专利名称：：旋光手性胺的制备方法旋光手性胺的制备方法本发明涉及一种制备旋光手性胺的方法。手性胺在药物、农业化学和化学工业中起着重要的作用。它们经常被用作各种生理学例如药学活性物质如头孢菌素或吡咯烷衍生物的制备用中间体或合成子(syn仇on)。在手性胺的各种大量应用中，只有一种特定的旋光形式，(R)或(S)对映体具有期望的生理学活性。因此，迫切需要提供旋光活性形式的手性胺的制备方法。这些需要可通过加入手性羧酸对非对映体盐进行结晶来制备手性胺(Breuer等.，AngewandteChemie(2004)116,806-843)*而部分得到满足。其他化学方法采用将含有C=N双键的手性前体还原的对映选择性合成法。另外，采用各种酶如蛋白酶、酰胺酶或脂肪酶对外消旋体进行立体选捧性拆分，这是已知的(Bornscheuer和Kazlauskas,HydrolasesinOrganicSynthesis(2005)，Wiley-VCHWeinheim)。特定的转氨酶，即包括a-11^酸氨基转氨酶的a-转氨酶适合用于制备光学纯的氨基酸，这也是已知的(Bartsch等.，Appl.Environm.Microbiol.(1996)62,3794-3799,Cho等.，Biotechnol.Bioeng.(2003)83，226-234,JPOll53084A2(1998),JP63304986A2(1988),EP0248357A2和Ziehr等.，Biotechnol.Bioeng.(1987)29,482-487)。但是，现有技术中的这些方法存在各种缺陷。尽管与传统方法相比，酶法通常采用有利的温和条件，并且能获得适当的立体选择性，但是它们一般都使用酶，而且酶法的底物特异性、对映体选择性和/或转化率对于工业应用来说不够高。此外，使用转氨酶制备旋光性胺最突出的缺点之一是经常发生底物和产物抑制现象。因此，本发明的一个目的是提供一种制备旋光手性胺的改进的方法，特别是具有改进的底物特异性、改进的对映体选择性和尤其是能使离析物的转化率高达100%的方法。本发明通过提供旋光手性胺的制备方法解决了本发明的技术问题，所述方法包括a)提供氨基受体和^给体，b)使JL^受体和JL^g与转氨酶，特别是(R)-或(S)-选择性转氨酶反应，c)获得所期望的旋光手性胺和oc-酮副产物。按照本发明的一个优选实施方案，在随后的其他任选步骤中，从步骤c)得到的反应混合物中分离提纯出步骤c)中得到的旋光手性胺。本发明的反应机理的反应路线如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>因此，本发明提供一种手性胺的不对称合成法，所述方法通过采用至少一种转氨酶从而得到所期望的产物，所述转氨酶用于将JL^由JU^给体转移至氨基受体的转氨作用。取决于所用的具体转氨酶的对映体优先选择性，可得到具有期望的光学立构的旋光手性胺，即(R)或(S)对映体。因此，在本发明的一个实施方案中釆用用于不对称合成的(S)-选择性转氨酶产生期望的手性胺(S)对映体；而在本发明的另一实施方案中采用(R)-选择性转氨酶产生期望的(R)对映体。除了期望的旋光性胺，所述反应还产生酮副产物，特别是oc-酮副产物，所述副产物由所用的M给体，和(可能的话)未转化的氨基受体和^JJH^产生。本发明的上下文中的转氨酶是催化氨基转移的磷酸吡哆醛依赖性酶。转氨酶以E.C.2.6.1.X分类。在本发明的特别优选实施方案中，转氨酶是(R)或(S)选择性转氨酶，在优选的实施方案中特别为co-转氨酶。本发明上下文中的oo-转氨酶优选为分类号为E.C.2.6.1.18的酶。这些Jl^转氨酶的特征在于，它们主要以胺作为底物。