新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产l-赖氨酸的方法

专利名称：新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌的一种新的赖氨酸脱羧酶基因,它与L-赖氨 酸的降解有关，本发明还涉及一种属于埃希氏杆菌属的微生物，这种微 生物对此基因和/或另外一种被称为cadA的L-赖氨酸脱羧酶基因表现 出表达受限。此外还涉及到一种通过微生物生产L-赖氨酸的方法。最 近，对L-赖氨酸作为一种食品添加剂的需求正在迅速增长。技术背景赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸脱羧生成1， 5-戊二胺的反应，这个 酶已知为大肠杆菌L-赖氨酸降解酶。其基因的核苷酸序列(被称为 cadA)和这个基因编码的氨基酸序列已经发表(Meng, S.和Bennett, G. N J RacteHol.. 174. 2659 (1992))。有关除大肠軒菌cadA以外的编码 赖氨酸脱羧酶的基因已有2篇报导，其中描述说，在大肠杆菌突变株中 测到过微弱的酶活性(Goldemberg, S. H : .T. Bacteriol" 141, 1428 (1980); Wertheimer, S. J.和Leifer, Z., Biochem. Biophys. Res. Commun.， 114, 882 (1983))。然而，Goldemberg, S. H.曾报导说此酶活性在60。C加热4 分钟后降低约30%。但是，Wertheimer, S. J.等人的报导则没有观察到 这个现象。由此，第二种赖氨酸脱羧酶的存在是不确定的。另一方面，用大肠杆菌生产L-赖氨酸的已知方法包括:培养对赖 氨酸类似物有抗性的突变抹，或培养携载了带有L-赖氨酸生物合成遗 传信息的脱氧核酸的载体的重组菌抹(日本专利公开No. 56-18596)。 然而没有任何报导涉及用具有赖氨酸脱羧酶基因限制性表达的埃希氏杆 菌属微生物生产L-赖氨酸。发明公开本发明的一个目的是获得大肠杆菌的新的赖氨酸脱羧酶基因;生 成一种属于埃希氏杆菌属的产L-赖氨酸微生物，它对此基因和/或cadA 基因表现出表达限制；提供一种通过培养该埃希氏杆菌属微生物生产L -赖氨酸的方法。本发明人在构建一种已知的赖氨酸脱羧酶基因即cadA复因受到损坏的大肠杆菌菌株时，发现作为赖氨酸脱羧酶降解L-赖氨酸的产物的1,5-戊二胺依然在此菌抹中产生。因此，本发明人推测在大肠杆菌中应存在一种新的赖氨酸脱羧酶基因，而且它可能对通过使用埃希氏杆菌属微生物发酵生产L-赖氨酸产生很大影响。在进行了此基因的克隆实验 之后，本发明人成功地得到了不同于cadi基因的新的L -赖氨酸脱羧酶 基因。另外还发现通过限制此基因和sadA^基因在大肠杆菌L -赖氨酸生 产菌抹中的表达，使L-赖氨酸降解活性显著降低或消失，并使L-赖 氨酸产量明显增加。由此，完成了此项发明。也就是说，本发明提供一种编码大肠杆菌L-赖氨酸脱羧酶的新的 基因。把这个基因命名为基因。另一方面，本发明提供一种产L-赖氨酸的属于埃希氏杆菌属的微 生物，这种微生物细胞内的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。此外，本发明还提供一种生产赖氨酸的方法，这个方法包括在液 体培养基中培养上述埃希氏杆菌属微生物，使之生产L-赖氨酸并积累 于培养液中，然后收集L-赖氨酸。上述属于埃希氏杆菌属的微生物包括这样一种微生物，其细胞内的 赖氨酸脱羧酶活性由于限制l基因和/或cadL基因的表达而降低或消 失。本发明的详细内容叙述如下。 <1>制备含有新的赖氨酸脱羧酶基因的DNA片段含有本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因(ld￡)的DNA片段可从已有 的大肠杆菌菌抹，例如K-12或其衍生菌抹得到。首先，通过聚合酶链式反应(下称"PCR方法，，)从源自大肠杆菌 K-12的W3110株的染色体DNA中获得已知的赖氨酸脱羧酶基因，cadA 基因。cadA^基因的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 5和6中给出。通过使用质粒或噬菌体载体的方法，从大肠杆菌 W3110的染色体DNA文库中克隆与cad&基因序列相似的DNA片段， 以确认是否在这些DNA片段中含有新的赖氨酸脱羧酶基因。可用PCR 方法制备探针进行Southern杂交来确认含有目的基因。确认存在于如此得到的DNA片段中的目的基因核苷酸序列的方法 如下。首先，将此DNA片段与在大肠杆菌细胞中可自主复制的质粒载 体相连接，以制备重组DNA,将其导入大肠杆菌感受态细胞。所得到的转化子在液体培养基中培养，并从增殖细胞中回收重组DNA。用双脱氧 法(Sanger, F.等，Proc.翻Acad sci 74 5463 (1977》检测回收重组 DNA中所含DNA片段的全部核苦酸序列。对DNA结构进行分析以确定 启动子、操纵子、SD序列、起始密码子、终止密码子、开放阅读框架等 所在位置。本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因具有序列表中SEQ ID NO: 3所示 DNA片段中全部核苷酸序列的第1005 - 1007核苷酸ATG到第3141-3143核苷酸GGA的序列。这个基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列在 序列表SEQIDNO: 4中给出。已经发现，新的赖氨酸脱羧酶与cadiL基 因编码的赖氨酸脱羧酶的同源性是69.4%。本发明的基因可以是序列表中SEQ ID NO: 4所给出的赖氨酸脱羧 酶氨基酸序列的编码序列，该基因的核苷酸序列不限于上述核苷酸序 列。本发明的基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列可以有 一个或多个氨 基酸替换、缺失或插入而不会引起赖氨酸脱羧酶活性的实质退化。具有这类缺失、插入或替换的赖氨酸脱羧酶的基因可以从iMii藍的自发突变或人工诱变抹中得到，也可以从大肠杆菌以外的埃希氏属微生物中得 到。对具有SEQIDNO:4氨基酸序列的赖氨酸酶的编码基因实行体外突 变或定点诱变可获得编码这种具有缺失、插入或替换的赖氨酸脱羧酶的 突变基因。这些突变的处理可以按照本领域专业人员所熟知的方法进 行，如下所述。然而，本文涉及的编码含有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的 赖氨酸脱羧酶的基因包括那些来源于"ldc，，基因和可以被认为实质上与 1diL基因相同的基因。这并不是要将此含义延伸到那些不同来源的基因。 也不可能对"多个，，的确切范围做具体描述。但对本领域的专业人员来 说不难理解，例如cadA基因编码与SEQ ID NO: 3有200个以上的氨基 酸残基不同的蛋白质，其与本发明的基因是不同的。而对那些编码有同 样赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质的基因，即使其编码的蛋白质与SEQ ID NO: 3氨基酸序列有2至3个氨基酸残基的差异，仍包括在本发明的范 围内。<2>建立赖氨酸脱羧酶基因表达受限的埃希氏杆菌属微生物本发明的埃希氏杆菌属微生物是一种细胞内赖氨酸脱羧酶活性降 低或消失的埃希氏杆菌属微生物。这种埃希氏杆菌属微生物包括大肠杆簠。其细胞内赖氨酸脱羧酶活性的降低或消失是通过诸如限制新的赖氨酸脱羧酶基因(Mc)和上述已知的cad^基因中任意一个或两个基因的 表达实现的。另外，细胞内赖氨酸脱羧酶活性的降低和消失也可以通过 修饰酶的结构，使这些基因编码的赖氨酸脱羧酶的专 一性活性降低或消 失来实现。限制血基因和已知的cad八复因表达的方法包括例如在转录水平限 制基因的表达。这是通过这类基因的启动子序列中一个或多个核苷酸替 换、缺失、插入、添加或倒位和使启动子活性降低的方式实现的(M. Rosenberg和D. Court, Arm. Rev. Genetics 13 (1979) P. 139, P. Youderian， S. Bouvier和M. Susskind, Cell 30 (1982) P. 843-853 )。另 一种方法是通 过使SD序列和起始密码之间的区域中一个或多个核苦酸发生替换、缺 失、插入、添加或倒位从而在翻译水平上限制这些基因的表达(J. T. Dunn, E. Buzash画Pollert和F. W. Studier, Proc. Nat. Acad. Scj. U. S. A— 75 (1978) P. 2743 )。此外，为使赖氨酸脱羧酶专一性降低或消失，可使用一种方 法，即使编码区的核苷酸序列中一个或多个核苷酸发生替换、缺失、插 入、添加或倒位，从而使赖氨酸基因编码区被修饰或破坏。除上述ld^或cadl基因外，这类允许发生核香酸替换、缺失、插入、 添加或倒位的基因也可以是有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入却不 使其编码的赖氨酸脱羧酶基本活性退化的那些*或cadA基因。