专利名称：一株防治植物病害的生防细菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明提供一株防治植物病害的生防菌株及其菌剂，所得到的生物药剂及其方法属 于生物防治领域。该生防菌株及其菌剂为植物病害的生物防治提供了一种新的高效生物 农药，是一种很好的化学农药替代品。
二背景技术：
植物病害一直严重地威胁着农业生产，人类防治植物病害可以追溯到几千年前，过 去使用的药剂多为植物性或无机化学农药。上世纪40年代初期，有机合成农药大量使 用，虽然在保证农作物稳定、高产方面起到重要作用，但是由于化学农药本身的缺点及 长期不合理使用，逐渐暴露出一些严重的问题，如抗药性、农药残留和病虫害再猖獗， 即3R问题(Resistance、 Residue、 Resurgence)。 3R问题的出现引起了人们的广泛关注， 于是生物防治的研究开发应用被提到了议事日程，并得到各国政府的重视。从植物病害 防治的角度来讲，生物防治是利用生物活体或其代谢产物对有害生物进行防治。目前， 国内外学者已从土壤中筛选到许多有益的微生物，为植物病害的生物防治提供了大量的 可利用资源，并且许多生防菌已开发成为生防制剂，广泛用于生产。在各类防治植物病 害的生物农药中，细菌制剂是较多的一类，国内外已经有数十个相关产品登记。已开发 成功的细菌生防制剂主要为芽孢杆菌(BaczX丄Mspp.)、荧光假单胞杆菌(i^ei^o/nomw /LMomsce"s)和放射土壤杆菌"gra6a"en'wn raJz'o6acfer)。目前用于生防的芽孢杆菌种 类主要有枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等。荧光假单胞菌能够防治多 种植物病害，如小麦全蚀病、棉花幼苗猝倒病、马铃薯软腐病等。利用细菌防治植物土 传病害，最著名的当属放射土壤杆菌K-84菌系。该菌可有效地防治根癌土壤杆菌引起 的桃、樱桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病，并且已在澳大利亚、美国、加拿大等9个国 家推广应用。
近年来，随着国内外深入研究，科学家发现许多植物存在着一类称作为植物根部促 生细菌和植物内生细菌的有益微生物，除促进植物生长外，它们还能抑制根部病原菌的
生长，减轻植物病害，并且可作为激活剂诱导植物系统获得抗性，成为细菌生防制剂的 开发热点。其中，最早商业化生产的植物根部促生细菌是枯草芽孢杆菌A13， A13能有 效抑制植物病原菌的繁殖，促进许多植物的生长。用A13处理种子可以提高胡萝卜产量 48%，燕麦产量33%和花生产量37%。 1990年美国Auburn大学的科研人员进一步将A13 应用在棉花和豌豆上并实现了商品化。
Pasteur在1876年从无菌葡萄果汁中提取到内生细菌，从此植物内生细菌逐渐引起 了人们的关注。我国陈延熙教授等曾从植物体内筛选出有益的芽孢杆菌并将其制成植物 微生物制剂，在水稻、小麦、棉花、油菜、牧草等50多种植物上应用，对作物具有增 产、防病、改善品质、抗旱、防寒等作用。杨海莲等用从水稻中分离得到的内生阴沟肠 杆菌的菌液喷洒水稻叶片，结果表明处理后能够明显提高水稻对白叶枯病、稻瘟病、纹 枯病的抗性。Brooks等已经证明分离自橡树的内生芽孢杆菌、假单胞菌对橡树枯萎病 菌有拮抗活性。用内生的脱氮假单胞菌处理橡树后接种病原菌，防效为50%。 Sayonara 等从甘蓝、白菜叶子中分离到3种内生细菌对甘蓝黑腐病原菌甘蓝致病变种有拮抗活 性。综上所述，基于生物防治的安全性和有效性，通过筛选抗菌谱广、生防活性高的新 型细菌菌株，进而制备出高效的生防菌剂，将有利于更好地防治植物病害，减少化学农 药的污染。
发明内容
技术问题本发明的目的是针对生产实践中的实际问题和需求，筛选出一株抗菌谱 广、活性高、对环境安全的新型生防细菌菌株，制备出高效的生防菌剂，更好地防治农 业植物病害，减少化学农药对环境的污染。
技术方案下面为本发明的主要内容
本发明是从作物根际土壤中分离筛选到1株具有较强拮抗活性的细菌，经鉴定为产 酶溶杆菌，菌株代号为OHll。产酶溶杆菌作为一种生防细菌，在国内属首次报道，是
一种新型的生防细菌。主要生物学特性为ff (革兰氏阴性)，菌体为短杆状，大小为
3.2x0.4/mi，氧化酶、接触酶、柠檬酸利用反应为阳性；脂酶反应、V.P.反应、H引哚反应 为阴性；不能水解淀粉。菌株OHll现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(北京)，保藏日期2007/03/19，保藏号CGMCCN0.1978。使用上述高效生防菌株生产菌剂的工艺为:斜面种一摇瓶种一种子罐一生产罐—产 品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。
本发明的详细实施步骤为
1) 将生防菌株0H11试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期。
2) 将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10%接种量接种入500升种子 罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为胰蛋白胨5g/L、玉米粉 10g/L、黄豆粉20g/L、酵母提取物2g/L、硫酸胺6g/L、蔗糖20 g/L、 KH2P04 3 g/L、 MgS04.7H20 4.8 g/L、 MnS04.H20 0.02 g/L 、 FeS04.7H20 0.01 g/L、 CaCl2.2H20 0.12 g/L、 NaCl 2.4 g/L、生物素0.1 mg/L、泛酸钙6 mg/L、硫胺素 1.2mg/L、核黄素3mg/L、维生素B6 0.01 mg/L。