这些酶的进一步的特征在于，具有大于1的(O-转氨酶催化反应平衡常数。根据本发明可以使用的co國转氨酶描述在例如Lwasaki等.，Biotechnol.Lett.(2003)25,1843-1846;Shin等.，Biotechnol.Bioeng.(1997)55,348-358;Shin和Kim,BookofAbstracts,217thACSNationalMeeting,Anaheim,Calif"March21-25,(1999)180;Shin和Kim，Biosc.Biotechnol.Biochem.(2001)65，1782-1788以及Shin和Kim,Biotechnol.Bioeng.(1998)60,534-540。因此，在本发明的优选实施方案中，所述转氨酶，特别是本方法中所用的co-转氨酶为特别是由河流弧菌(W^7》_/7"v/fl//s)获得的co-转氨酶，特别是源自JS17菌林的转氨酶。在另外的优选实施方案中，所述转氨酶源自反硝化产碱菌(^/^/^^^^/^|/加7^朋力，特别是源自Y2k-2菌抹。在另外的优选实施方案中，所述转氨酶源自肺炎克雷伯氏菌(JT/WW//meM/iiwiiV^)，特别是源自YS2F菌株。在另外的优选实施方案中，所述转氨酶源自苏云金芽孢杆菌(必fl"7/ws幼MnVig/e"s/s:)，特别是源自JS64菌株。菌抹的定义参见上文的Shin和Kim,1998。当然，也应当理解本发明中的术语转氨酶、特别是co-转氨酶是含有转氨酶、特别是w-转氨酶的有机体如微生物或细胞的提取物；或含有转氨酶、特别是(o-转氨酶的活细胞或死细胞或微生物本身。所述微生物或细胞或提取物或转氨酶可以以固定形式或非固定形式使用。所述转氨酶、特别是co-转氨酶，也可以是天然重组产生或基因修饰的转氨酶，特别是由一种上述有机体中所含有的核酸序列或其衍生物部分编码或完全编码的co-转氨酶或其等同物。本发明上下中的术语旋光手性胺所涉及的主题与术语对映体活性(enantiomericallyactive)手性胺相同。这些术语特别是指基本上不含有，在更优选的实施方案中甚至不含有不希望的对映体的制剂。因此，旋光手性胺实质上含有过量的一种对映体或甚至只由一种对映体组成。特别地，本发明上下文中的旋光手性胺的光学纯度为至少70%，特别地为大于90%，最好>99%。本发明中的光学纯度是以一种对映体相对于另一种对映体的过量。/o表示的。因此，光学纯度("/。是指(R)和(S)对映体浓度之差与二种对应体浓度之和的商(A的光学纯度(。/。)=([A-[B]):([A]+[B)x100，其中A和B表示(R)和(S)对映体的浓度，或>^之亦然)。本发明中，优选氨基受体转化为所期望的手性胺的转化率为至少40,50，60，70,80，卯，95，特别地为100%。用于分析光学纯度和转化率的浓度可由例如气相色镨法(GC)或光度计法或荧光计法测定。在本发明上下文中，氨基受体为能够接受由M给体通过转氨酶，特别是co-转氨酶转移过来的氨基的分子。在本发明的特别优选的实施方案中，所述氨基受体含有酮官能团。在本发明的特别优选的实施方案中，所述氨基受体选自苯丙酮酸及其盐、丙酮酸及其盐、苯乙酮、2-酮戊二酸(2-ketoglutarate)、3-氧代丁酸(oxobutyrate)、2-丁酮、3-氧代"比咯烷(3-OP)、3-吡咬基甲基酮(3-PMK)、3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)、3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)、N-l-boc-3-氧代哌啶酮、N-l-boc-3-氧代吡咯烷(B30P)、3-氧代哌啶、烷基-3-氧代丁酸酯(alkyl-3-oxobutonoate)，曱氡基丙酮和1-氧代四氲萘酮。