引起基因中核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位的方法还包括定 点突变的方法(Kramer, W.和Frits, H. J., Mothods in Engymology.. li4, 350 (1987))，和一种用诸如连二亚硫酸钠和羟胺等化合物处理的方法 (Shortle. D.和Nathans， D., Proc. Natl. Acad Sci. IJ. S. A" 75,270 (1978))。定点突变是一种用合成的寡核苷酸使选择性替换、缺失、插入、添 加或倒位引入到选定的有限核苷酸对的技术。要使用这种技术，首先得 使质粒变性成单链，该质粒中克隆有带特定DNA序列的目的基因。然 后合成与希望的突变部位互补的寡核苦酸。但此方法中合成的寡核苷酸不要有完全互补的序列，而应被设计成具有可任选的核苷酸替换缺失、 插入、添加或倒位。此后，将上述单纟连DNA与有可任选的替换、缺失、 插入、添加或倒位的合成寡核苷酸进行退火。用T4连接酶和DNA聚合 酶I的Klenow片段合成完整的双4连质粒，并导入大肠杆菌感受态细胞。一些如此获得的转化子中的质粒含有这样的基因，其中可任选的核苦酸替换、缺失、插入、添加或倒位被固定下来。重组PCR方法〖PCR Technology, Stockton press (1989))与上述方法类似，也可以引入突变 使基因被修饰或受到破坏。化学试剂法直接用连二亚硫酸钠、羟胺等处理含目的基因的DNA 片段，使其发生随机的碱基替换、缺失、插入、添加或倒位等基因突变。通过用上述诱变中得到的被修饰或被破坏的基因取代埃希氏杆菌 属微生物染色体中的正常基因可抑制细胞中Ml基因和/或cad^基因的 表达。这种取代基因的方法包括使用同源重组(分子遗传实验，冷泉港 实验室出版社(1972 ) ; Matsuyama, S.和Mizushima, S., J. Bacteriol" 162: 1196 (1985))。同源重组基于埃希氏杆菌属微生物普遍具有的能力。当 与染色体有同源序列的质粒等被引入细胞时，在有同源序列的部位就会 发生一定频率的重组，并使整个质粒结合到染色体上。此后若又有重组 在此部位发生，这个质粒就会从染色体上脱落。而有时在此过程中引入 的突变更容易固定在染色体上，这取决于重组的位置，原来的正常基因 与质粒一起脱落。筛选这样的菌抹可以得到染色体上正常基因己被破坏 了的或修饰了的基因所取代的菌株。而通过引入核苷酸替换，缺失，插 入、添加或倒位所造成的突变，就可得到这种被破坏或被修饰的基因。经过基因取代的埃希氏杆菌属微生物具有赖氨酸生产活性。这种有 赖氨酸生产活性的埃希氏杆菌属微生物，比如大肠杆菌微生物菌林可以 通过对没有赖氨酸生产活性的菌抹施以诱变处理而得到。这种诱变处理 可使此微生物具有对赖氨酸类似物如S- (2-氨乙基)-L-半胱氨酸 (下称"AEC，，)具有抗性。这类突变处理方法包括用化学试剂如N-甲基-N'-硝基-N -亚硝泉胍和亚硝酸处理大肠杆菌细胞或用紫外照 射、辐射或类似方法处理大肠杆菌细胞。尤其是，这种微生物菌林包括 大肠杆菌AJ13069 (FERM P14690 )。它由大肠杆菌K-12的W3110菌 抹获得AEC抗性后形成的。大肠杆菌AJ 13069于1994年l2月6日起 保存在国立生命科学和人体技术研究所(邮编305， 1-3, Higashi l-Chome, Tsukuba-Shi,Ibamkiken, Japan)保藏号:FERMP-14690,并于1995年9 月29日按布达佩斯协议转变为国际保藏。保藏号是FERMBP-5252。通过基因重组技术引入并增强携带与L-赖氨酸生物合成有关的遗 传信息的DNA也可以得到产L -赖氨酸活性的大肠杆菌菌株。所引入的基因是编码L-赖氨酸生物合成途径中各种酶的基因，比如天冬氨酸 激酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡咬二羧酸还原酶、琥珀酰二氨基 庚二酸转氨酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶。当基因所编码的酶被L-赖氨酸反馈抑制，比如天冬氨酸激酶或二氩吡啶二羧酸合成酶的情况 下，最好使用突变型基因，这种基因编码的酶对于抑制作用已脱敏。为 了引入和增强这类基因，可以采用 一种方法即将这类基因连接到在大肠 ftj;细胞中可自主复制的载体上，然后转化大肠杆菌以得到重组DNA。 或者也可以通过使用转导、转座(Berg，D. E和Berg, C.M. mfi/Techno1., 丄，417(1983)) , Mu噬菌体(日本专利公开No. 2-109985 )或同源重组(分子遗传实验，冷泉港实验室(19720))将此基因结合到宿主染色体 上。其它荻得携带功能损坏的基因的埃希氏杆菌属微生物的方法包 括用化学试剂如N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍和亚硝酸处理， 或用紫外照射，辐射等处理带有目的基因的埃希氏杆菌属微生物，使其 发生遗传突变^在下面实施例中，带有功能损坏的基因的埃希氏杆菌菌林是通过下 述方法建立的。即，4吏其编码区部分缺失，在缺失部位插入药物抗性基 因。获得的赖氨酸脱羧酶基因可以利用上述同源重组法来代替大肠杆菌 染色体上的赖氨酸脱羧酶基因。在 一 个微生物菌抹中的本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因和cadA复 因的表达产生抑制作用或对其中任一种产生抑制作用都是可能的。可以 在具有L -赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物中限制赖氨酸脱羧酶 基因的表达，或按上面介绍的方法，可以使赖氨酸脱羧酶基因表达受限 的埃希氏杆菌属微生物具备L-赖氨酸生产能力。 <3>利用赖氨酸脱羧酶基因表达受限的埃希氏杆菌属微生物的L-赖氨酸生产通过培养用上述方法获得的具有表达受限赖氨酸脱羧酶基因的埃 希氏杆菌属微生物在培养液中生产和积累可观量的L-赖氨酸。只通过 限制已知的cadl基因表达增加了 L-赖氨酸的积累量。但是，本发明的 新的赖氨酸脱羧酶基因的表达限制对增加L-赖氨酸的收获量更有效。 通过使用eadA基因和本发明的新的基因的表达都受到限制的菌株可达 到L-赖氨酸生产的最理想的效果。凸缘48的开口54稍微突出。由于开口54的位置，各个导管40接近于 凸缘48的内边缘50安置。虽然图3描述的导管40具有圓形截面，导管 40可以具有其它截面，包括但不限于椭圆形和长方形。图4示出了衬管56的示例性的实施例的局部放大图。类似于示于 图3中的衬管12，衬管56的头端58安置于装配凸缘48内。然而，除了 导管壁衬管，衬管56可为通道壁衬管，冷却剂流经矩形或大致矩形 的截面。衬管56的多个通道60由内壁62、外壁64、及板66形成。板66 安置于内壁62和外壁64之间，并弯曲以形成蜿蜒的形状。或者，可 以用多个单个的板66建立不蜿虫延的通道60。内壁62和外壁64之内的 板66作为结果的形成建立了通道60。冷却剂流经内壁62和外壁64之 间的衬管56，但还由通道60分隔。图5示出了衬管68的示例性的实施例的局部放大图。相似于衬管 56，衬管68还为通道壁衬管，通道70具有大致矩形的截面。衬管68 的通道70利用第一盖板72、第二盖板74、及中间壁76形成。第一盖 板72和第二盖板74彼此大致平行地安置，中间壁76安置于其间，并 大致与第一盖板72和第二盖板74正交。通道70由此形成于第一板72、 第二板74、与中间壁76的相交面之间。在示例性的实施例中，通过 将减去形成(subtractive forming)方法应用于第 一板72而形成衬管68的 通道70。例如，可以通过将第二板74焊接于第一板72而建立通道70。通过使用倾倒冷却衬管，倾倒冷却气化器可以减少或排除金属/ 陶瓷连接问题及热增长失配问题。衬管由金属、陶瓷、或陶瓷基质 复合物形成。通过气化器的喷射器将衬管限界在头端，并允许在尾 端自由地悬伸。因为衬管悬伸于尾端，允许其自由膨胀和收缩，以 使衬管的任何热增长不影响气化器的性能或稳定性。冷却剂通过歧 管引导进入衬管，并通过形成衬管的多个通道的导管穿过衬管。衬 管的温度可以由此直接通过控制通过衬管的导管或通道的冷却剂的 流率控制。在冷却剂穿过衬管之后，将冷却剂倾倒进入气化器的容 器内。(PCRTechnology , Stockton press ( 1989 ))的方法做PCR实验时使用此 染色体DNA和这对DNA引物。这样得到的2. lkb片段含有几乎全部cadA 基因。这个片段用随机引物标记盒(Takara Shuzo生产)和[a-"P] dcTP( Amersham Japan生产)进行标记以制备杂交探针。下一步，用制备好的探针和大肠扦菌/Gene Mapping膜(Takara Shuzo 生产)按常规方法进行杂交(冷泉港实验室出版社，第二版(1989))。 