专利名称：残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法
技术领域：
本发明涉及临來险查中成为动脉硬化症等的危险因素的残粒样脂 蛋白中的胆固醇的测定方法及测定试剂。
背景技术：
临床检查中，高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇，作为动脉硬化症的 危险因素的负因素，低密度脂蛋白(LDL)中的胆固醇作为动脉硬化症的 危险因素的正因素，在临床检查的领域中经常被测定。
近年来，像残粒样脂蛋白这样的，由于脂质的代谢等引起而生成的 脂蛋白中的胆固醇，作为动脉硬化症的危险因素，显示出成为比LDL 中的胆固醇更为紧密的指标，有效测定生物体试样中的脂蛋白中的残粒 样脂蛋白中的胆固醇正成为课题。
关于残粒样脂蛋白中的胆固醇的酶测定法，报道了通过在胆固醇酯 酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶中添加用于分解磷脂的酶，并才艮据情 况再添加表面活性剂的测定方法(例如，参照专利文献1)。
但是，这些方法中，从酶反应的选择性、筒便性方面来说，未必能 说是充分的。
专利文献l:特开平2001-231597号公报
发明内容
本发明的目的在于提供操作更为简便且敏感度良好的测定试样中的 残粒样脂蛋白中的胆固醇的方法及测定试剂。
本发明人鉴于这种情况，研究了使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、 或胆固醇酯酶和胆固醇脱氬酶测定脂蛋白中的胆固醇时的各种条件，发
现可以通过使用特定的表面活性剂从含有高密度脂蛋白(HDL)、低密度 脂蛋白(LDL)、乳糜微粒(CM)、超低密度脂蛋白(VLDL)、 CM残粒、 VLDL残粒、中密度脂蛋白(IDL)残留等的脂蛋白的生物体试样中选择 性地高敏感度地测定残粒样脂蛋白中的胆固醇，从而完成了本发明。
即，本发明涉及一种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法，通过使 胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用于含有 脂蛋白的被检试样，测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，从而 测定脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸结构的表 面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
而且本发明还涉及残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定试剂，其含有胆 固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶，以及分子中 具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
通过使用本发明的测定方法和测定试剂，可以通过极为简便的方法 敏感度良好地测定残粒样脂蛋白中的胆固醇。
图1:是表示使用本发明品1时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图2:是表示使用本发明品2时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图3:是表示使用本发明品3时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图4:是表示使用本发明品4时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图5:是表示使用本发明品5时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图6:是表示使用本发明品6时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图7:是表示使用比较品1时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图8:是表示使用比较品2时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图9:是表示使用比较品3时的各脂蛋白的反应曲线的图。 图10:是表示使用比较品4时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图11:是表示使用比较品5时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图12:是表示使用比较品6时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图13:是表示使用比较品7时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图14:是表示使用比较品8时的各脂蛋白的反应曲线的图。
