专利名称：大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其制备方法，本发明还涉及所述 大肠杆菌乙醇发酵工程菌在发酵生产乙醇中的应用。
背景技术：
在农作物秸秆和残留物中，纤维素和半纤维素的含量可占到干重的75%以上，将农作 物秸秆进行发酵生产乙醇，是很好的获得乙醇的方式。
纤维素主要是由葡萄糖分子经过e-i， 4糖苷键连接而成的直链分子；半纤维素是包
括木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露和葡萄糖等多种糖分的非结晶异质多聚体，又以木糖的 含量为最高。
大肠杆菌含有利用六碳糖和五碳糖的所有必需酶，可发酵葡萄糖、果糖等六碳糖， 也可以发酵木糖、阿拉伯糖等五碳糖。但是利用野生型大肠杆菌发酵生产乙醇，在产业上
并不可行，原因有二
一是野生型大肠杆菌进行的是混合酸发酵，得到的是多种产物，乙醇在发酵产物中 仅占很少一部分。
其二是野生型大肠杆菌对乙醇非常敏感。在较高浓度乙醇环境下，大肠杆菌细胞膜
构成就会发生变化，生长受到抑制。如30g/L的乙醇已经明显抑制大肠杆菌生长，浓度更
高时，抑制作用更明显。因此不适合进行乙醇发酵生产。
综上，将农作物秸秆进行发酵生产乙醇，并在产业可行，需要解决以上两个难题，
即对大肠杆菌的乙醇代谢途径进行改造，引入高效的乙醇发酵途径，使乙醇成为主要发 酵产物；同时所述菌株必须耐高浓度的乙醇，在高乙醇浓度下仍然保持较高发酵速率。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型大肠杆菌乙醇发酵工程菌，使其在用五碳糖和六碳糖做 底物发酵生产乙醇时在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇转 化率。
本发明用以下两种方式解决了技术问题，得到了一种新型的大肠杆菌乙醇发酵工程
菌
31、筛选得到了高耐乙醇的大肠杆菌突变株；
将大肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定向筛选后获得了乙醇耐性，得到的耐乙醇突变 株可在45g/L的乙醇中生长。
2、对高耐乙醇的大肠杆菌突变株进行了基因改造。
在上述高耐乙醇的大肠杆菌突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和 丙酮酸脱羧酶基因，两个基因在可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac启动 下发生共表达，得到耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。
由于引入同型乙醇发酵途径，控制其细胞内的碳代谢向生成乙醇的方向进行，使得其 发酵主产物为乙醇。
本发明的大肠杆菌乙醇发酵工程菌具体的具体制备方法是
1、 利用大肠杆菌JM109菌株进行耐乙醇筛选，经过几次筛选后涂布到含有异丙醇的 固体LB培养基上，挑选生长迅速的单菌落继续进行乙醇耐受培养，经过多代的定向筛选 后得到可在45g/L的乙醇中生长的耐乙醇突变株ET1。
按照上述筛选过程重复进行菌株的培养和筛选，可以得到的同样的结果，即可以得 到在45g/L的乙醇中生长的耐乙醇突变株。
2、 将包含有SD序列的运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因经过PCR 克隆后连接到pGEM-T easy载体上，经过酶切后置于含有可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识 别的强启动子Ptac的表达载体pZY507上，使得乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大 肠杆菌中发生共转录和共表达，得到大肠杆菌乙醇发酵工程菌。
经实验证实，用本发明所提供的大肠杆菌乙醇发酵工程菌在发酵五碳糖和六碳糖生 产乙醇时，其发酵葡萄糖转化率达到理论产值的86%,发酵木糖的转化率达到理论产值的 78%。
本发明的优点是
1. 以大肠杆菌耐乙醇突变株ET1构建乙醇发酵工程均的初发菌株，使得工程菌在高 浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率；
2. 本发明利用了含有能被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体 使运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌耐乙醇突变株ET1 中共同转录和表达。使得其发酵主产物为乙醇，在提高乙醇产率的同时降低了后续蒸馏过 程中的投入。
具体实施方式
实施例1 耐乙醇大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备 A、大肠杆菌乙醇耐受突变株的筛选
