专利名称：：一种与衰老或长寿关联的基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种预测衰老或长寿可能性的方法及试剂盒，更具体地说是通过测定人线粒体基因组细胞色素b(Cytob)基因mtDNA15412单核苷酸多态性(SNP)，预测受试者发生衰老或长寿的趋势，该方法可用于衰老的辅助预报、新药开发，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：健康与长寿是生命科学研究的热点，由于遗传学和分子生物学的结合，生物衰老的分子机理研究近年来获得了较大进展，已迈入"基因"时代。许多科学研究以长寿老人作为研究对象，通过细胞及分子水平研究，识别了一些可能影响人类长寿的基因，这些基因对长寿产生了正向或负向影响。同时，人类基因组计划的发展，也为更深入研究这些与人类衰老和寿命相关基因提供了平台。许多群体遗传统计研究表明衰老与长寿过程可能与分化、发育类似，由早己经存在的遗传程序控制。20世纪90年代，对人类长寿相关基因研究，成为遗传学研究的新热点。并且发现、确定并深入研究了一系列人类长寿相关基因，如ApoE、ACE、IGF-1和1ASS1等。线粒体是细胞能量代谢的关键细胞器，随着细胞凋亡及衰老与线粒体基因组关系的建立，特别是人类线粒体基因序列的确定，使得对人类长寿相关基因的研究兴趣从细胞核内基因逐渐扩展到线粒体基因。此外，电子传递过程中产生ATP的同时也生成大量氧自由基ROS(reactiveoxygenspecies),ROS攻击细胞内各种成分，(如膜脂、蛋白和DNA等)最终导致DNA和蛋白质突变的产生。尽管超氧化物歧化酶，过氧化物酶，谷胱甘肽氧化酶等可以修复对DNA的各种损伤，具有一定的防御功能，但仍有部分错误和损伤随年龄的增长而积累，这些突变在细胞、组织、器官水平积累进而影响其功能，产生衰老的表型及相关的老年性疾病最终影响长寿。由于线粒体内大量ROS的产生，使得线粒体基因的SNP位点数量是核内基因SNP数量的3.2倍。通过群体遗传学研究证明这些位点中很大一部分与人类长寿密切关联，例如5178C/A,3010G/A,9055G/A，150C/T等。经对现有国内外文献检索，未见有针对线粒体基因组细胞色素b(Cytob)基因mtDNA15412位点与人类衰老和长寿相关联的研究报道。
发明内容本发明的主要目的是提供一种预测人类衰老及长寿趋势的方法。本发明的第二个目的是提供一组预测人类衰老及长寿趋势的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种预测人类衰老及长寿趋势的方法，通过提取宿主细胞的总DNA，测定受试者线粒体细胞色素b(Cytob)基因第15412位碱基多态性位点的基因型，预测受试者的衰老及长寿趋势线粒体细胞色素b(Cytob)基因15412位点基因型为T时受试者衰老程度高，其长寿的几率较低；基因型为G时，受试者衰老程度较低，其长寿的几率较高。本发明提供了一种分离核酸，具有SEQIDNO:l所示的碱基序列，在第15412位为T，其反义链为A。该核酸序列为人类线粒体基因全序列(轻链)，剑桥参考序列提供的人类线粒体基因组全序列(轻链)，Genbank:REFSEQAC_000021.2gi:115315570，见http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nucleotide&val=l15315570。本发明提供了一组等位基因特异性的引物，具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的碱基序列，长度为19-21bp，而且可以特异性地扩增出SEQIDNO:4所示序列中第15412位的SNP的扩增产物。SEQIDNO:25'-ACCTGAAACATCGGCATTA-3'SEQIDNO:35'-GGAGGATTGTGTAGGCGAATA-3'。特异性引物(SEQIDNO:2，SEQIDNO:3)扩增片断序列为SEQIDNO:4，突变位点以方框注明。TCGCCTACACAATTCTCC本发明提供了一种与人类衰老或长寿关联的基因检测试剂盒，其中含有本发明中特异性扩增细胞色素b(Cytob)基因15412位点的引物对以及用于PCR扩增检测试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常细胞色素b(Cytob)基因第15412位SNP相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括特异性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下本发明试剂盒供20人份检测应用，其组分、含量和来源包括50ul10xPCR缓冲液(Pharmacia),10ul10mMdNTP混合液(Pharmacia),10ul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara),各8ul(50pmol/ul)Fl(SEQIDN02)禾口Rl(SEQIDN03)引物(自制)，1ml纯水(自制)，25ullOx限制性内切酶反应缓冲液(Biolabs)，8ul(10unit/ul)限制性内切酶RasI(Biolabs)。