图15:是表示由本发明的测定方法求得的吸光度值(纵轴)和使用市售的 RLP-胆固醇测定试剂盒获得的值(横轴)之间的相互关系的图。
图16:是表示由本发明的测定方法求得的吸光度值(纵轴)和使用市售的 RLP-胆固醇测定试剂盒获得的值(横轴)之间的相互关系的图。
图17:是表示由本发明的测定方法求得的吸光度值(纵轴)和使用市售的 RLP-胆固醇测定试剂盒获得的值(横轴)之间的相互关系的图((A):未添 加抗apoB-100抗体，(B)添加抗apoB-100抗体)。
具体实施例方式
本发明的测定方法为通过使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固 醇酯酶和胆固醇脱氲酶，以及分子中具有笨璜酸结构的表面活性剂或聚丙 烯酸系高分子表面活性剂作为试剂，使它们作用于含有脂蛋白的被检试样， 测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，来测定脂蛋白中的胆固醇。
本发明的酶反应在水性介质中进行，但特别优选在緩冲液中进行。
作为在緩冲液中使用的緩冲剂，可以列举，例如三(羟甲基)氨基甲 烷、磷酸緩冲剂、硼酸緩冲剂和Good's緩冲剂等。作为Good's緩冲剂， 可以列举，N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙碌酸(ACES)、 N-(2-乙酰胺基)亚氨 基二乙酸(ADA)，N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-[N,N-双 (2-羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、 N-(2-羟基乙基)哌嚷-1\，-2-乙磺酸(HEPES)、 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、 3-(N-吗淋代)丙磺酸(以下 称为MOPS)、 3國(N画吗啉代)國2-羟基丙磺酸(MOPSO)、艰唤画N，N,画双(2画 乙磺酸)(PIPES)、艰噪-N，N，-双(2-羟基丙烷-3-磺酸)(POPSO)等。
緩冲液的pH为4 10,优选5~9。緩冲液的使用浓度优选为5~ 500mM，更优选10 200mM，特别优选20 ~ 100mM。作为胆固醇酯酶，如果是具有水解胆固醇酯的能力的酶，则没有特 别的限定，可以列举来源于微生物或动物的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶 等。已知这种酶的很多除了该酯酶活性之外，还同时具有脂蛋白脂肪酶 活性。本发明中，优选使用至少一种与胆固醇酯酶活性相比，脂蛋白脂 肪酶活性更强的胆固醇酯酶。
具体而言，优选使用至少一种以上的脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的
活性比率(月旨蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性)为12 ~ 7000，优选20 ~ 1000，更优选28~800的胆固醇酯酶，通过使用这种酯酶，可以提高该 酶对残粒样脂蛋白的选择性。而且，所谓脂蛋白脂肪酶活性，表示由使 用橄榄油乳剂的脂蛋白脂肪酶活性分析法计算时的活性单位(Horiiichi Y. etal， JBiochem 1976;80:367-370)，所谓胆固醇酯酶活性，表示由使 用胎儿牛血清的CEN活性分析法计算出的活性单位(Kameno Y. et al， Jap J Clin Path 1976;24:650)。
作为具有这种活性比率的胆固醇酯酶，可以列举例如LP(旭化成制 药公司制，活性比率460 ~ 800)、 LPBP(旭化成制药公司制，活性比率 5600~6900)、 CEN(旭化成制药公司制，活性比率13.0 ~ 16.0)、 CE(天 野酶社制，活性比率13.0 ~ 16.0)、 COE311(东洋纺社制，活性比率28.0 ~ 35.0)或与它们具有同等活性比率的酶，更优选将它们组合使用。具体可 以列举，CEN和LP、 COE311和LP等的组合。
作为胆固醇氧化酶，如果是具有氧化胆固醇而生成过氧化氢的能力 的酶，则没有特别的限定，可以列举，例如微生物或动物来源的胆固醇 氧化酶。
作为胆固醇脱氢酶，如果是具有氧化胆固醇而还原氧化型辅酶的能 力的酶，则没有特别的限定，可以列举，例如微生物或动物来源的胆固 醇脱氩酶。
而且，这些酶，可以是为了使该酶的特异性、稳定性进一步提高， 在以聚乙二醇作为主要成分的基团、水溶性的寡糖残基、磺丙基等上进 行化学修饰的酶，而且，也可以是通过基因操作获得的具有同等活性的 改良酶。
