一种与水稻抗条纹叶枯病基因连锁的分子标记的制作方法

专利名称：一种与水稻抗条纹叶枯病基因连锁的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与水稻条紋叶枯病抗病基因相连锁的分子标记，可应用于分子标 记辅助育种，属于水稻抗病育种和分子生物学领域。
技术背景水稻条紋病毒(RSV)引起的水稻条紋叶枯病最早于l897年在曰本关东发现，后在 朝鲜、乌克兰和中国均有发生。我国自1962年在江浙发现该病毒以来，已经在全国l6 个省、巿、自治区发生，目前以江苏省为主的长江下游稻区仍处于流行期。据不完全 统计，仅2004年江苏省水稻条紋叶枯病发生面积就达2700万亩，占江苏省水稻面积 的79%,专家预计2006后的五年内水稻条紋叶枯病仍将呈偏重发生趋势，预防工作刻 不容缓。国外的防治经验表明，针对这一病害最经济而有效的方法是选用抗病品种。然而 目前病区生产上使用的水稻品种大多以感病材料为主，品种抗性改良和大面积的品种 更替势在必行。前人的研究水稻条紋叶枯病抗性有单基因和两对基因控制等遗传模式， 而其中以来源于籼稻品种Modan的位于第十一染色体的Stv-bi单基因控制的抗性表现最强，以该位点为抗病基因导入目标是当前首选的品种选育策略。目前水稻条紋叶枯 病的研究者多借鉴曰本60年代建立的室内鉴定方法，但该方法技术门槛高、费时费力 的特点使其不适于抗病育种中大量材料的抗性初筛。另一方面水稻条紋叶枯病田间抗 性鉴定往往表现出较差的稳定性和重复性。抗性鉴定方法的技术瓶颈也是导致水稻条 紋叶枯病的抗病育种进展缓慢的重要原因。而近年来随着分子生物学的不断发展为复 杂的抗病品种选育提供了新的思路，如邓其明等通过常规回交育种结合分子标记辅助 选择技术将来自IRBBM的Xa21和Xa4两个抗白叶枯病基用聚合到感病的杂交稻恢复 系绵恢725中，分子标记技术已成为辅助育种的重要手段。武育粳3号是水稻条紋叶枯病病区推广面积最大的感病品种，其因为高产优质的 栽培特性和口感优良的特点深受生产者和消费者的喜爱，是用于品种改良的最佳候选 品种之一，而镇稻88是目前生产上使用的对条紋叶枯病抗性表现最为稳定的抗病品种,同时也是江苏省水稻品种区试中条紋叶枯病抗性鉴定试验的预设抗病对照，是理想的 抗源材料，其中含有Stv-b'(《江苏农业科学》2005， (5) :22-23 ),以这两个品种及其衍生品种为亲本进行抗病品种的选育不仅可以克服籼粳亚种间杂交不育的缺点，而且 由于其本身为主栽品种的特性可以加快选育进程，因此以这两个品种为材料筛选的抗性基因连锁标记，可望直接应用于抗病品种的选育，以提高逸择效率和加快育种进程。 发明内容本发明针对上述研究背景，以武育粳3号/镇稻88的F,群体为作图群体，通过抗 病性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，获得了与水稻条紋叶枯病抗性基因连锁 的SSR标记RM229,该标记可应用于水稻条紋叶枯病抗病品种的辅助选择育种。本发明所提供的与水稻条紋叶枯病抗性基因连锁的SSR标记RM229，是通过以下 方法获得的1) 以感病品种武育粳3号为母本，抗病品种镇稻88为父本，构建F2定位群体， 分单株收获Fu家系的种子用于抗性鉴定；2) 以SDS方法提取亲本、F,及F,代的DNA;3) 根据http:〃www. gramene.org相关信息合成SSR引物，PCR后采用8%的非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记数据；4) 以携带水稻条紋病毒的灰飞虱为接种体，采用单分蘖接种鉴定方法，测定F2 植株抗病性，以发病与否区分为抗病和感病；5) 以携带水稻条紋病毒的灰飞虱为接种体，采用苗期接种鉴定方法，测定F^株 系抗病性，按发病率划分抗性水平，0_10%为抗病，10. 1-30%为中抗，30. 1%以上 为感病；6 )结合4 )和5 )结果，确定F2植株抗病性；7)根据连锁遗传定律，按照MapmakerEXP3. Ob软件的要求，将与父本镇稻88相 同的带型赋值为"A",与母本武育粳3号相同的带型赋值为"B"，与F,代相同的带型 赋值为"H"，带型不清楚或缺失的赋值为"一"，用Kosambi函数算出遗传距离。与水稻条紋叶枯病抗病基因连锁的SSR标记RM229的应用包括在以镇稻88及其 衍生品种(系)与武育粳3号及其衍生品种(系)为亲本的杂交组合的后代单个水稻 植株为对象，通过检测其RM"9标记的带型数据，可以预测该植株对水稻条紋叶枯病 的抗性。本发明能克服常规育种中水稻条紋叶枯病抗性鉴定稳定性和重复性较差、费时费 力和技术门槛高等缺点，其结果可以简化选择方法和提髙育种效率，进而加快种的育种进程。


