专利名称：：海洋微生物低温淀粉酶及其产生菌交替假单胞菌gs230的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从中国黄海连云港海域的海水中分离得到的交替假单胞菌GS230(尸sewcfoateromo"assp.GS230)CGMCCNO.2156(已于2007年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.2156);本发明还涉及该交替假单胞菌产低温淀粉酶的方法与产品。
背景技术：
：淀粉酶(Amylase)是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，它广泛存在于动植物和微生物中。广泛应用于造纸、食品、医药工业和洗涤剂工业中。普通淀粉酶和高温淀粉酶在淀粉水解工艺处理中温度较高、原料容易变质，制约了淀粉酶的进一步应用。低温酶(Coldtemperature-enzyme)是指在低温条件下能有效催化生化反应的一类酶，最适反应温度比普通酶要低203(TC，而且在(TC有一定的活性。低温淀粉酶酶促作用温度低，在不加热的情况下就可以保证较高的催化效率。另外，在生产中由于低温淀粉酶对热敏感，所以可以通过较低温度的热处理就可以使酶失活，节约了能源。低温淀粉酶的这些特殊性质使其在以下工业生产应用中具有较大优势。低温发酵可生产许多风味食品，节约能源及减少中温菌的污染。如烘焙加工中，低温淀粉酶可縮短生面团发酵时间，提高面团和面包瓤的质量。低温微生物具有高生长速率、高酶活力及高催化效率，可大大縮短处理过程的时间并省却昂贵的加热等系统，在节能方面有相当大的进步。可作为普通淀粉酶的良好替代品，可应用于白酒、葡萄酒、啤酒等酿造、干酪生产、发酵食品的生产中的催熟作用等和动物饲养等行业。低温淀粉酶作为清洁剂的添加剂可节约能源，并能减少衣物扯破及磨损的几率。低温微生物在受污染环境中的生物增殖及接种，低温微生物产生的低温淀粉酶有助于提高对难处理化学物质的生物降解能力。由于这些微生物具有高催化活性酶及它们在较低的适宜温度下的特殊专一性，使得低温微生物及其产生的低温淀粉酶成为生物治理的理想工具。由于低温淀粉酶广泛应用于以上工业，成为应用最为广泛的酶之一，因此对低温淀粉酶的需求量逐年增加，使得低温淀粉酶的需求量大，存在巨大的缺口。目前的低温淀粉酶产量难以满足市场的要求。人们开始从冰山冻土筛选低温淀粉酶产生菌，随着陆地资源的不断开发而面临枯竭，将海洋微生物作为获得活性物质的新来源，成为人们研究的重点。海洋约占地球表面积的71%，其中蕴藏着丰富的微生物资源。特殊而复杂的海洋环境赋予海洋微生物特殊的遗传结构和生活习性，特别是海洋的低温环境可能使海洋微生物产生不同于陆地来源生物低温酶类。国内对低温淀粉酶的研究报道较少，王晓红等从新疆高海拔地区分离得到一株解淀粉类芽孢杆菌(尸m"/Z^c/〃m/^_y/o/,'cw)产低温淀粉酶。张刚从黄海分离到青霉菌(尸^/c/〃wwsp.)产低温淀粉酶。目前国内尚没有海洋交替假单胞菌产低温淀粉酶的报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，通过选育一种新的交替假单胞菌来生产低温淀粉酶。本发明所要解决的另外的技术问题是研究该菌株的生长特性，及其产低温淀粉酶的方法和产品。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明的特征包括交替假单胞菌GS230(尸化wtfofl/feTOmo"ossp.GS230)菌株本身，以及利用该菌株产低温淀粉酶的方法，以及利用该菌株所产的低温淀粉酶产品。本发明所涉及的菌株是在中国黄海连云港海域的海水中分离到的交替假单胞菌GS230(/^ew^a/feAwwo"ossp.GS230)，该交替假单胞菌GS230于2007年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCN0.2156。一、本发明菌株的形态特征与生理生化特征。1.1形态特征对该菌进行不同染色后，显微镜观察该菌为革兰氏阴性杆菌，有荚膜，无芽孢，大小为2.2-2.7|imx0.7-1.3|am。在淀粉固体培养基上的菌落特征直径4mm-7mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，能产生明显的透明圈(见图1-3)。1.2生理生化特征菌株GS230的生理生化特征以及与其它交替假单胞菌的比较见表1-2，该菌氧化酶、过氧化氢酶、VP试验均为阳性，不能发酵葡萄糖，赖氨酸脱羧酶、MR试验为阴性，能产生吲哚，不产生H2S;菌株能利用乳糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、柠檬酸盐、丙酮酸盐，丙氨酸、谷氨酸，而不能利用蔗糖、纤维二糖、蜜二糖。