上述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆固醇脱氢酶的使用量，在反应
液中均优选0.01 ~ 200U/ml、更优选0.1 ~ 100 U/ml。
作为分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面 活性剂，可以是能够提高胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对 于残粒样脂蛋白的选择性的表面活性剂，换言之，可以是通过提高该酶 对残粒样脂蛋白的作用，或者使该酶对残粒样脂蛋白之外的脂蛋白的作 用降低，从而使对残粒样脂蛋白的酶反应相对地增强的表面活性剂。作 为分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂，可以优选列举，例如，月桂基 苯磺酸、十二烷基苯磺酸等的烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚 二磺酸或它们的盐类等，作为盐类，可以列举例如钠盐、钾盐、钙盐、 镁盐、铵盐等。具体而言，可以优选列举例如NEWREXR(烷基苯磺酸 钠；日本油脂)、NEOPELEX No.6、 NEOPELEX No.25(十二烷基^M^ 酸钠;花王)、PELEX SS-L(烷基二苯醚二磺酸钠;花王)、聚苯乙烯磺酸 钙(三和化学)等，其中，从提高酶反应的选择性的方面出发，特别优选 使用NEWREX R、 PELEX SS-L。
作为聚丙烯酸系高分子表面活性剂，可以列举聚丙烯酸盐、交联型 聚丙烯酸盐、聚丙烯酸盐共聚物等，作为盐，可以列举钠盐、钾盐等， 特别优选钠盐。具体而言，可以列举，例如Jurymer AC-103(聚丙烯酸 钠；日本纯药)、JurymerAC-20N(聚丙烯酸钠共聚物；日本纯药)、Rheogic 252L、 Rheogic 306L(交联型聚丙烯酸钠；日本纯药)等，这其中优选 Jurymer AC-103。
这种表面活性剂的使用浓度没有特别的限定，优选0.001~10%，更 优选0.01~5%，特别优选0.05~1%。
而且，本发明的测定方法中，进而优选联合使用与正常的脂蛋白中 所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反应的抗 apoB-100抗体。由此可以抑制与残粒样脂蛋白之外的脂蛋白的酶反应， 可以相对地增强与残粒样脂蛋白的酶反应。这种抗apoB-100抗体可以 是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，例如，优选抗人apoB-100小鼠 单克隆抗体(JI-H 、 JIMRO公司制)。
这种抗体的使用浓度没有特别的限定，但优选0.01 10mg/mL，更
优选0.1 ~ 5 mg/mL。
而且，抗apoB-100多克隆抗体可以按以下方式制备。也就是说， 作为免疫原使用的正常人血清LDL，可以使用用常规方法纯化的产品， 例如，可以按照超离心法(续生化学实验讲座3 "膜脂质和血浆脂蛋白" 597-612p)适当调制。然后，对于人之外的动物，单次乃至数次免疫这种 纯化的LDL，在血清中的抗体效价上升时取血，可以以抗血清的形式获 得。而且，该抗血清中存在与残粒样脂蛋白反应的抗体时，根据需要， 通过添加残粒样脂蛋白，吸收该脂蛋白，可以在测定中使用这种抗血清。
而且，作为抗apoB-100单克隆抗体的制备步骤，首先，以上述正 常人血清来源的纯化LDL作为抗原，使其与弗氏佐剂等混合，对小鼠 进行数次免疫，使免疫终止后摘出的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(例如， NS-1细胞等)融合，制备杂交瘤，获得克隆(特公平4-53516号公报)。产 生目的抗体的克隆的检索，可以通过比较对于上述正常人纯化LDL和 高脂血症患者来源的纯化LDL的结合性，选择与正常人纯化LDL较强 结合的杂交瘤，来获得目的克隆。本实施例中使用的单克隆抗体JI-H 按照该步骤制备。
而且，免疫动物还可以根据需要使用小鼠之外的动物，例如大鼠等。 此时，作为骨髓瘤细胞，可以优选使用Y3、 Agl23细胞等。
本发明的测定方法中，使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶时，通过胆 固醇的反应由氧生成过氧化氢。可以在例如过氧化酶的存在下，使用4-氨基安替比林和苯酚类，4-氨基安替比林和Trinder试剂或高敏感度的 色素源来定量生成的过氧化氢。
作为苯酚类，可以列举例如苯酚、4-氯酚、间甲酚、3-羟基-2，4，6-三 碘苯甲酸(HTIB)等。