使用方法(1)通过PCR扩增线粒体细胞色素b基因的部分片段，简言之，制备混合液，加入总DNA溶液30ng、2ul10xPCR缓冲液、0.4ullOmMdNTP、0.5ulTaqDNA聚合酶和0.1ul的Fl和Rl分别为有义引物和反义引物，去离子水补足总体积至20ul。PCR反应条件，预变性95。C7min，94°C1min，59°C40sec，72°C1min，进行30个循环，72'C延伸7min。PCR反应完成后，将2ulPCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，如扩增了517bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。(2)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定线粒体细胞色素b(Cytob)基因mtDNA15412位点多态性。向2ul上述扩增的PCR反应产物中加入lul限制性内切酶反应缓冲液、0.3ul限制性内切酶RasI，再加入去离子水使反应体系总体积为10ul，并在37'C水浴中消化过夜。之后，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。(3)多态性测定用限制性内切酶RasI处理片段，当在第15412位碱基是G时，出现339bp和178bp的两条带。如等位基因为T时，仅出现517bp—条带。本发明的测定方法用于测定来源于人的总DNA中的线粒体DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。从总DNA中，可PCR扩增含线粒体基因内突变点的DNA片段，以获得用于测定的大量样本。这种通过扩增含线粒体基因突变点的DNA片段获得的样品，适于用作测定材料，进行后续SNP的识别和分型。这种引物可通过常规方法制备，当按本发明所述制备引物时，可获得适宜的测定样品，其作为扩增的DNA片段，具有特异性长度。进行PCR-RFLP方法时，欲扩增的DNA被设计成含有能适用于此后RFLP方法的特异性酶切位点。即通过酶切割DNA区获得的片段长度的不同，来区分突变型和野生型两种基因形式。因此，根据PCR方法扩增的DNA片段，通过上述选择合理的限制性内切酶得以设计。酶切产生的片段通过电泳证实，它们显示特定的条带。根据在上述方法中获得的带型，可测定线粒体细胞色素b基因mtDNA15412位点的多态性。在进行本发明的基因诊断时，用测定根据线粒体基因存在的突变类型试剂进行诊断，诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于测定线粒体基因突变位点的方法。特定的试剂按采用的测定方法适当地选择。试剂的特点是可用来特异性测定线粒体细胞色素b基因mtDNA15412位点的突变类型必需的，例如DNA片断和作为用于测定的特异性内切酶等。而制备的用于PCR扩增步骤的特定引物，不被认为是本发明诊断试剂的必要成分，但也包含于本发明的诊断试剂之中。本发明的优点是首次阐明了线粒体细胞色素b基因mtDNA15412基因位点多态性与人类衰老和长寿的相关性，提供了一种预测人类衰老和预测长寿趋势的方法，该方法可用于衰老和长寿的辅助判定，还可以用于新药研发。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对
发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制。图1为PCR-直接测序法所得的多核苷酸序列结果经生物信息学比对后识别线粒体细胞色素b基因mtDNA15412SNP标记。图2为为PCR产物经Rsal酶切电泳图谱。其中，2、3泳道为T基因型；4泳道为G基因型，1、5泳道为分子量Marker。图3为RsaI酶切电泳分型方法结果由DNA测序验证图。了线粒体细胞色素b基因mtDNA15412基因位点使用本专利试剂盒基因型分型结果与DNA测序结果一致。具体实施例方式用于下列实施例中表示试剂的英文縮写如下。EDTA:乙二胺四乙酸二钠SDS:十二烷基硫酸钠TEMED:N,N,N，，N'—四甲基乙二胺TE:1MTris-HCl(pH=8.0)1mL，0.5MEDTA200^L，加水至100mL10XPCR缓冲液100mMTris—HCl(pH8.3)，500mMKC1，15mM氯化镁(MgCl2)0.01%(W/V)白明胶dNTP:脱氧核苷三磷酸APS:过硫酸铵—10XTBE:Tris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于纯水中，总体积为l升。实施例1:血液样本收集和总DNA的提取收集来自广西壮族自治区河池巴马长寿区长寿人群，共计208人(男性卯人、女性118人)，平均年龄76岁。广西壮族自治区无亲缘关系健康人群570人(男性252人，女性318人)，平均年龄48岁。根据下列方法，用人外周血制备总DNA。在抗凝剂EDTANa2存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2%NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和lOmMEDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K和lOmg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37X:过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离IO分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3MNaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70X的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至10ng/ul，置-20。