通过Bergey，sManualofSystematicBacteriology(第二版)分析比较菌株GS230与尸^Woa/ferawo"as属内其它种间理化特征，结果显示GS230同Ae^foa/fcram，w的其它菌均有-定相似性，但又不完全相同，结合进化树的结果初步推测该菌为交替假单胞菌的一个新种。表1菌株GS230的生理生化特征特征结果特征氧化酶+聚-P-羟丁酸过氧化氢酶+Na4依赖VP-赖氨酸脱羧酶n引哚+明胶液化酶MR+H2S革兰氏染色-发酵D-葡萄糖"+"为阳性，"一"为阴性表2菌株GS230的理化特征与其它交替假单胞菌的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.3菌株GS230的分子生物学鉴定16SrDNAPCR扩增和序列分析用Takara试剂盒提取DNA模板，并于-40。C保存。正向引物P1:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物P2:5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'。反应体系50pl，Taq酶2U，反应条件为94i:预变性5min，94。C变性30s，54。C退火40s，72。C延伸lmin，35个循环，72t:延伸7min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。扩增菌株GS230的16SrDNA，其长度为1439bp。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比较，发现菌株GS230与尸^wAa/terawo"w的16SrDNA自然类聚。选择与其同源性高于98%的13株菌与GS230进行系统发育的构建，如图4所示。从图中可以看出菌株GS230与尸se"(ioa/妙o附owas1an:ric，/^eMotoa/欣o膨wos"'frea聚为~^群，表明它与这两株菌的亲缘关系最近。1.4菌株GS230的16SrDNA序列见说明书最后部分。因为所有生物的16SrDNA都具有高度的保守性，被称为"细菌化石"，其进化与时间有着密切的关系，采用16SrDNA作为物种的鉴定指标，有着快速、准确的特点。二、本发明菌株的生长特性本发明提供的交替假单胞菌GS230，对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌的生长情况。2.1关于本发明中的培养基2216E培养基(g/L):蛋白胨5，酵母粉l，海水配制，pH8.0。淀粉固体培养基(g/L):可溶性淀粉2，蛋白胨10，牛肉膏5，琼脂20，海水配制，pH8.0。种子培养基(g/L):蛋白胨IO，牛肉膏5，海水配制，pH8.0。发酵培养基(g/L):可溶性淀粉2，蛋白胨IO，牛肉膏5，海水配制，pH8.0。产酶发酵培养基(g/L):可溶性淀粉4，牛肉膏2.5，蛋白胨15,海水配制，pH8.0。微量矿物盐(每升)CuS04.5H20,O.Olg;ZnS047H20，O.lg;CoCl2'6H20,O扁g;MnCl2.4H20,0.2g;Na2Mo04.2H20,O.lg;KBr,0.05g;KI,0.05g;H3B03.O.lg;NaF，0.05g;LiCl，0.05g;A12(S04)3.0,05g;NiCl2-6H20,O.Olg;VoS04-2H20,0.005g;H2W04.2H20，0.002g;Na2Se04,0.005g;SrC1.6H20，0.005g;BaCl2，O德g.2.2种子液的制备将保藏在2216E培养基的斜面菌株接种到发酵培养基中，转速180r/min，装液量20%，25。C培养16h。2.3不同温度对菌株生长的影响将种子液以2%接种量于发酵培养基，pH8.0，转速180r/min，装液量20%，分别在不同温度下培养，每隔一段时间测定细胞浓度，选择在600nm波长下测定OD值，结果发现该菌生长温度范围为crc-3(rc，该菌在25t:下生长最好，高于3(TC生长受到抑制，表明它是一株耐冷菌(见图5)。2.4pH对生长的影响在发酵培养基中加入终浓度为10mmol/L的磷酸醋酸硼酸(1:1:1)作为缓冲液，使发酵培养基的pH分别为3.0-11.0之间，在25"C培养24小时，其他条件同2.2，测定细胞浓度，结果见图6，生长pH范围为5-10，最适生长pH为7.0。