区北一条13号，中国科学院微生物研究所)，保藏号是CGMCCNo.2089。参考文献1.Casale,R.J,LeChevallier,M.W"Pontius,F.W.2002.ManganeseControlandRelatedIssues.Denver,C.AWWARes.Found.Am.WaterWorksAssoc.187pp.2.ChapnickS.D.，Moore;W.S.,Nealson,K.H.1982.Microbiallymediatedmanganeseoxidationinafreshwaterlake.LimnologyandOceanography27,1004-1014.3.Fernandes，S,O.,Krishnan,K.P.,Khedekar,V,D.,LokaBharathi,P.A..2005.ManganeseoxidationbybacterialisolatesfromtheIndianridgesystem.Biometals18:483-492.4.Hettiarachchi,G.M.,Pierzyrisk:i，G.M.,Ransom,M.D.2000.Insitustabilizationofsoilleadusingphosphorusandmanganeseoxide.EnvironmentalScienceandTechnology34:4614-4619.5.Krumbein,W.E.，Altmann，H..J.1973.Anewmethodforthedetect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