专利名称：：人工肝生物反应器的制作方法
技术领域：
：本实用新型涉及一种以纳米纤维支架材料作为肝细胞培养基质的用于生物人工肝的生物反应器，属于人工肝支持系统的
技术领域：
。背肇技术人工肝作为肝功能不全、肝衰竭或相关疾病的有效辅助治疗技术已在临床中广泛应用，现在临床上应用的人工肝主要包括三类非生物型人工肝、生物型人工肝、漉合型人工肝。其中生物型人工肝在治疗肝病病人的临床应用中疗效最为显著，生物型人工肝一般专指人工培养的肝细胞为基础构件的体外生物反应系统。它不仅具有肝脏的特异性解毒功能，而且具有更离的效能，如参与能代谢，具有生物合成转化功能，分泌促肝细胞生长活性物质等。生物型人工肝具有自动化程度高、操作简单、安全可靠的特点。其治疗重型肝炎的i,床结果显示，显效率为36.7%,有效率为46.7%,总有效率为83.3%。目前应用于临床的生物型人工肝在细胞培养方面存在很多问題，诸如生物反应器内培养的肝细胞密度过低达不到人体所需的2~3xl0leceUs/m2,肝细胞容易从培养基质上脱落从而造成肝细胞随循环的培养液流走和在生物反应器内分布不均匀造成人工肝功能下降，以及培养液中氧气供量不足造成的肝细胞死亡等等。未来生物型人工肝主要在肝细胞的培养以及肝细胞的优化方面进行改进(Jung-KeugPari^Doo-HoonLee.BioartificialLiverSystems:CurrentStatusandFuturePerspective.JournalofBioscienceandBioengii^ing2005.99(4):311—319.)。纳米纤维支架是近年来兴起的一种细胞培养基质，具有巨大的比表面积(孔隙率>85%)以及10咖10jun的纤维直径，其纺织状的形貌结构类似于脊椎动物体内的细胞生长基质-蛋白纤维，有利于细胞的黏附、生长以及繁殖。有资料表明这种纳米纤维支架有利于肝细胞球状体的形成以及球状体生物活性的保持，培养在纳米纤维支架上的肝细胞其合成白蛋白、尿素的能力均大于利用传统模式培养的肝细胞(Ki油-Ngi邵Ch叫Wei-SengLima<Stableimraobilizationofrathepatocyteqdiaokl;加galactoeylatednanofiberscaffoldBkxoaterkds^)05.26:2537-2547)。现行生物型AX肝的肝细龐密度一般在5-8xl()8cdls/i^之间，与人肝的肝细胞密度23xl0Wcells/i^尚有很大差距，因此，现行人工肝不Hil足一个成人的血液净化需求。并且现行生物型人工肝的肝细胞球状体醃着埯养液的流动易从细胞基质上脱落，造成肝细胞的分布不均匀和肝缅跑数量的减少。ffl^胞对氣气的需求量很大，但现有的生物人工肝均有氣气提供不足的缺点，造成肝细胞的生物活性降低甚至死亡。以上原因严重影响人工肝的临床效能。目前还没有检索到关于利用纳米纤维支架对人工肝生物反应器进行改进的报道或专利。
发明内容技术问題本实用新型目的在于,一种利于提髙肝细胞浓度和國定化肝细胞的人工肝生物反应器。该生物反应器实现了生物反应器内肝细胞的雜附生长，不仅可以避免传统人工肝的肝细胞条浮培养所带来的细胞流失问题，而且纳米纤维无纺布的类生物体蛋白纤维的结构可以促进肝细鹏的繁殖和生长，从而可以在很大程度上提高肝细胞在生物反应器中的密度以及肝细胞的生物活性，增强肝细胞合成白蛋白及分泌染色素的能力。技术方案本实用新型将纳米纤维支架应用于人工肝生物反应器并通过优化内部结构对生物反应器进行改进，以提高生物型人工肝的肝细胞密度和增加培养液的氧含量并改善肝细胞在生物反应器内分布情况，从而提离生物型人工肝的临床效能。针对以上问题本发明在对人工肝生物反应器的改进中引入纳米纤维支架，利用纳米纤维支架利于细胞黏附、生长的特点，可达到固定肝细胞进而提高生物型人工肝的肝细胞密度的目的，并且有利于细胞培养液的循环以及促进肝细胞的繁殖和球状体的形成。