作为Trinder试剂(同仁化学研究所第19版综合索引，2002年)，可 以列举N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-曱苯胺(TOOS)、 N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基 -3画磺丙基)-3,5-二曱氧基苯胺(DAOS) 、 N-乙基-N-磺丙基-m國甲苯胺 (TOPS)、 N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、 N,N-二曱基
-m-甲苯胺、N,N-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-m-茴 香胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二曱氧基苯胺、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲基苯胺、N-乙基 -]\-(2-羟基-3-磺丙基)-111-茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-]\-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-m-3-磺丙基-3-曱 氧基苯胺(APPS)、 N-乙基-N-3-磺丙基苯胺(ALPS)等苯胺类或N-乙基 -]\-(3-曱基苯基)-]\，-琥珀酰乙二胺(EMSE)、 N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-乙酰基二氨基乙烷等。
作为高敏感度的色素源，可以列举特公昭60-33479号公报中所示的 10-(1\-甲基氨基甲酰)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嚷(MCDP)、特公平 4-27839中所示的双[3- 二 (4-氯苯基)甲基-4- 二甲基氨基苯基胺 (BCMA)、特开昭62-296号公才艮中所示的化合物等。
作为这些色素源的浓度，优选0.01 10mM。
而且，^^用胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶时，通过胆固醇的反应，由 氧化型辅酶NAD(P)生成还原型辅酶NAD(P)H。 NAD(P)H，可以通过测 定300 ~ 500nm，优选330 ~ 400nm，特别优选约340nm处的反应液的 吸光度来定量。而且，NAD(P)H的定量还可以通过添加黄递酶、四唑 盐，使曱月替色素生成，对甲月替色素进行比色来实施。
反应在10 50n，优选30 40C通常在37L下，进行1 ~ 30分 钟，优选2 10分钟。
本发明的测定方法是使上述试剂作用于被检试样的方法，如果维持 被检试剂与上述表面活性剂，或与表面活性剂和正常的脂蛋白中所含的 载脂蛋白B-100反应、而不与变性的栽脂蛋白B-100反应的抗apoB-lOO 抗体反应，然后胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱 氢酶发生反应这样的作用顺序，则各试样的添加方法、添加顺序没有特 别的限制。而且，由于反应是在水性介质中进行，因此优选在緩冲液等 构成的水性介质中添加被检试样，于25t: 40lC搅拌调制后，添加本发 明的试剂，使之反应1~10分钟，进行测定。
因此，本发明试剂的构成为，分别各自准备含有表面活性剂的试剂，
含有表面活性剂和与正常的脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不 与变性的载脂蛋白B-100反应的抗apoB-100抗体的试剂，含有胆固醇 酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氩酶的试剂，或者也可 以由它们作为一个整体来构成。分别构成时，可以将它们依次添加来使 用或者也可以一次性添加来使用。
而且，上述各试剂可以是液状，也可以是片剂、粉末等固体形状。
另外，这种测定试剂中，根据需要，可以使之含有用于将生物试样 中的球蛋白等蛋白质可溶化的各种盐类、脂蛋白凝集剂、其它酶等。
作为这种盐类，可以列举氯化钠，硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化 镁、硫酸镁、醋酸镁、氯化锂、硫酸锂、氯化铵、硫酸铵、硝酸镁、硝 酸钾等，在0 100mM的范围内使用。
作为脂蛋白凝集剂，可以列举鵠磷酸盐、葡聚糖硫酸盐、肝素等的 聚阴离子，镁、钙、钴等二价的金属盐。作为其它酶，可以列举抗坏血 酸氧化酶等。
而且，适用于本发明的被检试样没有特别的限定，具体而言，对于 生物体试样，可以使用血液本身或血浆、血清等血液成分。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更详细的说明。 实施例1
(1) 试样的调制
将血清成分分离为残粒样脂蛋白部分，LDL部分和HDL部分，进 行各脂蛋白的测定。该蛋白质的分离方法如下所示。