在特别优选的实施方案中，氨基受体为B30P。本发明上下文中的^^体为在使用转氨酶、特别是co-转氨酶时，能够为氨基受体提供氨基的分子。在特别优选的实施方案中，所述M*是胺或#^酸。在特别优选的实施方案中，所述^IU^体选自P-丙氨酸，丙氨酸特别是D,L-丙氨酸、L-丙氨酸或D-丙氨酸，oc-甲基千基胺(oc-MBA)，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，3-氨基丁酸，异丙胺，2-氨基丁烷，丁酸和其中任一种的盐如氯化物。在特别优选的实施方案中，得到的酮产物可为苯丙酮酸及其盐、丙酮酸及其盐、乙醛酸及其盐、苯乙酮、2-酮戊二酸、丙酮、3-氧代丁酸、2-丁酮、3-氧代吡咯烷(3-OP)、3-吡^&甲基酮(3-PMK)、3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)、3-氧代戊酸曱酯(3-OPME)、N-l-boc-3-氧代艰咬酮、N-l-boc-3-氧代吡咯烷(B30P)或它们中的任一种的盐如氯化物。在特别优选的实施方案中，JUJ^是丙氨酸，特别是L-丙氨酸。在另外优选的实施方案中，本发明涉及一种制备旋光手性胺的方法，所述胺选自具有旋光性氨基的胺，特别是具有烷基、支链烷基或芳烷基的胺。特别地，这些胺(特别是单或双环胺)，特别地为5或6元环、或S-、O-或N-取代的杂环烃基或芳香胺，特别地为烷基或烷H^取代的芳香胺。在优选的实施方案中，得到的手性胺选自苯丙氨酸、丙氨酸、3-M哌咬、烷基-3-^J^-丁酸酯、3-氨基吡咯烷(3-AP)、3-吡^-l-乙胺(3-PEA)、N-l-boc-3-氨基吡咯烷(B3AP)、3-氨基丁酸乙酯(3-ABEE)、3画^^戊酸甲酯(3画APME)、oc-甲基千基胺(oc画MBA)、1醒^J^四氢化萘、oc-甲基-4-(3-吡>^)-丁胺、谷氨酸、P-#^丁酸(P-aminobutyrate)、仲丁胺、甲IL^异丙胺、3-M吡咯烷的衍生物、l-N-Boc-3-^&哌啶、头孢菌素和头孢菌素的衍生物。在特别优选的实施方案中，本发明因此预见到使30P与(S)或(R)选择性转氨酶以及JUJ^反应，获得旋光性(S)或(R)-3AP。在另外的优选实施方案中，本发明预见到4吏3-PMK与(R)或(S)选择性转氨酶以及JISJH^反应，获得旋光性(R)或(S)3-PEA。在另外的优选实施方案中，本发明预见到使3-OBEE与(R)或(S)选择性转氨酶以及JUJ^反应，获得旋光性(R)或(S)3-ABEE。在另外的优选实施方案中，本发明预见到使3-OPME与(R)或(S)选择性转氨酶以及^JJ^反应，获得旋光性(R)或(S)3-APME。在另外的优选实施方案中，本发明预见到将B30P与(R)或(S)选择性转氨酶以及Jl&给体，尤其是丙氨酸反应，获得旋光性(R)或(S)B3AP。在特别优选的实施方案中，本发明涉及B30P与^^给体、特别是丙氨酸，在转氨酶的存在下反应以获得旋光性B3AP和丙酮酸，其中，所述反应在pH为5.0~9.5、优选为6.0~7.0、特别地为6.0~6.9下反应30~70分钟、特别地4065分钟、特别地5060分钟。在特别优选的实施方案中，所述转氨酶为(R)选择性转氨酶。在另外的优选实施方案中，所述转氨酶为(S)选择性转氨酶。在优选的实施方案中，B30P与^itJJ^体，特别是与丙氨酸的所述反应是在至少一种丙酮,羧酶(PDC)存在下进行的。