此外对生物反应器的内部结构进行优化设计，增加输氧管，以提高肝细胞的成活率和生物活性。进而提高肝细胞净化血液的能力。本实用新型的人工肝生物反应器的结构为在生物反应器外壳的一端设有血浆进口、氧气进口，在生物反应器外壳的另一端设有血浆出口、氧气出口，在生物反应器外壳的侧面地两头分别设有营养液进口、营养液出口，在生物反应器外壳的内部设有由纳米纤维支架、中空纤维组成的细胞培养的基质纳米纤维支架与中空纤维之间形成巻曲的"夹心式"结构，即纳米纤维支架巻曲成蠊旋的巻筒状，在巻曲的夹层中设有中空纤维，肝细,集体附在中空纤维旁在生物反应器中设置氣气ait，可以实现适时加氣功能。所述的纳米纤维支架的材料为海藻黢盐、多聚3ttft酸、壳聚糖、琼脂糖、聚乙烯醇中的一种或几种的混合物，呈长方形无纺布结构。所述纳米纤维支架的纤维直径在30mn400nm之间，孔隙率>85%。将纳米纤维支架中裙布的中空纤维每间隔510根选取一根，按此方法将选出的中空纤维作为氧气的通道，将余下的中空纤维作为血浆的通道。有益效果该生物反应器首次引入纳米纤维支架，实现了生物反库器内肝细胞的黏附生长，不仅可以避免传统人工肝的肝细胞悬浮培养所带来的细胞流失问题，而且纳米纤维无纺布的类生物体蛋白纤维的结构可以促进肝细胞的繁殖和生长，从而可以在很大程度上提高肝细朧在生物反应晷中的密度以及肝细胞的生物活性，增强肝细胞合成白蛋白及分泌染色素的能力。针对肝细胞的培养需氧量大的特点，在生物反应器的设计中加入了通氧设施，可以实现适时向反应器中供氧的功能。该生物反应器的设计新颖，纳米纤维支架的引入在国内外尚属首例，且制备方法在技术上均能实现。可以相信这种新型的生物反应器在人工肝以及其他细胞培养领域具有广阔的应用前景。图1为生物反应器横切面示意图，图2为生物反应器纵切面示意图，以上的图中有营养液进口1、血桨进口2、氧气进口3、营养液出口4、血浆出口5、氧气出口6，生物反应器外壳7、纳米纤维支架8、中空纤维9、肝细胞聚集体10。具体实ji^式本实用新型的人工肝生物反应，生物反应器外壳7的一端设有血浆进口2、氧气进口3，在生物反应器外壳7的另一端设有血浆出口5、氧气出口6，在生物反应器外壳7的倒面地两头分别设有营养液进口1、营养液出口4,在生物反应器外壳7的内部设有由纳米纤维支架8、中空纤维9组成的细胞培养的基质；纳米纤维支架8与中空纤维9之间形成巻曲的"夹心式"结构，即纳米纤维支架8巻曲成蠊旋的巻筒状，在巻曲的夹层中设有中空纤维9，肝细胞聚集体10附在中空纤维9旁在生物反应器中设置教^3i道，可以实m时加氣功能。其中面临的主要问鹿为支架材料的选择以及生物反应器内部结构设计的问题。纳米纤维支架材料应具有良好的生物相容性以及一定的力学强度，为此，制备纳^f维支架的材料选择有利于肝细胞繁殖、生长的海藻黢盐、多聚賴贫黢、壳聚糖、琼脂糖、聚乙,等高分子聚合物。内部结构的设计应利于细胞营养液的适时加氧以及减小具体制备过程中的操作难度。利用静电纺丝法将以上高分子聚合物制备成具有30nm~400腿直径纤维的长方形无纺布支架，将中空纤维规则排布于无紡布支架上，其中部分中空纤维作为氧气通道而其他中空纤维作为血^il道，将纳米纤维支架巻曲包裹中空纤维后填充于生物反应器内(见附图)，即制得此新型生物反应器。该生物反应器的特征在于引入纳米纤维支架作为细胞培养的基质，Jft^米纤维支架原材料为海藻酸盐、或多聚赖氨酸、或壳聚糖、或琼脂糖、或聚乙烯酵等高分子聚合物，具有30nm400nm的纤维直径，呈长方形无纺布结构；纳米纤维支架与中空纤维间呈規则的巻曲"夹心式"结构中空纤维束分为两束，其中一束作为氧气通道，向细胞培养液中适时加氧；在反应器的外壳上留有血浆、氧气、营养液的进出口各两个。本实用新型通过以下方法加以实施。