分别制备抗apoB-100抗体结合亲合层析柱、抗apoA-l抗体结合亲 合层析柱，添加血清，回收结合部分，分别作为LDL、 HDL。而且， 在前述两根层析柱上添加血清，回收只流过的部分，作为残粒样脂蛋白 部分(RLP)。各个脂蛋白用HPLC分析进行确认。而且，用总胆固醇测 度用试剂试剂盒将各脂蛋白中的胆固醇的浓度调制为5mg/dl。
(2)测定试剂的调制
制备下述所示的残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定试剂。 表l 试剂1
Good's緩冲剂pH6.8(PIPES,同仁化学社制) 50mM HDAOS(同仁化学社制) lmM 表面活性剂(参照表l;本发明品1~2，比较品2~8)
试剂2
Good's緩冲剂pH6.8(BES，同仁化学社制) 4-氨基安替比林(关东化学社制) 过氧化物酶(天野酶社制) 胆固醇酯酶
(COE311:活性比率31.8、东洋紡社制) 胆固醇氧化酶(天野酶社制) (3)测定方法 结果
50mM 3mM
10单位/mL 15单位/mL
6单位/mL
将试剂1装入210 n L分光光度计的小室中，添加20 n L试样进行 搅拌，于371C加温。然后，在344秒后添加70nL的试剂2,进行搅拌， 在主波长572nm和副波长748nm处进行测定直到667秒后。
求出添加试剂2时，即344秒后(测光点20)至667秒后(测光点38) 的吸光度变化量，计算对于RLP、 HDL和LDL而言以RLP的吸光度 变化量为100时的相对比率。结果示于表2和图1~14中。
表2<image>image see original document page 12</image>
根据表2和图1~14，本发明品1~6，与比较品1~8相比，都抑制 针对LDL和HDL的酶反应，而针对RLP的酶作用的选择性显著上升 了。
实施例2
然后，使用自动分析装置TBA-20R(东芝)，按照本发明测定方法测 定人血清中的RLP-胆固醇量。使用NUREXR(本发明品)作为表面活性 剂。
试样人血清106样品
表3
试剂1
Good's緩冲剂pH6.8(PIPES，同仁化学社制) 50mM HD AOS(同仁化学社制) lmM NUREX R (日本油脂牙土制) 0.01%
试剂2
Good's緩冲剂pH6.8(BES，同仁化学社制)
4-氨基安替比林(关东化学社制)
过氧化物酶(天野酶社制)
胆固醇酯酶
(COE311:活性比率31.8、东洋纺社制) 胆固醇氧化酶(天野酶社制)
50mM 3mM
10单位/mL 15单位/mL
6单位/mL
测定方法为，将试剂1装入210 jjL分光光度计的小室中，添加5 HL血清进行搅拌，于37C加温。然后，在344秒后添加在37C下预加温的70jliL的试剂2，进行搅拌，在主波长572nm和副波长748nm 处进行测定直到667秒后。
求出测光点34 ~ 38(595 ~ 667秒)的吸光度(空白测光点15 ~ 19(251 ~ 328秒))，获得与市售的RLP-胆固醇测定试剂盒(JIMRO公司 制)的相互关系(图15)。根据图15确认其结果为，用本发明的测定方法 求出的值与试剂盒之间有高度相关性。
实施例3
使用自动分析装置7080(日立)，通过本发明的测定方法测定人血清 中的RLP-胆固醇量。而且，使用PELEXSS-L(本发明品4)作为表面活 性剂，使用COE311(活性31.8)和LP(活性比率512)作为胆固醇酯酶。
试样人血清 30样品
表4
试剂1
Good's緩冲剂pH6.5(PIPES，同仁化学社制) 50mM HD AOS(同仁化学社制) 1 mM
PELEX SS-L 0.02%
试剂2
Good's緩冲剂pH6.5(PIPES，同仁化学社制)
4-氨基安替比林(关东化学社制)
过氧化物酶(天野酶社制)
胆固醇酯酶
50mM
3mM 10单位/mL 10单位/mL
(COE311:活性比率31.8、东洋纺社制)
胆固醇酯酶
20单位/mL
(LP:活性比率Sl2、旭化成制药>^司制)
测定方法为，将血清5pL装入分光光度计的小室中，添加210nL 试剂1，进行搅拌，于37C加温。然后，在320秒后添加70nL的试剂 2，进行搅拌，在主波长570nm和副波长750nm处进行测定直到980 秒后。
求出测光点33(660秒)和测光点17(340秒)的吸光度差，获得与市售 的RLP-胆固醇测定试剂盒(JIMRO公司制)的相互关系(图16)。根据图 16确认其结果为，用本发明法求出的值与市售的试剂盒之间有高度相关 性(R-0.9294)。
实施例4
使用自动分析装置7080(日立)，通过本发明的测定方法测定血清中 的RLP-胆固醇量。
试样人血清 27样品
表5
试剂1
PIPES ( pH6.8 )(同仁化学社制) 胆固醇氧化酶(天野酶社制) PELEX SS-L(花王社制) HDAOS(同仁化学社制) 抗apoB-lOO单克隆抗体 (JI-H，(林)JIMRO社制) 试剂2
50mM 2U/mL 0.05% lmM
lmg/mL
BES(pH6.8)(同仁化学社制)