2.5NaCl对生长的影响按照2.2方法制备种子液，在发酵培养基(将用海水配制改用微量矿物盐溶液代替，每升培养基加入10ml)中加入NaCl，使之为0%到11%的NaCl,在25t:培养24小时，其他条件同2.2，测定细胞浓度，结果见图6。生长的NaCl浓度为1%-9%，最适生长的NaCl浓度为5%(见图7)。三、产酶条件对酶产生的影响本发明提供的交替假单胞菌GS230产海洋低温淀粉酶，对其产酶条件进行了较深入的研究，研究了不同因素对产酶的影响，在各种单因素优化的基础上，选取了多因素进行了正交试验，最终的优化结果较大的提高了产酶。3.1发酵时间对产酶的影响将种子液接入到发酵培养基中，在25。C、180r/min下，振荡培养36h，每4h取出发酵液测酶活力。结果发现接种后随发酵时间的延长酶活力逐渐升高，发酵24h达到最高，继续延长发酵时间后产酶开始下降，见图8。3.2发酵温度对产酶影响将种子液接入到发酵培养基中，分别在不同温度(15°C、20°C、25°C、30°C、35°C)下进行产酶发酵实验，于180r/min、不同温度下培养24h小时后取出测定酶活。结果显示2(TC时产酶达到最高，高于2(TC后产酶迅速下降，15"C下有较高的产酶量，达到最高产酶的80。％，见图9。3.3培养基pH对产酶的影响用盐酸或氢氧化钠调调节发酵培养基的pH，使培养基的pH在510之间，于2(TC、180r/min下振荡培养24h。实验结果证明随着pH的升高酶产量逐渐增加，当pH达到8.0时产酶量达到最大，pH继续升咼后酶产量迅速下降，在低于pH5.0或高于pH10.0时酶产量均很低，见图IO。3.4装液量对产酶的影响摇瓶装液量分别为10%、15%、20%、25%、30%、40%、和60%进行发酵试验。实验结果发现，装液量太少溶氧过大，对菌体造成伤害不利于产酶，装液量太多溶氧太差，不利于菌体生长，同样降低产酶，结果显示装液量在15%25%时产酶最高，见图ll。3.5不同碳氮源对产酶的影响去除培养基中的可溶性淀粉，分别在培养基加入0.5。^的各种碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、可溶性淀粉、纤维素、马铃薯淀粉)进行碳源对产酶的影响的发酵试验。去除培养基中的蛋白胨、牛肉膏，分别加入0.5%的各类氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米粉、酪蛋白、硫酸氨、硝酸铵)进行氮源对产酶的影响的发酵试验。结果发现，可溶性淀粉最能促进产酶，糊精次之，葡萄糖、蔗糖和纤维素不利于产酶；牛肉膏和蛋白胨有利于产酶，无机氮源和酵母膏、酪蛋白、玉米粉等氮源不利于产酶，见表3。表3培养基中碳氮源对产酶的影响HI相对酶活(％)Sl相对酶活(％)纤维素葡萄糖可溶性淀粉蔗糖糊精马铃薯淀粉5.6士1.413.0±4.7100.0±2.76.6±0.986.1±0.751.8±0.164.7±0.43.6正交试验设计94.9±5.042.7±2.6100.0±3.626.0±2.719.0±1.27.3±3.421.4±3.7胨膏膏铵铵白粉白母肉酸酸蛋米蛋酵牛硝硫酪玉以发酵时间，接种量，可溶性淀粉，牛肉膏，蛋白胨为因素设计正交试验L16(45)进行正交试验。实验结果显示，几个因素共同作用下最佳产酶条件为发酵时间32小时，接种量2.5%，可溶性淀粉0.4%，牛肉膏0.25%，蛋白胨1.5%，与单因素实验有所不同，实验结果见表4。表4正交试验<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>四、低温淀粉酶的性质4.1粗酶液的制备将种子液以2.5%的接种量，接种于产酶发酵培养基，180r/min，2(TC培养32h，10000r/min离心10min，去除菌体，以65%的饱和度向上清液中加入硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于fC下盐析2h，然后再以12000r/min离心20min，用25mM的Tris-HCl将沉淀溶解，在含有5mMCa2+的25mM的Tris-HCl溶液中4。C下透析8h，中间换一次透析液，结束后以10000r/min离心10min，除去杂质，所得上清液即为粗酶液，可置于-4(TC冰箱保存。4.2酶作用温度对酶活性的影响将酶分别在0。C、4°C、10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40。C和50。C下，用pH8.0的Tris—HC1溶液(50mM)配制的1%淀粉溶液作为底物进行酶活测定，结果见图12，酶最适作用温度为30°C,酶在低温时仍然保持一定的酶活力，酶活下降缓慢，在0。C仍有28y。的催化效率。