图1为SSR标记RM229在武育粳3号/镇稻88 F2群体中的分离(M为DNA ladder; l为武育粳3号；2为镇稻88; 3为F1; 4 - 28为&群体中的部分单株；a为250bp; b 为200bp; c为150bp)图2为武育粳3号/镇稻88 F2群体中抗病基因5Yr^位点图3为SSR标记RM229在以镇稻88为亲本的杂交组合后代中表现(1为DNA ladder; 2为武育粳3号；3为镇稻88; 5为徐稻4号；6为徐稻3号；7:连粳4号；a为200bp; b为150bp; c为100bp)具体实施方法下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、与水稻条紋叶枯病抗性基因连锁的分子标记的获得1、 供试材料植物材料以感病品种武育粳3号为母本，抗病品种镇稻88为父本，构建F2定位群 体。2006年正季将^群体的200个家系种植于江苏省农科院实验田，单本种植。分蘖初 期，拔取小分蘖，移栽至试验田，用于抗性鉴定。孕穗期，取各单株的部分叶片，用 于SSR分析。成熟时，收获Fu家系的种子，晒干保存，2007年用于苗期抗性鉴定。介体灰飞虱通过筛选、扩繁到实验要求所需的虫量。采用斑点免疫结合(Dot immunobinding assay, DIBA)法检测灰飞虱的带毒率(《江苏农业科学》2004， (1): 50-51)。测得灰飞虱的带毒率为40%。2、 抗性鉴定1) 水稻分蘖期接种鉴定待移栽的小分蘖活棵后，用两端开口玻璃管(直径8cm,高45cm)直接在大田单苗 接种。每管放3-4龄若虫4头，用纱布包好上端开口饲食48小时后，移除玻璃管喷施吡 虫林锐劲特混合液灭虫，IO天后开始调査，以后每三天调查一次，连续调查5次。2) 苗期接种鉴定将F2:3家系水稻种子浸种催芽后，播于玻璃杯中，当秧苗长至1.5-2.0叶时进行接虫 鉴定，接虫前2天拣苗，淘汰病弱苗，挑选生长一致的幼苗，每杯20株，按每株4头2-3齡灰飞虱若虫计算所需虫量，将其均匀接入烧杯内，饲毒三天后移栽至大田中，肥水 管理如大田。IO天后开始调查，以后每三天调查一次，连续调查5次。 3)鉴定标准病级调査标准参照周彤等制订的标准，具体标准为0级无症状；l级叶片上有 轻微黄绿色斑驳症状，病叶不卷曲，植株生长正常；2级叶片上呈现褪绿并扩展相连 成不规则黄白色或黄绿色条斑，病叶不卷曲或略有巻曲，植株生长基本正常；3级叶 片严重褪绿，病叶卷曲呈捻转状，少数病叶出现黄化枯萎症状；4级大部分病叶巻曲 呈捻转状，并黄化枯死，植株呈枯心状或整株枯死。F:群体中平均病级达O、 l级为抗病； 2级为中抗；3、 4级为感病。F,3家系按发病率划分，0_10%为抗病，10.1-30%为中 抗，30. 1%以上为感病。鉴定发现F2群体中表现为感病的有41株，其后代F^株系表现均为感病；F:群体中表 现为抗病的有159株，其对应的F^家系中表现为抗病的有58株系，表现为中抗的有101 株系。即分蘖期抗性鉴定的结果与苗期抗性鉴定的结果是一致的。 3 DNA提取DNA提取参照DelUpporta等(1983 )的方法，具体步骤如下1) 收取200-300mg新鲜水稻叶片(-2(TC保存的叶片)，在-2(TC预冷研钵中用液氮 研磨成粉末。2) 转移到-20'C预冷的1. 5ml离心管中。3) 加入600ul SDS提取液摇勾，65'C,温洛30min。间或振荡3-4次。4) 加入l/4体积(约100ul)KAC、摇匀，冰洛30min。5) 加入l"体积(约300—00ul)的氯仿异戊醇(体积比24: 1),振荡器上充分摇 匀(120rpm, 30min)。6) 室温下6000-8000rpm离心15min，取上清。7) 加入等体积"00ul左右)氯仿异戊醇(体积比24: 1), 80-90rpm振荡30min。8) 室温下6000-8000卬m离心15min。取上清。9) 加入2倍体积(700111左右)-WC预冷的无水乙醇、摇匀> -20。C自由沉降 20min。10) 室温下12000卬m离心6min,弃上清，沉淀用等体积(400ul左右)70%乙醇洗涤 10min。