利用静电纺丝技^聚合物(海藻酸盐、多聚赖氣酸、壳聚糖、琼脂糖、聚乙烯醇等)制备成一定面积的长方形无纺布支架，然后将聚砜中空纤维规则的拌布于纳米纤维无纺布上(间距在0.5mm~2mm),每隔515根选择一根中空纤维作为氧气的通道，巻曲纳米纤维支架将聚砜中空纤维包裹起来，后填充于外壳支架内，在外壳支架上留有氧气通道、血浆通道、培养液通道各两个分别作为进口和出口。该方法包括以下过程1.纳米纤维支架的制备选择不同的溶剂将聚合物(海藻酸盐、多聚賴氨酸、壳聚糖、琼脂糖、聚乙烯醇等)溶解制备成静电纺丝溶液。根据聚合物溶液的不同性质制定不同的静电纺丝条件(电压、接受距离、注射速度)，然后进行纺丝，在纺丝过程中通过移动接受器的位置和控制纺丝的时间对纳米纤维支架的形状和厚度进行调节。将不同材料的纳米纤维支架进行相应的改性和消毒，制备成能放置于细胞培养液中作为细胞生长基质的纳米纤维支架。2.中空纤维与纳米纤维支架的构造设计将纳米纤维无纺布支架平坦，在支架上顺序排布聚砜中空纤维(间距0.5111111~2111111)，然后巻曲纳米纤维支架将中空纤维锁在其内部，即制得生物反应晷的核心组件。每间隔510麟择一根中空纤维作为供应氣气的通道，按此方式将两端的中空纤维分成两束，一束作为血浆的通道，一束作为氧气的通道。3.核心组件的封装将步驟2种得到的核心组件用聚丙烯外^装，在外^±留有血浆、氧气、培养液的进出孔各两个。将两端的两束中空纤维按顧序分别放入血浆和氧气的通道孔中，并用医用胶水封装，即自此新型生物反应器。例一以海蒸酸盐作为纳米纤维支架的原材料来制作此新型生物反应器。1.纳米纤维支架的制备(1)静电纺丝洛液的制备将海藻H^溶于去离子水中制备成浓度为质量比Wwww:W战子一4M的溶液。将聚氧化乙烯(JWW-900kD〉溶于去离子水中制备^度为质量比W睥化乙錄W去肝*=4%的溶液。然后将两种溶液按^比Vv賴化￡脚液一8:2的比率混合，常温拨拌100min至混合均匀，得到海藻酸钠与聚氧化乙烯的混合溶液。然后按体积比Vwr雜菊V菊^=0.5%的比率加入表面活性剂曲拉通又-100，持续拨拌10min。之后按体积比V助柳Vs絲a-10%的比率加入助溶剂二甲亚砜。在室温下持续搅拌60min。即获得均一、稳定的浅黄色纺丝溶液。(2)静电纺丝工艺制备纳米纤维支架使用离心机将歩骤(1)中获得的纺丝溶液在5000rpm的转速下离心5min,之后将其注入到注射器(直径为20mm)中，将注射器固定在微量注射泵上，距针头15cm处固定铝箔作为接收器。在针头上施加18kv的高压，注射泵流速为l.OmIA。在纺丝过程中不断移动接收器，即获得一定面积的纤维膜,其纤维直径在50nm~500nm。(3)海藻酸钠纳米纤维支架的改性处理将步骤(2)中所得的纳米纤维材料浸泡在无水乙醇中10min，之后将该材料浸泡在浓度为质量比Wcad2:Wffi0-2%的CaCl2溶液中并持续120min,然后用去离子水冲洗10min以去除残留的CaCl2。即制得海藻酸钠纳米纤维支架。2.核心组件中中空纤维与纳米纤维支架的构造将海藻酸盐纳米纤维无纺布支架平坦，在支架上顺序排布聚砜中空纤维其间距为1mm,然后巻曲纳米纤维支架将中空纤维包裹在其内部，形成"夹心式"结构，即制得生物反应器的核心组件。然后每间隔510根选择一根中空纤维作为供应氧气的通道，按此方式将两端的中空纤维分成两束，一束作为血浆的通道，一束作为氧气的通道。3.核心组件的封装将步驟2种得到的核心组件用聚丙烯外^i^,在外处留有血浆、氧气、培养液的进出孔各两个。将两靖的两束中空纤维^t類序分别放入血浆和氣气的通遒孔中，并用医用胶水封装，即铜得此新型生物反应器。例二以壳聚糖作为纳米纤维支架的原材料来翻作此新型生物反应器。1.纳米纤维支架的制备(1)静电纺丝溶液的制备将壳聚糖O^W-190kP,Deacetylation=85%)溶于质量比为5M的醣黢瘠液中制备^度为质量比Www:W,豕=2%的溶液。将聚氣化乙烯(^-900kD)溶于质比为5%的酸酸洛液中制备成浓度为质量比WjMM^:Wn^wp3%的洛液。