4.3酶的热稳定性取适量酶液(添加或不添加Ca2、终浓度分别在lmM禾B5mM)分别在不同温度(25°C，30。C，35°C)下保温2.5h，每隔0.5取出一组样品，迅速置于(TC冰水混合物内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理的酶液的酶活设为100%结果见图13-15，酶热稳定性的研究在低温下具有较好的热稳定性，25。C保温2.5h，残余酶活力超过80%，温度升高后酶的热稳定性很差，3(TC时的半衰期为1.5小时，35。C保温1.5h酶完全失活，Ca2+可以显著提高酶的热稳定性，当酶液中含有lmM的C^+时3(TC保温1.5h残余酶活接近80%，当酶液中含有5mMCa^时，3(TC保温1.5h残余酶活为93%。4.4酶的作用pH对酶活性的影响以不同pH缓冲液配制的1.0%的可溶性淀粉溶液作为底物，3(TC下进行酶活力测定，不同pH值的缓冲液为50mM乙酸钠缓冲液(pH4.06.0);50mM磷酸钠缓冲液(pH6.08.0);50mMTris-盐酸缓冲液(pH8.09.0);50mMGly-NaOH(pH9ll)。结果见图16，随着pH的升高酶活性呈上升趋势，pH8.0时，酶活性达到最高，之后酶活性开始下降，pH9.0时相对酶活不到60/0。4.5酶的pH稳定性将蒸馏水透析过夜的酶液与50mM的不同pH缓冲液以1:4的比例混匀，于30。C下保温lh,测定残余酶活力，以未处理的酶液的酶活设为100%,不同pH值的缓冲液同酶的作用pH—致。结果见图17，随着pH升高酶的稳定性增强，当pH8.0时酶的稳定性最好，pH6.0-9.0酶稳定性较好。4.6金属离子、化学试剂对酶的作用将各种金属离子与pH8.0的Tris—HCl溶液(50mM)配制的1%淀粉溶液，使其终浓度分别达到lmM和5.0mM，然后在3(TC下测酶活。将各种化学试剂与pH8.0的Tris—HCl溶液(50mM)配制的1%淀粉溶液混匀，使其终浓度分别为5mM和10mM，3(TC测酶活。结果发现不同离子对酶的反应活性有着不同的影响，其中Na+、K+、Ba2+、Mg2+、C^+对低温淀粉酶有着一定的激活作用，而Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+、F^+对低温淀粉酶有着较强强的抑制作用(见表5)。在几种化学试剂对低温淀粉酶的影响实验中发现EDTA、SDS、I-HAC、TCA对酶都有较强的抑制作用，DTT对酶有一定的激活作用，见表6。表5金属离子对蛋白酶活力影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表6化学试剂对蛋白酶活力影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>4.7淀粉酶活测定。①淀粉酶活测定方法将10ul酶液加入到190ul1。/。的可溶性淀粉Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)中，在30。C水浴中反应15min,用DNS测定还原糖②酶活力单位定义在3(TC、pH8.0的条件下每分钟水解淀粉产生lug葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。图1为菌株电子显微镜镜检图。图2为菌株革兰氏染色的光学显微镜镜检图。图3为菌株在淀粉固体培养基上的透明圈图。图4菌株16SrRNA进化树分析图。图5为温度对菌株生长的影响图。图6为pH对菌株生长的影响图。图7为氯化钠对菌株生长的影响图。图8为发酵时间对产酶的影响图。图9为发酵温度对产酶影响图。图10为培养基pH对产酶的影响图。图ll为装液量对产酶的影响图。图12为酶作用温度对酶活性的影响图。图13为酶的热稳定性图(25°C(A)5mMCa2+，(醒)lmMCa2+,(noCa2+)。图14为酶的热稳定性图(30。C(A)5mMCa2+,0i)lmMCa2+,(令)noCa2+)。图15为酶的热稳定性图(35°C(▲)5mMCa2+，(>)lmMCa2+,(>)noCa2+)。图16为pH对酶活性的影响图，()50mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.06.0,(國)50mmol/L磷酸钠缓冲液pH6.0~8.0,(▲)50mmol/LTris-HCl缓冲液pH8.0~9.0，(x)50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH9~ll。