C冰箱保存。实施例2:SNP的识别确定本发明采用PCR-RFLP和PCR测序技术同时对线粒体基因中15080位点至15596位点之间的mtDNA15412SNP位点(T/G)进行检测。(1)特异性引物如下SEQIDNO:25'-ACCTGAAACATCGGCATTA-3'SEGIDNO:35'-GGAGGATTGTGTAGGCGAATA-3'(2)通过PCR扩增线粒体细胞色素b基因的部分片段，简言之，制备混合液，加入总DNA溶液30ng、2ul10xPCR缓冲液、0.4ul10mMdNTP、0.5ulTaqDNA聚合酶和0.1ul的Fl和Rl分别为有义引物和反义引物，去离子水补足总体积至20ul。PCR反应条件，预变性95。C7min，94°C1min，59°C40sec，72°C1min，进行30个循环，72'C延伸7min。PCR反应完成后，将2ulPCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，观察在Bio-Rad凝胶成像系统，应用GelDoc2000程序，如扩增了517bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。(3)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定mtDNA15412位点的多态性。简言之，使用F1和R1分别为有义引物和反义引物进行PCR。结果，扩增了517bp的片段。向2ul上述扩增的PCR反应产物中加入lul限制性内切酶反应缓冲液、0.3ul限制性内切酶RasI，再加入去离子水使反应体系总体积为10ul，并在37'C水浴中消化过夜。之后，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用限制性内切酶RasI处理片段，当在第15412位碱基是G时，出现339bp和178bp的两条带。如等位基因为T时,仅出现517bp—条带。实施例3:线粒体mtDNA15412位点与衰老和长寿相关性分析统计方法利用SPSS12.0软件中卡方检验分析mtDNA15412基因位点多态性。并按不同组别进行分层分析，包括长寿群体与对照群体之间、长寿群体与对照群体不同年龄段之间、分别在长寿和对照群体内部不同年龄段之间、百岁老人与群体内部、群体间不同年龄段之间、以及卯岁以上长寿老人与群体内部、群体间不同年龄段之间。统计检验水平设为P=0.05。利用Logistic回归分析计算风险等位基因的分布显著性水平，计算比值比OR值和95%置信区间评价风险贡献率。结果(1)健康年轻人群基因多态性分布按实施例1和2的方法测定健康对照人群中570个样本的基因多态性。15人在第15412位碱基有多态性T变成G。(2)长寿人群基因多态性分布按实施例1和2的方法测定长寿人群208个样本的基因多态性。7人在第15412位碱基有多态性T变成G。(3)长寿人群和健康人群对照组比较长寿人群和健康对照组人群比较在线粒体基因15412位点,T/G多态性的频率分布，详见表1。表l线粒体基因15412位点长寿人群与对照人群年龄段间突变率比较表长寿群体对照群体年龄段人数突变率％年龄段人数突变率％18-39岁60.0018-39岁220.0040-59岁541.8540-59岁5092.7590-99岁981,0260-79岁392.56IOO-岁1216.67一——合计2083.37合计5702.63由表1可见，长寿和对照人群中该点的突变出现年龄较晚，到老年前期才发现且频率较低，对照组人群突变率在2%以上波动，而长寿组人群突变率在1%以上波动，年龄组之间并未出现差异显著性说明该点不是一个增龄性突变位点，即该点突变与年龄增长不相关。同时结果从另一角度也进一步证实了长寿人群线粒体基因突变率低的结论。(4)百岁老人与对照组人群不同年龄段及其与长寿老人比较百岁老人与对照组健康人群不同年龄段差异显著性比较结果，以及与90岁以上长寿老人差异显著性比较结果，详见表2。表2百岁老人与对照组及九十岁以上长寿老人比较表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表2可见，百岁老人在线粒体基因15412位点的突变率为16.67%，与对照群体比较P值为0.004(PO.01)存在差异显著性。而且在百岁老人与长寿人群中卯一99岁长寿老人比较中发现P值为0.032(P<0.05)，证明百岁老人与长寿老人也存在差异显著性。由于百岁老人在线粒体基因15412位点的突变率明显增高，可以推测长寿人群到百岁以后开始迅速衰老，进入极端衰老状态。同时，又由于百岁老人与长寿老人和对照组人群都具有差异显著性，因此可以推断出线粒体基因15412位点可能是百岁老人的标志性位点。实施例4检测试剂盒制备检测衰老相关风险的试剂盒，包含有可扩增出线粒体15412SNP位点的引物对，及其PCR-RFLP相应试剂，如特异性酶等。