然后将两种溶液按体积比V，,:V賴化鹏液-9:1的比率混合，常温拨拌100minM混合均匀，得到壳聚糖与聚氧化乙烯的混合溶液。然后按体积比Vwr雜a:-0.30/0的比率加入表面活性剂曲拉MX-100，^挽拌10min。之后按体积比VjMBB:V籌賴液=10%的比率加入助溶剂二甲基甲酰胺。在室温下持续搅拌60mk。即获得均一、稳定的纺丝溶液。(2)静电纺丝工艺制备纳米纤维支架使用离心机将歩骤(l)中获得的纺丝溶液在5000rpm的转速下离心5min，之后将其注入到注射器(直径为20mm)中，将注射器固定在微量注射泵上，距针头18cm处画定铝箔作为接收器。在针头上施加22kv的高压，注射泵流速为1.5mL/h。在纺丝过程中不断移动接收器，即获得一定面积的纤维膜，其纤维直径在30nm80nm。在室温下使纳米纤维膜干燥即制得海藻酸钠纳米纤维支架。2.核心组件中中空纤维与纳米纤维支架的构造将壳聚糖纳米纤维无纺布支架平坦，在支架上顺序排布聚砜中空纤维其间距为lmm，然后巻曲纳米纤维支架将中空纤维包裹在其内部，形成"夹心式"结构，即制得生物反应器的核心组件。然后每间隔5~10根选择一根中空纤维作为供应氧气的通道，按此方式将两端的中空纤维分成两束，一束作为血浆的通道，一束作为氧气的通道。3.核心组件的封装将步骤2种得到的核心组件用聚丙烯外壳封装，在外壳上留有血桨、氧气、培养液的进出孔各两个。将两端的两束中空纤维按顺序分别放入血浆和氧气的通道孔中，并用医用胶水封装，即制得此新型生物反应器。权利要求1.一种人工肝生物反应器，其特征在于在生物反应器外壳(7)的一端设有血浆进口(2)、氧气进口(3)，在生物反应器外壳(7)的另一端设有血浆出口(5)、氧气出口(6)，在生物反应器外壳(7)的侧面地两头分别设有营养液进口(1)、营养液出口(4)，在生物反应器外壳(7)的内部设有由纳米纤维支架(8)、中空纤维(9)组成的细胞培养的基质；纳米纤维支架(8)与中空纤维(9)之间形成卷曲的“夹心式”结构，即纳米纤维支架(8)卷曲成螺旋的卷筒状，在卷曲的夹层中设有中空纤维(9)，肝细胞聚集体(10)附在中空纤维(9)旁；在生物反应器中设置氧气通道，可以实现适时加氧功能。2.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，^t征在于所述的纳米纤维支架(8)的材料为海藻酸盐、多聚赖氨酸、壳聚糖、琼脂糖、聚乙烯醇中的一种或几种的混合物，呈长方形无纺布结构。3.根据权利要求1或2所述的人工肝生物反应器，其特征在于,纳米纤维支架(8)的纤维直径在30ran~400腿之间，孔隙率>85%。4.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于将纳米纤维支架(8)中排布的中空纤维(9)每间隔5~10根选取一根，按此方法将选出的中空纤维(9、作为氧气的通道，将余下的中空纤维(9)作为血浆的通道。专利摘要人工肝生物反应器涉及一种以纳米纤维支架材料作为肝细胞培养基质的用于生物人工肝的生物反应器。此生物反应器在生物反应器外壳(7)的一端设有血浆进口(2)、氧气进口(3)，在生物反应器外壳(7)的另一端设有血浆出口(5)、氧气出口(6)，在生物反应器外壳(7)的侧面地两头分别设有营养液进口(1)、营养液出口(4)，在生物反应器外壳(7)的内部设有由纳米纤维支架(8)、中空纤维(9)组成的细胞培养的基质；纳米纤维支架(8)与中空纤维(9)之间形成卷曲的“夹心式”结构，即纳米纤维支架(8)卷曲成螺旋的卷筒状，在卷曲的夹层中设有中空纤维，肝细胞聚集体(10)附在中空纤维(9)旁；在生物反应器中设置氧气通道，可以实现适时加氧功能。文档编号C12N11/04GK201010656SQ2007200351公开日2008年1月23日申请日期2007年3月20日优先权日2007年3月20日发明者付德刚,冯章启,顾忠泽申请人:东南大学