3) 将种子液按生产罐培养基的10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基 与种子罐培养基相同。
4) 在种子罐和生产罐的培养过程中溶氧量为15%—20%，搅拌速度为210 rpm/min，发酵温度为30'C，全流程培养时间为72h,发酵结束后菌体数量达到 101QCFU/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液 体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。
有益效果
使用该发明生产的生防菌剂具有生产使用成本低、使用方便、防治效果好等优点， 适合于农业植物病害的生物防治。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提 高农产品的质量具有重要的意义。
试验证明，菌株OH11产生包括几丁质酶、/3-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶等多种胞外 水解酶，能有效抑制真菌，细菌的生长。菌株0H11对油菜菌核病菌和辣椒疫霉病菌抑 菌圈直径都大于22mm，对马铃薯环腐病菌的拮抗作用较强，抑菌圈直径达到50mm。 OH11可有效地防治植物病原真菌、细菌、线虫等病害，总体防治效果在50%—70%。 在温室盆栽试验中，OH11对辣椒疫病和番茄青枯病的防治效果分别达到了 83.6%和 86.4%。
目前对植物病害的防治主要采取化学农药防治和抗病品种利用。化学农药防治由 于农药残留量大，对生态环境污染严重，病原菌容易产生抗性水平，逐渐使化学农药失 去药效。而抗病品种也常常因为病原菌容易克服其抗性而遭到淘汰。而本研究中分离得 到的产酶溶杆菌具有抗菌谱广、防治效果好、环境安全、无污染等特点，与现有的防治 方法相比，本研究所获得的产酶溶杆菌具有更为广阔的应用前景。
四
图1生防菌株OH11的形态特征OH11菌株的革兰氏染色、鞭毛染色、滑行运动、 菌落形态图
A: OHll菌株革兰氏染色；B: OH11菌株鞭毛染色； C: OHll菌株滑行运动；D: OH11菌株菌落形态
图2生防菌株OHll的透射电镜照片
图3生防菌株OH11的抑菌活性
图4生防菌株OHU对植物病原真菌菌丝的抑制作用
图5生防菌株OH11对植物病原真菌孢子萌发的抑制作用
图6生防菌株OH11防治植物病害的温室试验
五具体实施例方式
本发明是从作物根际土壤中分离筛选到的1株较强拮抗活性的细菌，经鉴定为产酶 溶杆菌，菌株代号为OHll。产酶溶杆菌作为一种生防细菌，在国内属首次报道，是一 种新型的生防细菌。OH11菌株现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(北京)，保藏日期2007/03/19，保藏号CGMCCN0.1978，该菌具有抗菌谱广、活 性高、防治效果好、环境安全性高等特性。
(1) 生防细菌的分离取江苏省农科院院内蔬菜、水稻、棉株、果树根表lmm土 层土样共27份。将采集的土样(经2mm土壤筛过筛)10 g加入装有90 mL无菌水的 三角瓶中(内装玻璃珠若干)，摇床振荡20min，然后进行3 4次10倍系列稀释。吸 取稀释液100 /xL于NA平板上均匀涂布，每个稀释度中设3次重复于28 'C下培养2 3 天。稀释度以每平板菌落数100 150为宜，挑取不同类型的菌落于NA平板上纯化3 次，随后划线于NA斜面，于4"C保存备用。将土壤细菌在NA平板上活化后分别移入 100 mLNA培养液中，150 rpm/min、 28 。C振荡培养48 h得到土壤细菌菌液。在PDA与 NA等比例混合平板中央放置病原真菌菌丝块(直径7mm)，四周呈对角线放置4个直 径为7mm的滤纸片，3个接种待测细菌菌悬液5 pL， 1个设无菌水处理为对照，每处 理重复3次，28t)培养，待对照处理真菌生长至平板边缘测定抑菌圈。通过此方法，我 们从作物根际土壤中分离到1056株细菌，筛选出7个具有较强拮抗活性的菌株。
(2) 生防细菌的鉴定 通过形态观察、生理生化试验、脂肪酸分析和16SrDNA 序列分析，其中1株细菌被鉴定为产酶溶杆菌a^o6acfer e"zymogewes)，菌株代号为OHll。抑菌试验表明，0H11对辣椒疫霉、瓜果腐霉、甘薯软腐病菌、油菜菌核病菌、 水稻纹枯病菌、棉花枯萎病菌、茄根腐病菌、棉花黄萎病菌、番茄青枯病菌、甘蓝黑腐 病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、马铃薯环腐病菌等重要植物病原菌均有 较强拮抗作用。产酶溶杆菌作为一种生防细菌，在国内属首次报道，是一种新型的生防 细菌。