图17为酶的pH稳定性图，()50mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.06.0，(画)50mmol/L磷酸钠缓冲液pH6.0~8.0,(▲)50mmol/LTris-HCl缓冲液pH8.09.0,(x)50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH9~ll。具体实施例方式实施例1。参照图l-17。一种交替假单胞菌GS230(i^ewctoa/feramo"assp.GS230)CGMCCNO.2156。该菌株具有以下特征为革兰氏阴性杆菌，有荚膜，无芽孢，大小为2.2-2.7pnx0.7-1.3|mi;在淀粉固体培养基上的菌落特征直径4mm-7mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，能产生明显的透明圈；其生理生化特征为，该菌氧化酶、过氧化氢酶、VP试验均为阳性，不能发酵葡萄糖，赖氨酸脱羧酶、MR试验为阴性，能产生吲哚，不产生H2S;菌株能利用乳糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、柠檬酸盐、丙酮酸盐，丙氨酸、谷氨酸，而不能利用蔗糖、纤维二糖、蜜二糖。实施例2。实施例1所述的交替假单胞菌GS230CGMCCN0.2156，该菌生长温度范围为0。C-3(TC，属耐冷菌；生长pH范围为5-10;生长的NaCl浓度为范围1%-9%。实施例3。实施例1所述的交替假单胞菌GS230CGMCCNO.2156，该菌适合生长温度为25°C，适合生长pH为7.0，适合生长的NaCl浓度为5%。实施例4。一种如实施例1-3中任何一项所述的交替假单胞菌GS230CGMCCNO.2156产低温淀粉酶的方法，其步骤如下，将种子液以2.5%的接种量接种于产酶发酵培养基，180r/min，2(TC培养32h，10000r/min离心10min，去除菌体，以65%的饱和度向上清液中加入硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4TT下盐析2h，然后再以12000r/min离心20min，用25mM的Tris-HCl将沉淀溶解，在含有5mMCa2+、25mM的Tris-HCl溶液中4°C下透析8h，中间换一次透析液，结束后以10000r/min离心10min，除去杂质，所得上清液即为低温淀粉酶。实施例5。一种如实施例4所述的方法所产低温淀粉酶，所述的低温淀粉酶的理化性质为低温淀粉酶的适合作用温度为3(TC，酶在低温时仍然保持一定的酶活力，在低温下具有热稳定性，25。C保温2.5h，残余酶活力超过80%，Ca^可以显著提高酶的热稳定性；适合作用pH8.0，pH6.0-9.0酶具有稳定性；Na+、K+、Ba2+、Mg2+、(^2+对低温淀粉酶有着一定的激活作用，Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+、Fe3+对低温淀粉酶有抑制作用；EDTA、SDS、I-HAC、TCA对酶有抑制作用，DTT对酶有激活作用。〈110〉淮海工学院〈120〉海洋微生物低温淀粉酶及其产生菌交替假单胞菌GS230<160〉1〈210〉1〈211〉菌〈212〉RNA〈213〉交替假单胞菌GS230(Pseudoalteromonassp.GS230)〈400〉1ctttgctgaccaacagttggtctcgcctttgcgacgatccagsctcctaccatgccgcgtttagtggttatgccagcagccgtacgcaggtttcgaactgatgcgt卿gctcatgtBCgacgatgtctagaccgcctggaagcggtggatacagag犯cggctgtcgtcatccttagtt鄉鄉gtggacaatggcgccgtagtccggtatcag朋tgggagtgggttt已gtttagcagcggcggaja犯cgactgcagattggcccctagctggttgtgtg犯g犯eitacccgttscgcggtaatacggtttgttagcaaactagaatctgaagga咖gcgtgggctagaagctcggagtacggcgcatgtggttagctcgtgttgctagc郷tggacgacgtcatacagagtgattggagtctacgcggtgaagctcctgaag1388cgggtgagtataataccgcaaagtgggatttg卿ggatgggccttcggggctgtgacgtcggagggtgcagcg卿tgtgtgtgat卿ataccgatggg3gC犯3Cggggagcctcggcgcaaggttatggtttggtggtg卿tgttaatgctg已gaaagtcatcatctgcgaactcgcaactxgactacgttcccgtttatagtctatgcttgggat组gtctacagctagttggatcagccacattgtaaagcatactgacagag3gcgttaeitgaaagccccggggtggt卿Cg犯ggC3gCgattagatacwtctgtttttaaactcaaatcaacgcgasgccttcgggaagggtt鄉tcactctaaggaggcccttacggcgaaagtaatccatgaagtggccttgtacgccctggggaacatgccttgaggtggggga60ggaccaaagggggcttcggc120tgaggtaatggctcaccaag180ctgggactgagacacggccc240gggcgcaagcctgatgcagc300ctttcagtcaggaggaaagg360agaagcaccggctaactccg420cggaattactgggcgta卿480ggctcaacctggggiactgCEi540atttcaggtgtagcggtgaei600cacctgggtcaacactgacg660cccggtagtccacgccgtaa720caaagct幼cgcattaagta780gaattgacgggggcccgcaic840aaccttacctacacttgaca900ctctgatacaggtgctgcat960ccgcaacgagcgcaacccct1020gactgccggtgataaaccgg1080tgtagggctacacacgtgct1140gcgaatcacttaaagtgcgt1200cggaatcgctagtaatcgcg1260acaccgcccgtcacaccatg1320aacaagtaagcacggg卿g1380权利要求1.一种交替假单胞菌GS230(Pseudoalteromonassp.GS230)CGMCCNO.2156。2.根据权利要求1的交替假单胞菌GS230CGMCCNO.2156，该菌株具有以下特征为革兰氏阴性杆菌，有荚膜，无芽孢，大小为2.2-2.7μmx0.7-1.3μm;在淀粉固体培养基上的菌落特征直径4mm-7mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，能产生明显的透明圈；其生理生化特征为，该菌氧化酶、过氧化氢酶、VP试验均为阳性，不能发酵葡萄糖，赖氨酸脱羧酶、MR试验为阴性，能产生喷哚，不产生H》；菌株能利用乳糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、柠檬酸盐、丙酮酸盐，丙氨酸、谷氨酸，而不能利用蔗糖、纤维二糖、蜜二糖。3.根据权利要求1的交替假单胞菌GS230CGMCCN0.2156，其特征在于，该菌生长温度范围为0°C-30°C，属耐冷菌；生长pH范围为5-10;生长的NaCl浓度为范围1%-9%。4.根据权利要求1的交替假单胞菌GS230CGMCCN0.2156，其特征在于，该菌适合生长温度为25'C，适合生长pH为7.0，适合生长的NaCl浓度为5%。5.根据权利要求1的交替假单胞菌GS230CGMCCNO.2156，其特征在于，该菌株16SrRNA序列为ctttgctgaccagcggcggacgggtgagtaatgcttgggaacatgccttgaggtggggga60caacagttggaaacgactgctaataccgcataatgtctacggaccaaagggggcttcggc120tctcgcctttagattggcccaagtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaag180gcgacgatccctagctggtttgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggccc240agactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagc300catgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcacttteagteaggaggaaagg360ttagtggttaatacccgttagctgtgacgttactgacagaagaagcaccggctaactccg420tgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaag480cgtacgcaggcggtttgttaagcgagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgca560tttcgaactggcaaactagagtgtgatagagggtggtagaatttcaggtgtagcggtgaa620atgcgtagagatctgaaggaataccgatggcgaaggcagccacctgggtcaacactgacg680ctcatgtacgaaagcgtggggagcaaacgggattagataccccggtagtccacgccgtaa720acgatgtctactagaagctcggagcctcggwtctgtttttcaaagctaacgcattaagta780gaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcac840aagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctacacttgaca900tacagagaacttaccagagatggtttggtgccttcgggaactctgatacaggtgctgcat960ggctgtcgtcagctcgtgttgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccct1020atccttagttgctagcaggtaatgctgagaactctaaggagactgccggtgataaaccgg1080aggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgtgtagggctacacacgtgct1140acaatggcgcatacagagtgctgcgaactcgcgaaagtaagcgaatcacttaaagtgcgt1200cgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcg1260tateagaatgacgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatg1320ggagtgggttgctcctgaagtttatagtctgccctggggaaacaagtaagcacgggagag1380tagtttag13886.—种如权利要求1-5中任何一项所述的交替假单胞菌GS230CGMCCNO.2156产低温淀粉酶的方法，其特征在于，其步骤如下，将种子液以2.5%的接种量接种于产酶发酵培养基，180r/min，20。C培养32h，10000r/min离心10min，去除菌体，以65%的饱和度向上清液中加入硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4i:下盐析2h，然后再以12000r/min离心20min，用25mM的Tris-HCl将沉淀溶解，在含有5mMCa2+、25mM的Tris-HCl溶液中4"C下透析8h，中间换一次透析液，结束后以10000r/min离心10min，除去杂质，所得上清液即为低温淀粉酶。7.—种如权利要求6所述的方法所产低温淀粉酶，其特征在于，所述的低温淀粉酶的理化性质为低温淀粉酶的适合作用温度为30°C，酶在低温时仍然保持一定的酶活力，在低温下具有热稳定性，25°C保温2.5h，残余酶活力超过80%，Ca2+可以显著提高酶的热稳定性；适合作用pH8.0，pH6.0-9.0酶具有稳定性；Na+、K+、Ba2+、Mg2+、C对低温淀粉酶有着一定的激活作用，Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+、Fe3+对低温淀粉酶有抑制作用；EDTA、SDS、I-HAC、TCA对酶有抑制作用，DTT对酶有激活作用。全文摘要本发明是一种交替假单胞菌GS230(Pseudoalteromonassp.GS230)CGMCCNO.2156。该菌株能够在4℃下生长，其生长温度范围为0-30℃，最适生长温度为25℃；生长pH范围为5-10，最适生长pH为7.0；生长的NaCl浓度为1％-9％，最适生长的NaCl浓度为5％，属于海洋耐冷菌。本发明还公开了一种利用交替假单胞菌产低温淀粉酶的方法及按该方法得到的低温淀粉酶产品。该低温淀粉酶可应用到焙烤业用于产生风味物质，可以与蛋白酶混合后直接室温洗涤，节省能源；且在饲料、纺织、环保、医药等领域也具有广泛的应用前景。文档编号C12N1/20GK101200699SQ20071019040公开日2008年6月18日申请日期2007年11月21日优先权日2007年11月21日发明者殊刘,刘红飞,吕明生,房耀维,王淑军,丽陈申请人:淮海工学院