大肠杆菌JM109在LB培养基培养，生长到对数期后转接到含有10g/L、20g/L、30g/L 、 40g/L和50g/L乙醇的LB培养基培养中，(乙醇经过0. 45um的滤膜过滤除菌后加入到LB 培养基中)，30g/L的乙醇浓度己经明显的抑制大肠杆菌JM109的生长。将生长在含有30g/L 乙醇的LB中的JM109经过连续多代的转接，每转接三代后将其涂布到含有异丙醇(不易 挥发同时可以保持乙醇选择压)的固体LB培养基上，选择生长迅速的单菌落继续转接。
以生长在无乙醇的LB培养基中的JM109为对照，通过倍比稀释涂平板计算菌落数和 测定液体LB培养基中OD,的吸光值来测量筛选菌株和对照菌株之间生长速度的差异，经 过12代连续转接筛选以后，得到了和对照没有明显差异的可以在30g/L乙醇的LB培养基 中正常生长的JM109菌株。将该菌株接种到含有35g/L乙醇的LB培养基中继续进行定向 选择，以同样的方法测定其生长速度，直到最后选择得到可以在45g/L的LB中生长的JM109 菌株ET1，继续在高浓度乙醇中筛选没有得到可耐更高浓度乙醇的突变株。
B、运动发酵单胞菌XWIOI乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的克隆 以SEQ ID NO: 1 (5， -GGATCCGTGTTTTGAATATATGGA-3')和SEQ ID NO: 2 (5' -GCATGCTAGA GGAGCTTGTTAACAG-3')为引物，扩增运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因，其产物大小为 翻bp;以SEQ ID NO: 3 (5' -GCGAGCTCAGTATGTAGGGTGAGG-3')和SEQ ID NO: 4 (5' -GTCGACT TAGAAAGCGCTCAGGAA-3')为引物，扩增运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因，其产物大小为 1200bp。并分别克隆到pGEM-T easy (Promeg)载体上，经测序分析后，与已报道的运动 发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的同源性为99%，经过酶切后将"&和 a必5基因连接到表达载体pZY507上得到质粒pZY507bc。 PCR反应体系U." :
10XPCR buffer214
2. 5mMdNTP
10XBSA
50pM gfol
50pM gfo2
模板DNA5ng
5U/WTaq酶0. 25W
加无菌水至
PCR反应条件:1、 94。C预变性 300s
2、 94°C 30s 56 °C 30s 72 °C 60s
(28个循环)
3、 72。C 5min PCR反应体系/ a必历
10XPCR buffer 2W 2.5mMd, 2W 10XBSA 50pM gfol
50pM gfo2 214 模板DNA 5ng 5U/WTaq酶 0. 25W
加无菌水至20W PCR反应条件
1、 94'C预变性 300s
2、 94°C 30s 62 。C 30s 72 °C 40s
(28个循环)
3、 72°C 5min 连接体系与连接反应
2 X buffer 5)4 pGEM-T easy PCR产物 114 L连接酶(3 U/W)
加水至10W， 4'C过夜连接。 C、基于乙醇耐受突变株的大肠杆菌乙醇工程菌的构建
利用氯化钙将大肠杆菌乙醇耐受突变株ET1制成感受态细胞，经热激(42t:90秒，冰 上120秒)转化后，在含有25ug/ml的氯霉素和异丙醇的LB培养基上工程菌株,得到工程菌株ETlbc。
D、运动发酵单胞菌XW101乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的验证 采用B中的引物，以工程菌株ETlbc的质粒为模板(反应条件和反应体系如B中所述)， 可分别扩增到大小约1.2kb和1.8kb的条带，利用RNA试剂盒提取ETlbc的总RNA，经反 转录后PCR扩增到一条3. 0Kb的条带，说明运动发酵单胞菌XW101乙醇脱氢酶基因和丙酮 酸脱羧酶基因在大肠杆菌中做为一个转录单元发生了共转录。
实施例2工程菌株ETlbc发酵生产乙醇
1. 培养条件
1.1培养基成分
葡萄糖10%、酵母浸膏0. 5%、氯化钠1. 0°/。、蛋白胨1. 0%、磷酸缓冲液PH7. 0; 木糖10%、酵母浸膏0.5%、氯化钠1.0%、蛋白胨1.0%、磷酸缓冲液pH7.0;
1.2培养和发酵条件
将ETlbc接种到LB培养基中，培养到0D6。。=0. 2左右时加入1. OmM的IPTG诱导，当ETlbc 生长到0D6。。=1. 0时离心收集菌体，接种到1. 1所述的发酵培养基中，接种后使其ODbo。値 大约为1.0左右，37摄氏度厌氧培养。
2. 发酵液中残留糖的测定
采用高效液相色谱检测发酵液中的残留糖含量，测定条件如下，检测器Waters410 示差折光检测器；柱温35°C;色谱柱大连依利特公司HypersilNH2(4.6mmi.d.X250mm5 um,);流动相V(乙腈)V(水"80 : 20;流速lml min-l ，进样量10um。
3. 乙醇的测定
采用GC-17A岛津气相色谱仪检测发酵液中的乙醇含量，FID检测器。
色谱柱CP-Wax57CB毛细管柱，长50m，内径0.25mm，膜厚0.2um。 色谱条件柱温13(TC。 检测器温度訓。C。 进样器温度18(TC。