Kohara等人的基因文库(大肠杆菌染色体DNA i噬菌体文库见Kohara,. Y.等.，Cell 50: 495-508 ( 1987 ))己事先吸附在大肠杆菌/Gene Mapping 膜上面。在杂交时，通过弱化探针洗脱条件(2xSSC, 55。x30分钟)富 集有类似于cad^基因序列的X噬菌体克隆。结果，除了在含有cad^基 因区(21H11， 5G7)克隆中找到强标记外，还在三个噬菌体克隆E2B8、 6F5H和10F9中成功地发现弱标记信号。三个人噬菌体克隆E2B8、6F5H、 10F9的括入序列是相互交叠连续的大肠杆菌染色体片段。由此，用常规 方法分离出Kohara等人的基因文库中6F5H、噬菌体DNA并进行各种限明，用Hind III酶解得到的5kbp DNA片段中存在与cadA基因序列相似的序列。用T4连接酶将HindIII酶解6F5HX噬菌体DNA所得到的5kbp片段 与质粒pUC19 ( Takara Shuzo生产)Hind III酶解物相连。将此混合物转 化大肠杆菌TM109 ( Takara Shuzo生产)得到在加入50mg/ml氨苄青霉 素的完全平板培养基(10克蛋白胨，5克酵母浸膏，5克氯化钠溶于1 升水中)上能生长的氨节青霉素抗性菌株。由此得到的微生物菌株含有 一插入Hind III酶解6F5HX噬菌体DNA所得5kbp片段的质粒。从这些 细胞中抽提质粒就得到质粒pUC GF5HH5。

图1表示质粒pUC6F5HH5 的结构。含有此质粒的大肠杆菌JM109/pUC6F5HH5被命名为AT13068于 1994年12月6日保藏在国立生命科学与人体技术研究所保藏号是FERM P-14689,关于1995年9月29日按布达佩斯协议转变为国际保藏，其保 藏号是FERMBP-5251。(2)确定新的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列pUC 6F5HH5中Cla I和Hind III限制酶切点之间的核酸序列按分子 克隆(第二版)，冷泉港实验室出版社，1989中描述的方法测定。结果显示此核酸序列编码序列表中SEQIDNO: 3的序列。此DNA序列含有 一开放阅读框架，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示。(3) 制备具有L -赖氨酸生产能力的大肠杆菌大肠杆菌W3110在完全培养基中37。C培养4小时(含10克蛋白胨， 5克酵母浸膏，5克氯化钠，溶于l升水)，得到的微生物细胞用浓度为 200微克/毫升的N-曱基-N'硝基-N亚硝基胍37。C处理30分钟，清 洗，再转到基本平板培养基(含7克磷酸氢二钠，3克磷酸二氬钾，1 克氯化铵，0.5克氯化钠，5克葡萄糖，0.25克7水硫酸镁，15克琼脂溶 于l升水)。其中加入5克/升AEC。经37。C 48小时培养后分离出现 的克隆即得到AEC抗性菌林。WC196抹作为其中之一具有L-赖氨酸 生产能力。WC196菌林被命名为AJ 13069于1994年12月6日保藏在 国立生命科学和人体技术研究所，保藏号是FERM P-14690,并于1995 年9月29日按布达佩斯协议转为国际保藏，保藏号是FERM BP-5252。(4) 建立新的赖氨酸脱羧酶基因功能受损的WC196菌抹用T4 DNA连接酶将上述Hind III酶解6F5H人噬菌体DNA得到的 5kbp片段与Hind III酶解的温度敏感质粒pMAN 031相连接(Yasueda, H. 等)，Appl. Microbiol, Biotechnol. 36 . 211H991))。此反应混合物用于 转化大肠杆菌JM109,然后在加有50毫克/升氨千青霉素的完全培养基 中37。C培养24小时以使氨千青霉素抗性菌林生长。由此得到的微生物 菌林带有插入Hind III酶解的X噬菌体DNA 5kbp片段。从此菌林细胞中 提取质粒得到pTS6F5HH5质粒。将质粒pTS6F5HH5用EcoRV酶解以除 去其中的lkbp DNA片段。然后用T4连接酶将从pHSG 399 (Takara Shuzo)经Accl酶解得到的约lkbp氯霉素抗性基因片段插入其中。由此 构建成质粒pTS6F5HH5 Cm。此操作结果使我们成功构建了含有新的赖 氨酸脱羧酶基因功能受损的DNA片段的质粒。图2表示质粒pTS6F5HH5 结构的质粒pTS6F5HH5 Cm的结构。下一步，采用 一般同源重组技术(Matsuyama, S.和Mizushima, S.， L Racteriol 162 , 1196(1985)),利用质粒pTS6F5HH5Cm的温度敏感性 建立菌抹。在此菌抹中，WC 196染色体上的新的赖氨酸脱羧酶基因被 功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因DNA片段所取代。就是说，用质粒 pTS6F5HH5Cm转化WC 196,先获得在30°C下对青霉素和氯霉素有抗性 的菌林。然后再由此菌抹获得42。C下对氨千青霉素和氯霉素有抗性的菌林。再进一步由此菌林得到s(rc下对氨卡青霉素敏感而对氯霉素有抗性的菌抹。这样建立的菌林，其WC 196抹的染色体上新的赖氨酸脱羧酶 基因被功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因DNA片段所取代。此菌林被 命名为WC 196L。(5)建立cadA基因缺陷型WC196菌株和WC196L菌株已知的赖氨酸脱羧酶基因fcadA-受损的大肠杆菌己为人们所知,包 括例如来源于大肠杆菌K-12的GNB10181菌抹(见Auger, E. A.等人Mol, Microbiol- 2, 609(1989));此菌抹可以从大肠杆菌遗传贝e备中心(Connecticut, USA )得到。已经证明此菌抹的cad^基因区是缺陷的。 因此，GNB10181株的cadA^基因缺陷特点由通用的Pl噬菌体转导方法 转导给WC196从而创建了 WC196C菌林。WC196林的cadA基因缺陷 由核酸印迹杂交确认。此外，带有cad^基因缺陷的WC196LC菌林通过 与上述类似的方法从WC196L建立。实施例2(1) WC1%、 WC16C、 WC196L和WC196LC菌抹的赖氨酸降解活性的确定如上述建立的4个菌林在赖氨酸生产培养基中"r:培养i7小时(培养基含40克葡萄糖，16克硫酸铵，1克硫酸二氢钾，2克酵母浸膏，10 毫克4水或5水硫酸锰，10毫克7水硫酸铁，溶于1升水；pH值用氢 氧化钾调到7.0，然后加30克无菌的碳酸钾)。收集的微生物细胞用生 理盐水洗2次，悬浮在用于检测赖氨酸降解的培养基中(含17克磷酸氢 二钾，3克磷酸二氢钾，0.5克氯化钠，10克L-赖氨酸盐酸盐，溶于1 升水)。37。C培养31小时。图3显示随时间延续，培养基中剩余L-赖氨酸量的变化。L-赖氨 酸量由AS-210 Biotech Analyzer ( Asahi Chemical Industry)测定。可观察 到WC196菌株中L-赖氨酸明显降解。然而在已知赖氨酸脱羧酶基因 fcad^基因缺陷的WC196C菌抹，L -赖氨酸降解度略有下降。在带有功 能受损的赖氨酸脱羧酶基因的菌林WC 196L和Wl96LC中没有观察到L -赖氨酸降解。培养时间达3小时时，任何一种菌林内剩余L-赖氨酸 的量都有下降。但这种下降是因为L-赖氨酸进入微生物细胞内而不是 降解造成的。(2) 由WC196、 WC196C、 WC196L和WC196LC菌株生产L-赖氨酸上述四种菌抹在前述L-赖氨酸生产用培养基中37。C培养20小 时。检测培养液中L-赖氨酸和1，5-戊二胺的产生量和累积量。L-赖 氨酸的量可用前述Biotech Analyser AS-210定量测定。1.5 -戊二胺则用 高压液相层析定量测定。结果如表1所示。与WC196相比，带有功能受损的eadA基因的 WC196C，其L-赖氨酸的累积量增加而作为L-赖氨酸降解产物的1,5 -戊二胺的累积量减少。与WC 196和WC196C相比，带有功能受损的 新的赖氨酸脱羧酶基因的WC196L菌棘也表现同样的结果。而在携带这 两种功能受损的赖氨酸脱羧酶基因的WC196LC菌抹中只检测到L-赖氨酸累积量的进一步增加却检测不到其降解产物1， 5 -戊二胺。表1微生物菌抹 L-赖氨酸累积量 1,5-戊二胺累积量(毫/升) (毫/升)WC196 1.4 0.6WC196C 1.9 0.4WC196L 2.3 0.1WC196LC 3.3 未检测实施例3用含有新的赖氨酸脱羧酶基因的pUC6F5HH5转化具有L-赖氨酸 降解活性消失特点的大肠杆菌WC196LC以使其荻得氨苄青霉素抗性。 WC196LC菌林和WC196LC/ pUC6F5HH5菌抹在添加有5克/升赖氨酸的 生产赖氨酸用培养基中3TC培养16小时，然后检测1,5-戊二胺。结果如表2所示。WC196LC菌抹不能将L-赖氨酸转化成1,5-戊 胺而WC196LC/pUC6F5HH5菌抹有能力将L -赖氨酸转化成1,5-戊二 胺。表2微生物菌株 WC 196LC WC196LC/pUC6F5HH51,5-戊二胺产量(克/升) 0.93工业实用性木发明的新的赖氨酸脱羧酶基因与大肠杆菌的L-赖氨酸降解有 关。