11) 弃70%乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于200ul TE(1/10)， 40C保存备用。12)用0.8。/。的琼脂糖电泳检测DNA样品质量。再用Perkin Elmer MBA 2000测定DNA 样品浓度，将各样品DNA稀释至20ng/ul备用。 4 SSR分析从http: 〃www.gramene.org搜索水稻第ll染色体上相关SSR引物共n对(由上海英 骏生物技术有限公司合成)。PCR反应体系和程序参照Chen等(l"7 )的方法'具体如下1) PCR反应体系(10 ul) DNA (10ng/ul ) lul Primer (4pmol/ul) 0.7ul10 x Buffer ( freeMgC12 ) lul dNTP ( 2. 5mM) 0. 2ulMgC12 ( 25mM) 0. 6ulTaq(5u/ul) 0. lulddH20_6. 4ul_总体积 10ul2) PCR反应程序95'C变性5min; 95。C变性30s、 55'C退火30s、 "。C延伸lmin,共进行35次循环； 72'C延伸7min。 PCR反应在PTC-250热循环仪中进行，扩增产物加入指示剂后，置4 'C备用。3) 电泳检测用8'/。的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，用银染的方法进行显色，用保鲜膜包胶 保存，并在白光灯上记录实验结果(图l)。 5连锁图谱的构建利用亲本间多态性检测筛选出的SSR标记对200个F2单株进行分析，按照MAPMAKER 软件(Lander et al, 1987)的要求，将与父本镇稻88相同的带型赋值为"A",与母本 武育粳3号相同的带型赋值为"B",与F2杂种相同的带型赋值为"H"，带型不清楚或 缺失的赋值为"一"。用Kosambi函数算出遗传距离。构建了 55. lcM的水稻第十一染 色体部分连锁群，其中标记RM229与抗病基因&r6'间的遗传距离为4. 7 cM (图2 )。实施例2、与水稻条紋叶枯病抗性基因连锁的分子标记在以镇稻88为亲本的杂交组合后代中的应用徐稻3号、徐稻4号和连粳4号是三个以镇稻88为亲本杂交组配获得抗病品种' 其中徐稻3号是以镇稻88作母本，台湾稻C作父本杂交组合后代筛选获得'徐稻4号 是以镇稻88为母本，以徐41293为父本杂交组合后代筛选获得，而连粳4号是以镇稻 88作母本，中粳3114作父本杂交组合后代筛选获得。通过SSR标记RM"9分析预测徐 稻3号、徐稻4号和连粳4号三个品种对水稻条紋叶枯病的抗性为抗(图3,SSR分析 方法同实例一)，而三个品种抗性鉴定的结果也与镇稻8S相似(《植物保护学报》已投 稿)。预测结果与实际结果非常吻合。上述实施不以任何形式限定本发明。
权利要求
1、一种与水稻条纹叶枯病抗性基因连锁的分子标记，其特征在于以武育粳3号/镇稻88的F2群体为作图群体，通过抗病性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，获得与水稻条纹叶枯病抗性基因连锁的SSR标记RM229。
2、 按照权利1所获得一种与武育粳3号/镇稻88组合中水稻条紋叶枯病抗性基 因连锁的分子标记的应用，其特征在于以镇稻88及其衍生品种(系)与武育粳3 号及其衍生品种(系)为亲本的杂交组合的后代单个水稻植株为对象，通过检测 其RM229标记的带型数据，可以预测该植株对水稻条紋叶枯病的抗性。
全文摘要
本发明公开了一种与水稻抗条纹叶枯病基因连锁的分子标记。本发明的实质是根据连锁分离规律，以武育粳3号/镇稻88的F₂群体为作图群体，通过抗病性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，获得了与水稻条纹叶枯病抗性基因连锁的SSR标记RM229。将本发明应用于水稻条纹叶枯病抗病品种的辅助选择育种中，可以克服常规育种中水稻条纹叶枯病抗性鉴定稳定性和重复性较差、费时费力和技术门槛高等缺点，其结果可以简化选择方法和提高育种效率，进而加快抗病品种的育种进程。
文档编号C12Q1/68GK101240336SQ20071019092
公开日2008年8月13日 申请日期2007年12月3日 优先权日2007年12月3日
发明者彤 周, 周益军, 熊如意, 磊 王, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院