(3) 发酵条件的优化 采用单因素实验法对产酶溶杆菌OH11液体发酵的主要 影响因子温度、转速等进行了探讨，确定了最佳培养条件为温度为3(TC、转速为210 rpm/min;通过正交实验以LB为基础培养基对其发酵培养基在摇瓶中进行了优化，优化 后的培养基为胰蛋白胨5g/L、玉米粉10g/L、黄豆粉20g/L、酵母提取物2g/L、硫 酸胺6 g/L、蔗糖20 g/L、 KH2P04 3 g/L、 MgS04.7H20 4.8 g/L、 MnS04.H20 0.02 g/L 、 FeS04.7H20 0.01 g/L、 CaCl2.2H20 0.12 g/L、 NaCl 2.4 g/L、生物素0.1 mg/L、泛酸钙6 mg/L、硫胺素1.2mg/L、核黄素3 mg/L、维生素B6 0.01 mg/L。在优化条件下，发酵培 养基中活菌数在24 h时达到8.13x108 CFU/mL， 72 h时达到4.8x109 CFU/mL，而在原基 础培养基中活菌数在24 h时达到1.87x108 CFU/mL, 72 h时达到9.3x108 CFU/mL;在此 基础上，进一步通过正交实验对摇瓶装量、发酵时间、接种量、初始pH值4种因素进 行了优化,优化后的结果为装液量40mL/250mL,发酵时间72h,接种量109 CFU/mL, 初始pH值7.5。
(4) 施用方法
对于不同类型的植物病害采用不同的施用方法，施用次数根据防病情况而定。对于 番茄青枯病等维管束病害采用发酵菌液(浓度为109 CFU/mL)直接灌根的处理方法， 防治效果为70%—85%;对于种传病害采用种子包衣的处理方法(包衣剂为羧甲基纤维 素，生防菌浓度为109CFU/mL)，防治效果为50%—70%;对于水稻稻瘟病等叶部病害 采用直接喷雾的方法(生防菌浓度为109CFU/mL)，防治效果为50%—70%。
权利要求
1.一株防治植物病害的生防菌株，为革兰氏染色阴性的产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)，菌株代号为OH11。该菌株于2007年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1978。
2. —种用权利要求1所述的一株防治植物病害生防菌株生产的生防菌剂是通 过以下方法生产而成1) 将生防菌株OHll试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期。2) 将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10%接种量接种入500升种 子罐，培养至对数生长期,种子罐所用的培养基配方为:胰蛋白胨5 g/L、玉米粉10 g/L、 黄豆粉20 g/L、酵母提取物2 g/L、硫酸胺6 g/L、蔗糖20 g/L、KH2P043 g/L、MgS04.7H20 4.8 g/L、 MnS04.H20 0.02 g/L 、 FeS04.7H20 0.01 g/L、 CaCl2.2H20 0.12 g/L、 NaCl 2.4 g/L、生物素0.1 mg/L、泛酸钙6 mg/L、硫胺素1.2 mg/L、核黄素3 mg/L、维生素B6 0.01 mg/L。3) 将种子液按生产罐培养基的10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养 基与种子罐培养基相同。4) 在种子罐和生产罐的培养过程中溶氧量为15%—20%，搅拌速度为210 rpm/min，发酵温度为30'C，全流程培养时间为72 h,发酵结束后菌体数量达到101Q CFU/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或 采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。
全文摘要
本发明提供一株防治植物病害的生防菌株及其菌剂，属于生物防治领域。所用菌株为革兰氏染色阴性细菌，经鉴定为产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)，菌株代号为OH11。菌株OH11无鞭毛但有滑移性，能产生包括几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶等多种胞外水解酶，能有效抑制真菌、细菌的生长。菌株OH11对油菜菌核病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌圈直径都大于22.0mm；对马铃薯环腐病菌的拮抗作用较强，抑菌圈直径达到50mm。将OH11菌种接种入种子罐，培养至对数生长期，将种子液接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同。液体发酵采用通氧深层发酵和分批补料工艺，溶氧量为15％-20％，发酵温度为30℃，发酵时间72h，初始pH值7.5。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。生防菌株OH11可有效地防治植物病原真菌、细菌、线虫等病害，总体防治效果在50％-70％。温室盆栽试验中，OH11对辣椒疫病和番茄青枯病的防治效果分别达到83.6％和86.4％。菌株OH11具有抗菌谱广、活性高、对环境安全等特性，在农药污染严重的今天，产酶溶杆菌及其菌剂将是一种很好的替代品。
文档编号C12N1/20GK101177671SQ200710190998
公开日2008年5月14日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者刘凤权, 姜英华, 胡白石, 钱国良, 冰 韩 申请人:南京农业大学