本发明试剂盒供20人份检测应用，保藏于-2(TC，有效期为6个月；其组分、含量和来源包括50ul10xPCR缓冲液(Pharmacia)，10ul10mMdNTP混合液(Pharmacia)，10ul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各8ul(50pmol/ul)Fl(SEQIDNO:2)禾口Rl(SEQIDNO:3)引物(自制)，1ml纯水(自制)，25ul10x限制性内切酶反应缓冲液(Biolabs)，8ul(10unit/ul)限制性内切酶RasI(Biolabs)。引物SEQIDNO:25'-ACCTGAAACATCGGCATTA-3'SEQIDNO:35'-GGAGGATTGTGTAGGCGAATA-3'经PCR-RFLP检测后，可准确检测出第339位的T—G的SNP。本发明具有实用性的例证本发明中线粒体基因15412位点多态性的检测方法可作为分析人衰老辅助性诊断和对个体是否有长寿的趋势进行评估。利用本发明阐述线粒体基因15412位点碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有表达调节活性的分子，促进延缓衰老新药开发。本发明建立了检测线粒体基因15412位点核酸序列碱基多态性方法和高灵敏度、特异性地应用于人衰老诊断用的试剂盒。如上所述，得出结论，线粒体细胞色素b(Cytob)基因15412位点(T/G)多态性在人群中与衰老和长寿的趋势可能相关。因此，根据本发明，测定此多态性可用于辅助用于基因诊断的参考。本发明叙述了与衰老和长寿相关的新突变点，并提供了一种测定人线粒体细胞色素b(Cytob)基因15412位点(T/G)多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定线粒体细胞色素b(Cytob)基因15412位点(T/G)多态性。总之，本发明提供了一种测定衰老基因多态性的基因诊断方法。序列表<110〉卫生部北京医院〈120>—种与衰老或长寿关联的基因检测试剂盒〈130〉〈160〉4<170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉16569<212〉DNA<213〉人属，人种<400>1gatcacaggtctatcaccctattaaccactcacgggagctctccatgcatttggtatttt60cgtctggggggtatgcacgcgatagcattgcg卿cgctggagccggagcaccctatgtc120gcagtatctgtctttgattcctgcctcatcctattatttatcgcacctacgttcaatatt180已caggcg犯caagtgtgttaattaattaatgcttgtaggacataataata240acaattg犯tgtctgcacagccactttccacacagacatcatttccacca300saccccccctcccccgcttctggccacagcacttaaacacatctctgccaaaccccaaaa360cctaaccagatttcaaattttatcttttggcggtatgcac420ttttaacagtC￡ICCCCCC￡L￡LctaaceicattattttcccctCCC￡LCtCCC￡Lt￡LCt3Ct^t480caacccccgcccatcctaccC3gC3C3C3Cacaccgctgct3acccc3t3540ccccga3cc3acca^cccca^ga^ccccccacagtttatgtagcttacctcctcaaa600gcaatacactga^a^tgttt柳cgggctcELC3tC8CCCCataaacaaataggtttggtc660ctagcctttctattagctctt3gta3g8ttacacatgcaagcatccccgttccagtgagt720tcaccctctaaatxaccacgeitcaaa^ggaacaagcatcaagcacgcagcaatgcagctc780aa犯cgcttagcctagccacacccccacggg犯3cagca^gtgattaaccttta^gca^t犯840acgaaagttta已cta^gctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgc900ggtcacacgattasccc3agtc犯tag^gccggcgta犯gagtgttttagatcaccccc960tccccaataa￡LgCt38L￡L￡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。一种预测人衰老和长寿趋势的方法，通过提取宿主细胞的总DNA，测定受试者的线粒体基因15412位点碱基多态性，检测受试者的衰老以及预测其长寿的可能性线粒体细胞色素b(Cytob)基因15412位点基因型为T，受试者的衰老情况较高其长寿的几率较低；基因型为G时，受试者衰老程度较低，其长寿的几率较高。本发明的优点是首次阐明了线粒体细胞色素b基因mtDNA15412基因位点多态性与人类衰老和长寿的相关性，提供了一种预测人类衰老和预测长寿趋势的方法，该方法可用于衰老和长寿的辅助判定，还可以用于新药研发。文档编号C12Q1/68GK101182584SQ20071017900公开日2008年5月21日申请日期2007年12月7日优先权日2007年12月7日发明者史晓红,雷唐,放孔,亮孙,朱小泉,泽杨,王晓霞申请人:卫生部北京医院