50mM
胆固醇酯酶(东洋纺社制) 15U/mL 过氧化酶(天野酶社制) 10U/mL 4-氨基安替比林(关东化学社制) 3mM 牛血清白蛋白(SIGMA-ALDRICH JAPAN公司制) 0.1 % 测定条件 方法
如下述方式设定测定参数进行测定。 测定方法Rate法测试读数时机[22-[25
试样量5juL Rl量210 pL R2量70 nL 测定波长主波长570nm 副波长750nm 测度温度37匸
在5nL样品中添加210pL试剂1,进行搅拌，于37X:加温。然后， 在5分钟后添加70 n L的试剂2，进行搅拌，在主波长570nm和副波长 750nm处进行测定。求出试剂2添加后的每1分钟时的吸光度变化量， 获得与市售的RLP-胆固醇测定试剂盒(JIMRO爿>司制)的相互关系(图 17)。根据图17确认其结果为，添加apoB-lOO抗体的情况与未添加相 比，与试剂盒之间有更高的相关性。
权利要求
1.一种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法，通过使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用于含有脂蛋白的被检试样，测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，从而测定脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
2. 根据权利要求l所述的测定方法，其特征在于，还使用与正常 脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反 应的抗apoB-100抗体。
3. 根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，使表面活 性剂或使表面活性剂和抗apoB-100抗体作用于被检试样后，使胆固醇 酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用，其中所述抗 apoB-100抗体与正常的脂蛋白中所含的栽脂蛋白B-100反应、而不与变 性的载脂蛋白B-100反应。
4. 根据权利要求1~3中任一项所述的测定方法，其特征在于，作 为表面活性剂，使用烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚二磺酸或 它们的盐类或聚丙烯酸盐。
5. 根据权利要求1~4中任一项所述的测定方法，其特征在于，使 用至少l种脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率为12~7000的胆固 醇酯酶，其中所述活性比率是指脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性。
6. —种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定试剂，其特征在于，含有 胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氩酶，以及分子 中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
7. 根据权利要求6所述的测定试剂，其特征在于，还含有与正常 脂蛋白中所含的载脂蛋白B-100反应、而不与变性的载脂蛋白B-100反 应的抗apoB-lOO抗体。
8. 根据权利要求6或7所述的测定试剂，其特征在于，表面活性 剂是烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚二磺酸或它们的盐类或聚 丙烯酸盐。
9. 根据权利要求6~8中任一项所述的测定试剂，其特征在于，使 用至少l种脂蛋白脂肪酶与胆固醇酯酶的活性比率为12 ~ 7000的胆固 醇酯酶，其中所述活性比率是指脂蛋白脂肪酶活性/胆固醇酯酶活性。
全文摘要
本发明提供一种操作更为简便且敏感度良好的测定试样中的残粒样脂蛋白中的胆固醇的方法和测定试剂。一种残粒样脂蛋白中的胆固醇的测定方法，通过使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、或胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作用于含有脂蛋白的被检试样，测定由酶反应生成的过氧化氢或还原型辅酶，来测定脂蛋白中的胆固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系高分子表面活性剂。
文档编号C12Q1/26GK101374957SQ200780003240
公开日2009年2月25日 申请日期2007年1月19日 优先权日2006年1月20日
发明者中野隆光, 新见学, 荻原富美子, 金谷一司 申请人:株式会社Jimro