培养上述基因和/或cad^基因呈表达限制并具有产L-赖氨酸活性 的埃希氏杆菌属菌林可低成本高效率地生产L-赖氨酸。序列表(1) 一般资料(i) 申请人: AJINOMOTO Co.， Inc.fii) 发明名称NOVEL LYSINE DECARBOXYLASE GENE AND METHOD OF PRODUCING L-LYSINE(iii) 序列数 6(iv) 相关地址 (A)收信人(B) 街道(C) 城市(D) 州(E) 国家:(F) 邮编(v) 计算机可读形式(A) 介质类型软盘(B) 计算机IBM PC兼容型(C) 操作系统PC-DOS / MS-DOS 〖D)软件FastSEQ Version 1.5(vi) 当前申请资料(A) 申请号(B) 提交日期:(C) 分类(vii) 在先申请资斜'.(A) 申请号(B) 提交曰期(viii) 律师/代理人资料(A) 姓名(B) 注册号(ix) 远程通讯资料(A) 电话(B) 电传(2) SEQ ID NO: I的资料(i) 序列特征(A) 长度20个碱基(B) 类型核酸(C) 链型单链(D) 拓朴结构线性(ii) 分子类型其它核酸 (A)描述/desc ="合成DNA，'(iii) 假设无 (i力反义无fix)序列描述SEQ ID NO:l : TGGATAACCA CACCGCGTCT 20(2) SEQ ID NO:2的资料 (i)序列特征(A) 长度20个碱基(B) 类型核酸(C) 链型单链(D) 拓朴结构线性(ii) 分子类型其它核酸(A)描述/desc ="合成DNA "(iii) 假设无(iv) 反义有(ix)序列描述SEQIDNO:2: GGAAGGATCA TATTGGCGTT 2 0(2) SEQ ID NO :3的资料: (i)序列特征(A) 长度(B) 类型(C) 链型ATCGATTCTC GAAGTGCATC GGTGCATGGC GTTCGCCTGG AAAGCTATCG CAAAAAGGTC GGTTACCGCA ACCTTTATCG GAAGCCATTG GTTATCGGTG ATGCTGCAAT AAGAGCGCCG AAAGAACTGA CCGGAAGCGA GTGTTAAGCA GCGTAATTCG TTTGAGCAGG3269个;成基对 核酸 双链(D)拓朴结构线性(ii) 分子类型基因组DNA(iii) 假设无(iv) 反义无 (vi)来源(A) 生物体大肠杆菌(B) 菌抹W3110 (ix) 4征(A) 名称/关键字CDS(B) 位置1005至3143 (ix)序列描述SEQIDNO:3:TAGCCGTCAGTGACTGCGGT GTCTGCGTGA AGATTGCGCA CATTTGATGA TCGGTGGTAT GTGAAACCAA AAGCACTGCG ACACCCCGGG CACGCAACCT AAGGTGGTTC ACAGCACCTA ACAAAGCGCC AACTGATCGA TGGCGGCATC CTGAAGATTT CAAAAGTTCT CTATGATTAAAAAAAGCGTA ACTGGCACGC ATTTGACGAA CGCCCGTCTC AGAAAAAATT TCTGATGCAA GGCTTATCCT GCGTGAAATG TGGCGGTGCG TTCCGTTATC GCTGGCGGCT CTCCATCATC GTTGAAAGCG AAAAAATCGT GAAAAAGGGT GGAAGGATTTGATGAGAAAC GAACTGACAC CATCCACAGC CTGGCTGGCG GATGGTCGTC CGCCGTAACT ATGGCTGAAC GGCGTGGGCG TCTCGCCTCG CTGGCGATTG TCGCCGGAAG GAAGCGATGG CCGGAACCAC CAACTGCTGG CGTTATCAGC CACTTCGGTG TCCAGGAGGATGGATATTAA GTAAAATCTT GTCCTTATAC ACCGCGCGTA CGGTGATGAT TTGGTATGCC GCTTTAAGAT CAGAAGAGCG GCGTACCGGT GCGTGGG.CGA GTTGTGCGTC GTATCATTGC TGGGTGGTGC CGGATCTGGC GCCTGATGAG GCCCTTTTTT ACAC ATG AAC ATC ATT Met Asn工le lieCATCGATGAA CGCCGATCTC CCTGGATTAC TGCAGACGAT CATTGGTCAT AGCGCCAGAA GCCTATCATC TGGTCAGTCT AGTTTGTACG TAAAGTGAAT CATTCTGTGG TCCGCGTCTG TCACCGTAAC CGATCTCGAC CTACGGTTAC ATCGCCACGG60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1016GCCATTATGGGACCGCATGGCGTCTTTTATAAAGATGAGCCCATCAAAAlalieMetGlyProHisGlyValPheTyrLysAspGluProlieLys5101520GAACTGGAGTCGGCGCTGGTGGCGCAAGGCTTTCAGATTATCTGGCCAGluLeuGluSerAlaLeuValAlaGinGlyPheGinlielieTrpPro253035CAAAACAGC.GTTGATTTGCTGAAATTTATCGAGCATAACCCTCGAATTGinAsnSerVa,lAspLeuLeuLysPhelieGluHisAsnProArglie4'04550TGCGGCGTGATTTTTGACTGGGATGAGTACAGTCTCGATTTATGTAGCCysGlyValliePheAspTrpAspGluTyrSerLeuAspLeuCysSer1064111211601208556065GAT AspACC Thr 85 TGG TrpATG MetACG ThrACG ThrTGT Cys 165 TCT SerCAC HisAGT SerATG MetCAT His 245 TGG TrpCGC ArgACG ThrGAT AspCCG Pro 325ATC AAT CAG lie Asn Gin 70CAC TCG ACG His Ser ThrTTT TTT GAA Phe Phe GluCTT AAT Leu AsnCGT CAG Arg GinAAA LysCCG Pro 150 CTG LeuGCC Ala 135 GGG GlyTTT PheTAC Tyr 120 TTG LeuCAT HisTAT TyrATG MetTAT Tyr 105 ACC ThrGAT Asp 90 GCG AlaGAC AspTTT ACC Phe ThrATG GGC Met GlyATT TCG GTC lie Ser ValCTG LeuTAT TyrTAC Tyr 230 AAA !LysGluATC lie 215 GCC AlaGCG Ala 200 GTT ValGCG AlaGAT AspACC Thr 185 GAA GluTTT Phe 170 GAG GluGAG. GluACC AAC Thr AsnCCA TCC Pro SerTCG CTG Ser LeuCTG AAA CCG !Leu Lys ProCGT GAA Arg GluCAA GinGGC Gly 310 TCG SerGCA Ala 295 TTG LeuATT lieTTT Phe 280 CAA GinCTC LeuCAC HisGCG AlaACG Thr 265 ACT ThrCAT His 250 CGT ArgCGC ArgTGG CCG Trp Pro.TAC AAC Tyr AsnTTC GAT Phe Asp 330GAA TAT Glu Tyx 75GTC AGC Val SerCTG GGG !Le.u GlyGAA TAT Glu TyrTAC GTC Tyr Val 140 GGC ACC Gly Thr 155TTC GGC Phe GlyCTT GGT Leu GlyTAC ATC Tyr lieGGA GlyGGC Gly 235 CTG LeuACA Thr 220 AGT SerTTG LeuAAT GCG Asn AlaGAC AGC Asp SerGTT ValACC Thr 315 TCT SerCAT His 300 GAC AspGCC AlaCTC' lieuGTG ValCAG GinCTT Leu 125 AAA !LysGCA AlaGGG GlyTCG SerGCG Ala 205 TCG SerACG ThrATGMe.tTTG LeuATC lie 285 GCG AlaTGG TrpTGG TrpCCG CTT Pro LeuCAG GinGCG Ala 110 GAT AspGAT Asp 95 GAA GluAAC AsnTAT Tyr 80 ATG MetGAT AspATT lieGAG