载气高纯氮；氢气流速50ml/min;空气500ml/min;尾吹30.0ml/min。进样量0.5ul。
5.试验数据(50ml培养基)10%糖含量
ETlbc葡萄糖 ETlbc木糖
葡萄糖含量(g/L) 乙醇含量(g/L) 木糖含量(g/L)乙醇含量(g/L) 3.21 42.91 "7 40.38
2.26 43.37 2'86 38.33
2.11_^__39.31
平均 2. 52_43.91_^_39. 34
6. 试验结果
以10%的五碳糖或者六碳糖为发酵底物，在37摄氏度的发酵条件下，经过96小时 发酵后，发酵木糖和葡萄糖产率分别达到理论产率的79%和87%。
说明所有利用农作物秸秆进行乙醇生产的技术都是将其经过酶解或者酸解处理成为 五碳或者六碳糖以后再进行发酵的。
7. 试验结论
本发明制备的工程菌在用农作物秸秆等分解后的主要产物五碳糖和六碳糖做底物发 酵生产乙醇时，有较高的乙醇转化率。
权利要求
1. 一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌，其特征是在高耐乙醇的大肠杆菌突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因。
2、 根据权利要求1所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备方法，其步骤如下1)将大肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定向筛选后获得了乙醇耐性，得到高耐乙醇的 大肠杆菌突变株；2)在上述高耐乙醇的大肠杆菌突变株中转入运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和 丙酮酸脱羧酶基因，两个基因在可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac启动 下发生共表达，得到耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。
3、 根据权利要求2所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备方法，所述将大 肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定向筛选是利用大肠杆菌JM109菌株进行耐乙醇筛选， 经过几次筛选后涂布到含有异丙醇的固体LB培养基上，挑选生长迅速的单菌落继续进行 乙醇耐受培养，经过多代的定向筛选后得到可在45g/L的乙醇中生长的耐乙醇突变株。
4、 根据权利要求2所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌的制备方法，所述转入 运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因是将包含有SD序列的运动发 酵单胞菌乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因经过PCR克隆后连接到pGEM-T easy载体 上，经过酶切后置于含有可被大肠杆菌RNA聚合酶高效识别的强启动子Ptac的表达载体 pZY507上，使得乙醇脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因在大肠杆菌中发生共转录和共表达。
5、 用权利要求1所述的耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌在用五碳糖和六碳糖做底 物发酵生产乙醇中的应用。
6、 一种高耐乙醇的大肠杆菌突变株，其特征是将大肠杆菌经过高浓度乙醇多代的定 向筛选后获得了乙醇耐性，可在45g/L的乙醇中生长。
7、 根据权利要求6所述的高耐乙醇的大肠杆菌突变株的制备方法，其特征是利用大 肠杆菌JM109菌株进行耐乙醇筛选，经过几次筛选后涂布到含有异丙醇的固体LB培养基 上，挑选生长迅速的单菌落继续进行乙醇耐受培养，经过多代的定向筛选后得到。
全文摘要
本发明涉及一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。本发明经多代的定向筛选得到了高耐乙醇的大肠杆菌突变株，并在所述突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，得到了一种新型耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。本发明得到的工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时，在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇转化率。
文档编号C12P7/06GK101429488SQ20071017700
公开日2009年5月13日 申请日期2007年11月8日 优先权日2007年11月8日
发明者平淑珍, 维 张, 敏 林, 王占朝, 伟 陆, 明 陈 申请人:中国农业科学院生物技术研究所