CGG AAG Glu Arg LysTAT TyrAAT AsnTTG Leu 190 CGG ArgCAA GinACT Thr 175 CTC LeuAAA Lys 160 CTT LeuGAC AspACT TTT Thr PheACG TCG AAC Thr Ser AsnCTG LeuATG MetGGG Gly 270 GAA GluTTG LeuAAC Asn 255 ATT lieATC lie 240 GAT AspCTT LeuGAG AAA Glu LysGTG ATC Vsl lieATC AAA 工le LysGTG CCG Val Pro 335ACC ThrCAG Gin 320 TAC TyrGCC AlaCGG Arg.ATC 工leACA ThrTAC Tyr 145 AGC SerAAG LysCAC HisGGC. GlyAAA !Lys 225 GAC AspGTA ValGGT GlyGTC ValAAC Asn 305 ACG ThrACC ThrTTC ATC AAC Phe lie AsnATG MetGCC AlaCCG Pro 130 ACC ThrGCG AlaATT lie 115 CCG ProCTC Leu 100 CGT ArgTTC PheTTT TGT Phe CysCCG GTT GGC Pro Val GlyGCT AlaACC ThrGCG Ala 210 ATT lieGAT AspGGG Gly 195 GAA GluGTC Val 180 CCA ProCAG GinGTG GGT Val GlyCGC AAT TGT Arg Asn CysGTG ValGGG GlyGCT Ala 290 TCC SerCCA ProATC lie 275 GCT AlaGTC Val 260 CCG ProACC ThrACC TAT Thr TyrCTG GAT GTC Leu Asp ValCAT HisTTT PheCAT His 34012561304135214001448149615441592164016881736178418321880192819762024<image>image see original document page 18</image>TTGCCGGAGATGATCATGACGCCACATCAGGCATGGCAACGACAAATT2888LeuProGlu 615MetlieMetThrPro 620HisGinAlaTrpGin 625ArgGinlieAAAGGCGAAGTAGAAACCATTGCGCTGGAACAACTGGTCGGTAGAGTA2936LysGly 630GluValGluThrlie 635AlaLeuGluGin!Leu 640ValGlyArgValTCGGCAAATATGATCCTGCCTTATCCACCGGGCGTACCGCTGTTGATG2984SerMaAsnMet工leLeuProTyrProPiroGlyValProI<eu!LeuMet645650655660CCTGGAGAAATGCTGACCAAAGAGAGCCGCACAGTACTCGATTTTCTA3032ProGlyGluMetLeu 665ThrLysGluSerA;rg 670ThrValLeuAspPhe 675LeuCTGATGCTTTGTTCCGTCGGGCAACATTACCCCGGTTTTGAAACGGAT3080!LeuMetLeuCys 680SerValGlyGinHis 685TyrProGlyPheGlu 690ThrAspATTCACGGCGCGAAACAGGACGAAGACGGCGTTTACCGCGTACGAGTC3128lieHisGly 695AlaLysGinAspGlu 700AspGlyValTyrArg 705ValArgValCTA AAA ATG GCG GGA TAACTTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCTGTT 318 3 Leu Lys Met Ala Gly 710AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 32 4 3GACGGMTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 32 6 9(2) SEQ ID NO:4的资料(i) 序列特征(A) 长度713个氨基酸(B) 类型氨基酸 (D)拓朴结构线性(ii) 分子类型蛋白质 (ix)序列描述SEQ ID NO:4:MetAsnlielieAlalieMetGlyProHisGlyValPheTyrLysAsp151015GluProlieLys 20GluLeuGluSerAla 25LeuValAlaGinGly 30PheGinlielieTrp 35ProGinAsnSerVal 40AspLeuLieuLysPhe 45lieGluHisAsnPro 50ArglieCysGlyVal 55liePheAspTrpAsp 60GluTyrSerLeuAspEeuCysSerAsplieAsnGinLeuAsnGluTyrLeuPro!LeuTyr65707580AlaPhelieAsnThr 85HisSerThrMetAsp 90ValSerValGinAsp 95MetAxgMetAlaLeu 100TrpPhePheGluTyr 105AlsLeuGlyGinAla 110GluAsplieAlalie 115ArgMetArgGinTyr 120ThrAspGluTyr!Leu 125AspAsnlieThrPro 130ProPheThrLysAla 135LeuPheThrTyrVal 140LysGluArgLysTyrThrPheCysThrProGlyHisMetGlyGlyThrAlaTyrGinLys145150155160SerProValGlyCysLeuPheTyrAspPhePheGlyGly AsnThrLeu165170175Lys Ala AspHis Thr Gly 195Gly Ala Glu210 !Lys lie Val 225Asp Arg AsnVal Val ProGly Gly lie 275Val Ala Ala290 Asn Ser Thr 305Thr Leu AspThr His PheArg Val Ala 355Leu Ala Ala370 Asp Glu Glu 385Pro Ser TyrArg Gly Asn!Leu His Phe 435Trp Phe Phe450 Trp Pro Val 465Ala Asp HisGly Met AspLeu Val Ala 515Gly Pro Tyr530 Lys Ala Met 545Asp Leu Asn Asp Pro AspVal Ser 180Pro His Gin Ser Gly MetCysVal 260 ProThrTyrValHis 340 GlyLeuAlaProPro 420 ArgAspAlaMetGlu 500 LysAsnGlyLie.uPhe 580His 245 TrpArgThrAspPro 325 ProLysSerPhelie 405 Gly!LyslieProPhe 485 GinPhe!LeuLeuArg 565 Tyrlie Ser!Leu GluTyr lie 215 Tyr Ala 230Lys SerLeu LysArg GluGin Ala 295 Gly Leu 310Ser lielie TyrVal lieGin Ala 375 Asn Glu 390Val AlaLys ArgGlu ValTrp Gin 455 Gly Glu 470Leu AspGly AsnLeu AspLeu Phe 535 Leu Arg 550lie !Lys Arg AsnVal Thr 185 Ala Glu 200Val ThrAla ProLeu AlaPro Thr 265 Phe Thr 280Gin Trp!Leu TyrHis PheGin Gly 345 Phe Glu 360Ser LeuAls PheSer ValIjeu lie 425 Gin Arg 440Pro ProGin TrpPro ValMet Ser 505 Glu Arg 520Lieu PheGly L>euAsn MetMet Arg 585GluGluAsnSerHis 250 ArgArgProAsnAsp 330 LysThrlieMetGlu 410 AsnLeuGinHisLys 490 GluGlySerThrLeu 570 工leLeu Gly Ser Tyr lie GlyGly 235 LieuAsnAspValThr 315 SerSerGinHisMet 395 ThrArgArgValGly 475 ValGlulie工leGlu 555 ProGinThr 220 SerLeuAlaSerHis 300 AspAlaGlySerlie 380 HisAlaSerGluAsp 460 PheThrGlyValGly 540 PheAspAspAla 205 SerThrMetLeulie 285 AlaTrpTrpMetThr 365 LysThrAlaValGlu 445 GluAsnlielieVal 525 lieLysLeuLeuLeu Leu 190Arg ThrThr SerLeu LeuMet Asn 255 Gly lie 270Glu GluVallieValSer 350 HisGlyThrAlaGlu 430 SerAlaAspLeuPro 510 GluAspArgTyrAla 590lieLysPro 335 GlyLysGluThrMet 415 ArgAspGluAlaThr 495 AlaLysLysSerAla 575 GinAspPheAsnlie 240 AspLeuLysThrGin 320 TyrGluMetTyrSsr '400!LeuAlaGlyCysAsp 480 ProAlaThrThrTyr 560 GluGlylie His Lys Leu 工le Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg595 600 . 605Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met lie Met Thr Pro His Gin Ala Trp610 615 620Gin Arg Gin lie Lys Gly Glu Val Glu Thr lie Ala Leu Glu Gin Leu 625 630 635 640Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met lie Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val645 650 655Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val660 665 670Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gin His Tyr Pro Gly675 680 685Phe Glu Thr Asp lie His Gly Ala Lys Gin Asp Glu Asp Gly Val Tyr690 695 "700Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly 705 710(2) SEQ ID NO :5的资料(i) 序列特征(A) 长度2145个碱基对(B) 类型核酸(C) 链型双链(D) 拓朴结构线性(ii) 分子类型基因组DNA(iii) 假设无(iv) 反义无 (vi)来源(A) 生物体大肠杆菌(B) 菌抹CS520 (ix)对辜征(A) 名称/关键字CDS(B) 位置1至2145(xi)序列描述SEQIDNO:5:ATG AAC GTT Met Asn ValGAA CCC ATC Glu Pro lieATT lieAAT AsnGAG Glu 65 GCG AlaGTT ValGCG Ala 50 CTG LeuTAC Tyr 35 CGT ArgTGC CysTTC GCT Phe AlaATT lieCGT Arg 20 CCG ProCTG LeuGAA GluAAT AsriGCA AlaGAA GluAAC AsnTGC CysGAA GluACG Thr 85ATA lieCTT LeuGAC AspGGC GlyATT lie 70 TAT TyrTTG LeuCAT HisCGT ArgGTT Val 55 AGC SerTCC SerAAT AsnCGC ArgGAC Asp 40 ATT lieAAA LysACT ThrCAC HisGCG Ala 25 GAC AspATG Met 10 CTT LeuTTA LeuTTT GAC Phe AspATG AAC Met AsnGGG GTT Gly ValGAA CGT Glu ArgTTA AAA I;eu LysTAT TTT Tyr PheCTC LeuGAT Asp 90TGG TrpGAG Glu 75 GTA ValGAT Asp 60 AAC AsnAGC SerCTG LieuCTG Leu 45 AAA !LysAAC Asn 30 ATC lieTAT TyrAAA !Lys 15 TTC PheCTG CCG Leu ProCTG AAT Leu AsnGAA GluCAG GinGAA AAC Glu AsnAAT CTC Asn LeuTTG LeuGAC Asp 95TAC Tyr 80 CTG Leu48961"192240288CGT TTA CAG ATT AGC TTC Arg Leu Gin lie Ser Phe 100ATT GCT AAT AAG ATC AAG lie Ala Asn Lys lie Lys 115CTG CCT CCG CTG ACT AAA Leu Pro Pro Leu Thr Lys 130TAT ACT TTC TGT ACT CCT Tyr Thr Phe Cys Thr Pro "5 150 AGC CCG GTA GGT AGC CTG Ser Pro Val Gly Ser Leu 165AAA TCT GAT ATT TCC ATT Lys Ser Asp lie Ser lie 180CAC AGT GGT CCA CAC AAA His Ser Gly Pro His Lys 195AAC GCA GAC CGC AGC TAC Asn Ala Asp Arg Ser Tyr 210AAA ATT GTT GGT ATG TAC Lys lie Val Gly Met Tyr 225 230 GAC CGT AAC TGC CAC AAA Asp Arg Asn Cys His Lys 245GTT ACG CCA ATC TAT TTC Val Thr Pro lie Tyr Phe 260GGT GGT ATC CCA CAG AGT Gly Gly lie Pro Gin Ser 275GTG AAA GAA ACA CCA AAC Val Lys Glu Thr Pro Asn 290AAC TCT ACC TAT GAT GGT Asn Ser Thr Tyr Asp Gly 305 310 ACA CTG GAT GTG AAA TCC Thr Leu Asp Val Lys Ser 325ACC AAC TTC TCA CCG ATT Thr Asn Phe Ser Pro lie 340CGT GTA GAA GGG' AAA GTG Arg Val Glu Gly Lys Val 355TTT GAA TAT GCG CTG GGT Phe Glu Tyr Ala Leu Gly 105CAG ACC ACT GAC GAA TAT Gin Thr Thr Asp Glu Tyr 120GCA CTG TTT AAA TAT GTT Ala Leu Phe Lys Tyr Val 135 、 140GGT CAC ATG GGC GGT ACT Gly His Met Gly Gly Thr 155TTC TAT GAT TTC TTT GGT Phe Tyr Asp Phe Phe Gly 170TCA GTA TCT GAA CTG GGT Ser Val Ser Glu Leu Gly 185GAA GCA GAA CAG TAT ATC Glu Ala Glu Gin Tyr lie 200ATG GTG ACC AAC GGT ACT Met Val Thr Asn Gly Thr 215 220 TCT GCT CCA GCA GGC AGC Ser Ala Pro Ala Gly Ser 235TCG CTG ACC CAC CTG ATG Ser Leu Thr His Leu Met 250CGC CCG ACC CGT AAC GCT Arg Pro Thr Arg Asn Ala 265GAA TTC CAG CAC GCT ACC Glu Phe Gin His Ala Thr 280GCA ACC TGG CCG GTA CAT Ala Thr Trp Pro Val His 295 300 CTG CTG TAC AAC ACC GAC !Leu !Leu Tyr Asn Thr Asp 315ATC CAC TTT GAC TCC GCG lie His Phe Asp Ser Ala 330TAC GAA GGT AAA —TGC GGT Tyr Glu Gly !Lys Cys Gly 345ATT TAC GAA ACC CAG TCC lie Tyr Glu Thr Gin Ser 360GCT GCT GAA GAT 33 6Ala Ala Glu Asp 110ATC AAC ACT ATT 38 4lie Asn Thr工le125CGT GAA GGT AAA 4 32Arg Glu Gly LysGCA TTC CAG AAA 4 80Ala Phe Gin Lys 160CCG AAT ACC ATG 52 8Pro Asn Thr Met 175TCT CTG CTG GAT 57 6Ser Leu Leu Asp 190GCT CGC GTC TTT 62 4Ala Arg Val Phe205TCC ACT GCG AAC 67 2Ser Thr Ala AsnACC ATT CTG ATT 7 20Thr lie Leu lie 240ATG ATG AGC GAT 7 68Met Met Ser Asp 255TAC GGT ATT CTT 816 Tyr Gly lie Leu 270ATT GCT AAG CGC 8 64lie Ala Lys Arg285GCT GTA ATT ACC 912 Ala Val lie ThrTTC ATC AAG AAA 960 Phe lie Lys !Lys 320TGG GTG CCT TAC 1008 Trp Val Pro Tyr 335ATG AGC GGT GGC 105 6Met Ser Gly Gly 350ACT CAC AAA CTG 1104Thr His !Lys Leu365CTG !LeuAAC Asn 385 CCG ProAAA LysATC lieTGG TrpTGG Trp 465 AAC AsnGGG GlyATC lieGGT GlyAAA Lys 545 GAC AspGCG Ala 370 GAA GluCAC HisGGC GlyAAA LysTTC Phe 450 CCG ProGCG TTC Ala PheGAA ACC Glu ThrTAC GGT Tyr GlyAAT AsnTTC Phe 435 TTT PheGCA Ala 420 CGT ArgGAT AspCTG CGT Leu ArgGAG CAC ATG Glu His MetATG MetGTG ValCCG Pro 530 GCA AlaGAA GluGCG Ala 515 TAT TyrAAA Lys 500 AAA !LysAAC AsnCTG AGC Leu SerCTG AAC CTG Leu Asn LeuGAT CCT Asp ProATC CAC 工le HisGCA TTT Ala Phe 610 CAG AAA Gin Lys 625GAA GluAAA Lys 595 GAA GluTTC Phe 580 CTG LeuGTG ValGAG CT,6 Glu LeuTCT SerTTT PheATC lie 405 GGT GlyAAA !LysGTA ValTCT SerTAT Tyr 485 GAC AspTAC TyrCTG !LeuCTG LeuCGT Arg 565 TAT TyrATT lieCTG !LeuCAC HisCAG GinAAC Asn 390 GTG ValGCT Ala 375 GAA GluGCG AlaTCC ATG Ser MetGCC TAC Ala TyrTCC ACT Ser ThrAAG CGT Lys ArgGAG ATC Glu lieTGG TrpGAC. Asp 470 CTT LeuGGC GlyCTC !LeuCTG LeuCTG Leu 550 GTG ValCAG Gin.455 'AGC SerGAC AspACC ThrGAC AspTTC Phe 535 CGT ArgCTG !LeuAAA !Lys 楊 CCG ProATC lie 425 CGT ArgGAT AspATG Met.GAA Glu 520 CTG LeuAGC Ser 505 CAT HisTTC PheGCT CTG Ala LeuAAA AAC ATG Lys Asn MetGAA AAC ATG Glu Asn MetGTT CAC Val HisCCG ACG Pro Thr 615 GGT ATG Gly Met 630CAC His 600 ATG MetACC ThrCGT Arg 585 AAT AsnGTA ValGAA GluATC 工leATG MetGAA Glu 410 AAC AsnCAC HisATG Met 395 ACC .ThrGTT Vsl 380 CAC HisGCT AlaGGT TCT Gly SerACC TGG Thr TrpCCG ATC Pro工leCAT HisCAC HisAAA Lys 490 GAC AspATC lieGGC Gly■ 475 GTC ValGAT Asp 460 TTC PheACC ThrTTT GGT Phe GlyGGC ATC GTT Gly lie ValAGC SerACT ThrCTG Leu 570 ATT lieATC lieGAC Asp 555 CCG ProGGT Gly 540 TTT PheTCT SerCAG GAA Gin GluCTG CCG GAT Leu Pro AspATG MetGAA GluACT ThrGTT Val 635CCG Pro 620 TAC TyrAAA GGT GAC Lys Gly AspACC ACC ACT Thr Thr ThrGCG GCG Ala AlaCTG AGA ACG Leu Arg ThrATT lieGAA Glu 445 ACG ThrGAA Glu 430 TCT SerACT ThrATG Met 415 CGT ArgGAT AspGAA GluAAA AAC ATC Lys Asn lieCTG LeuATT lieGTT Val 525 ATC lieCTG LeuCCG Pro 510 GAG GluACT Thr 495 GCC AlaAAA LysGAT AAG Asp LysAAA CGT GCG Lys Arg AlaCTG TAT Leu TyrCTG LeuCTG Leu 605 TAT TyrGCT Ala 590 ATG MetGCT AlaCGT Arg 575 CAG GinTAT TyrGCA AlaCTC GAC GAA L>eu Asp GluGTA ValTCT Ser 400 ATG MetGCG AlaGGC GlyTGC CysGAT Asp 480 CCG ProAGC SerACC ThrACC ThrTTC Phe 560 GAA GluAAT AsnCGC ArgTTC PheATG Met 64011521200124812961344139214401488153615841632168017281776182418721920GTA GGT CGT ATT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCGVal Gly Arg lie Asn Ala Asn Met lie Leu Pro645 650CCT CTG GTA ATG CCG GGT GAA ATG ATC ACC GAAPro Leu Val Met Pro Gly Glu Met lie Thr Glu660 665CTG GAG TTC CTG CAG ATG CTG TGT GAA ATC GGCLeu Glu Phe !Leu Gin Met Leu Cys Glu lie Gly6"75 680TTT GAA ACC GAT ATT CAC GGT GCA TAC CGT CAGPhe Glu Thr Asp lie His Gly Ala Tyr Arg Gin690 695ACC GTT AAG GTA TTG AAA GAA GAA AGC AAA AAAThr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys705 710 715(2) SEQ IDNO:6的资料(i) 序列特征(A) 长度715个氨基酸(B) 类型氨基酸 (D)拓朴结构线性(ii) 分子类型蛋白质(ix)序列描述SEQ IDNO:6:MetAsnVallieAlalieLeuAsnHisMetGlyVslTyrPhe!LysGlu151015GluProlieArgGluLeuHisArgAlaLeuGluArgLeuAsnPheGin202530lieValTyrProAsnAspAxgAspAspLeuLeuLysLieulieGluAsn354045AsnAlaArglieuCysGlyValliePheAspTrpAspLysTyrAsnLeu505560Glu!LeuCysGluGlu工leSerLysMetAsnGluAsnLeuPro!LeuTyr65707580AlaPheAlaAsnThrTyrSerThrLeuAspValSerLeuAsnAspLeu859095Arg!LeuGinlieSerPhePheGluTyrAlaLeuGlyAlaAlaGluAsp100105110lieAlaAsnLyslieLysGinThrThrAspGluTyrlieAsnThrlie115120125LeuProProL>euThrLysAlaLeuPheLysTyrValArg.GldGlyLys130135TyrThrPheCysThrProGlyHisMetGlyGlyThrAlaPheGinLys145150155160SerProValGlySerLeuPheTyrAspPhePheGlyProAsnThrMet165170175LysSerAsplieSerlieSerValSerGluLeuGlySerLeuLeuAsp180185190HisSerGlyProHisLysGluAlaGluGinTyrlieAlaArgValPhe195200205AsnAlaAspArgSerTyrMetValThrAsnGlyThrSerThrAlaAsn210215220LyslieValGlyMetTyrSerAlaProAlaGlySerThrlieLeulie225230235240TAC CCG CCG GGA GTT 19 68Tyr Pro .Pro Gly Val 655GAA AGC CGT CCG GTT 2 016Glu Ser Arg Pro Val 670GCT CAC TAT CCG GGC 2 0 64Ala His Tyr Pro Gly 685GCT GAT GGC CGC TAT 2112Ala Asp Gly Arg Tyr7002145Asp ArgVal ThrGly GlyVal Lys 290 Asn Ser 305Thr LeuThr AsnArg ValLeu Ala 370Asn Glu 385Pro HisLys Glylie !LysTrp Phe 450 Trp Pro 465Asn GluGly Metlie ValGly Pro 530 Lys Ala 545Asp LeuAsp Prolie HisAla Phe 610 Gin Lys 625Val GlyAsnProlie 275 GluThrAspPheGlu 355 AlaGluTyrAsnPhe 435 PheLeuHisGluAla 515 TyrLeuAsnGlu!Lys 595 GluGluArgCyslie 260 ProThrTyrValSer 340 GlyPheThrGlyAla 420 ArgAspArgMetLys 500 1/ysAsnSerLeuPhe 580 LeuVal lieHis 245 TyrGinProAsp!Lys 325 ProLysSerPhelie 405 GlyLysValSerTyr 485 AspTyrLeuLeuArg 565 TyrlieLeuHisAsn 645!LysPheSerAsnGly 310 SerlieValGinAsn 390 ValLysGluTrpAsp 470 LeuGlyLeulieu!Leu 550 ValGluValProGly 630 AlaSerArgGluAla 295 Leu工leTyx工leAla 375 GluAlaArg工leGin 455 SerAspThrAspPhe 535 Arg!LysAsnHisThr 615 MetAsnLeu Thr His 250Pro Thr Arg265 Phe Gin His 280Thr Trp ProLeu Tyr AsnHis Phe Asp 330Glu Gly Lys 345Tyr Glu Thr 360Ser Met lieAla Tyr MetSer Thr Glu 410Leu lie Asn 425Lys Arg Leu 440Pro Asp HisThr Trp HisPro lie Lys 4 90Met Ser Asp 505Glu His Gly 520Leu Phe SerAla Leu ThrAsn Met Leu 570Met Arg lie 585His Asn Leu 600Met Val MetThr Glu GluMet lie Leu 650LeuAsnAlaValThr 315 SerCysGinHisMet 395 ThrGlyArglieGly 475 ValPhelielieAsp 555 ProGinProThrVal 635 ProMetAlaThrHis 300 AspAlaGlySerVal 380 HisAlaSerThrAsp 460 PheThrGlyValGly 540 PheSerGluAspPro 620 TyrTyrMetTyrlie 285 AlaPheTrpMetThr 365 LysThrAlalieGlu 445 ThrLysLeulieVal 525 lieLysLeuLeuLeu 605 TyrLeuProMetGly 270 AlaVal工leValSer 350His—GlyThrAlaGlu 430 SerThrAsnLeuPro 510 GluAspArgTyrAla 590 MetAlaAspProSer Asp 255lie LeuLys Arglie ThrLys Lys 320 Pro Tyr 335Gly GlyLys LeuAsp ValThr Ser 400 Met Met 415Arg AlaAsp GlyGlu Cyslie Asp 彻 Thr Pro 495Ala SerLys ThrLys ThrAla Phe 560 Arg Glu 575Gin AsnTyr ArgAla PheGlu Met 640 Gly Val 655Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met 660Leu Glu Phe Leu Gin Met Leu Cys 675 680 Phe Glu Thr Asp lie His Gly Ala690 695 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu 705 710lie Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 665 670 Glu工le Gly Ala His Tyr Pro Gly 685Tyr Arg Gin Ala Asp Gly Arg Tyr 700Ser Lys Lys 71权利要求
1.一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，该赖氨酸脱羧酶具有序列表中SEQ ID NO4给出的氨基酸序列。
2. 权利要求l中的基因，其中该基因具有序列表中SEQIDNO: 3 的第1005至3143位密码的核苷酸序列。
3. 权利要求1的基因，其中所述氨基酸序列具有一个或多个氨基 酸残基替换、缺失或插入，但基本上没有任何赖氨酸脱羧酶活性的退化。
4. 一种埃希氏杆菌属的微生物，它具有L-赖氨酸生产能力，并且 其细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，其中细胞内赖氨酸脱羧酶活性 通过权利要求1 - 3任一项中限定的基因和/或cadA基因的表达受限而降 低或消失。
5. 权利要求4的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
6. 权利要求4或5中的微生物，其中基因的表达由于权利要求1 ~ 3中任一权项的基因和/或cadA基因受到破坏而受限制。
7. 权利要求4或5中的微生物，其中权利要求1 3中任一权项限 定的基因和/或cadA基因由于其核酸序列中一个或多个核苷酸的替换、 缺失、插入、添加或倒4立而祐:石皮坏。
8. —种产L-赖氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养一种有L-赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属^f鼓生物的步骤，该微生物的细胞内赖 氨酸脱羧酶活性降低或消失，以便在液体培养基中生产并累积L-赖氨 酸，并收集L-赖氨酸。
9. 权利要求8的方法，其中通过限制权利要求1 3中任一权项限 定的基因和/或cadA基因的表达使细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消 失。
全文摘要
通过在液体培养基中培养埃希氏杆菌微生物高效生产L-赖氨酸。在此微生物中与L-赖氨酸降解有关的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。例如，一种埃希氏杆菌属微生物，其编码赖氨酸脱羧酶的新型基因和/或cadA基因的表达受到限制，使其产生L-赖氨酸并在培养液中积累和从中回收L-赖氨酸。
文档编号C12N9/88GK101220366SQ200710181969
公开日2008年7月16日 申请日期1995年12月5日 优先权日1994年12月9日
发明者児岛宏子, 菊池庆实, 铃木智子 申请人:味之素株式会社