在另外的优选实施方案中，B30P与^J^^,特别是与丙氨酸在至少一种丙酮,羧酶存在下的所述反应在同时在反应混合物中引入氮气的条件下进行，以除去通过PDC的作用由生成的丙酮酸得到的乙醛。在另外的优选实施方案中，B30P与^IL^体，特别是与丙氨酸在至少一种丙酮酸脱羧酶的存在下的所述反应在至少一种乙醇脱氢酶(ADH)的存在下进行，以除去通过PDC的作用、由生成的丙酮酸得到的乙醛。在另外的优选实施方案中，所述B30P与M给体、特别是丙氨酸，在至少一种丙酮酸脱羧酶的存在下的所述反应在同时向反应混合物中引入氮气的条件下进行，其中《^应介质中存在至少一种乙醇脱氢酶以除去通过PDC的作用、由生成的丙酮酸得到的乙醛。在本发明另外的优选实施方案中，本发明预见到将苯乙酮与(R)或(S)选择性转氨酶以及^^反应，以获得旋光(R)或(S)oc-MBA。在另外的优选实施方案中，本发明预见到将氨基受体，特别是单或双环、含氧桥基(oxogro叩)的5~6元环或S-、O-或N-取代的杂环烃基或芳族氨基受体，特别是烷基或烷lL&取代的芳族氨基受体与JtJ^^以及(R)或(S)选择性转氨酶反应，以获得旋光性胺，特别是单或双环胺，特别是5~6元环或S-、O-或N-取代的杂环烃基或芳香胺，特别是烷基或烷lt^取代的芳香胺，特别是以(S)或(R)形式获得旋光性胺。在本发明的特别优选的实施方案中，氨基受体和M给体的反应使用转氨酶，在水性介质，如生理緩冲液中进行。在特别优选的实施方案中，转氨化反应在pH为5.0~9.5或5.0~9.0,特别地为7~8.5下进行。在特别优选的实施方案中，本发明预见到将氨基受体和M给体在pH为6.0~7.0，优选为6.0~6.9下进行反应。在特别优选的实施方案中，所述反应在温度为10~65n，优选为20~50"C,特别地为18~25匸，优选为室温、或34匸39t:，特别地为371C下进行。在本发明另外的优选实施方案中，氨基受体和JtJJ^以1:50~1:200的摩尔比，特别地为1:50~1:100，特别地为1:100，特别地为1:1~1:5,特别地为1:1~1:2提供。在本发明的优选实施方案中，酶活性可为1~20.000jimol/min。在另外的优选实施方案中，所述反应的及k应时间为3070,优选为40~65,特别地为5060分钟。在特别优选的实施方案中，本发明涉及一种如上所述的制备旋光手性胺的方法，即，在所述第一步骤a)中提供氨基受体和^J^体，在第二步骤b)中将氨基受体和^J^给体与至少一种co-转氨酶反应，在第三步骤c)中获得光学纯手性胺和a-酮副产物，在另一步骤d)中将步骤c)中得到的酮副产物、特别是oc-酮副产物从得到的反应混合物中除去，特别是通过与酶的反应除去，也就是说通过酶的分解，特别是采用选自脱羧酶、合酶或脱氲酶的酶进行酶分解而除去。在特别优选的实施方案中，步骤C)中得到的酮副产物、特别是丙酮酸通过与丙酮酸脱羧酶(PDC)如得自酿酒酵母(5ViccA^wi^c^cem^wVie)、酵单胞菌(々附o附o"as1附o緣.s)或標榈发酵细菌(々附"6fl"er/m/附"e)的丙酮酸脱羧酶的反应而除去，从而优选产生乙醛和co2。在另外的优选实施方案中，本发明涉及一种方法，其中获得的酮产物、特别是丙酮酸通过PDC的作用而被除去，其中由此生成的乙醛通过例如化学、酶或物理处理而除去。在另外的优选实施方案中，本发明涉及一种方法，其中获得的酮产物、特别是丙酮酸通过PDC的作用而被除去，其中由此生成的乙醛通过例如向>^应混合物中通入氮气而除去，优选向反应混合物中连续通入所述氮气以从反应混合物中除去乙醛。在另外的优选实施方案中，本发明涉及一种方法，其中获得的酮产物、特别是丙酮酸通过PDC的作用而被除去，其中由此生成的乙醛通过乙醛与至少一种乙醇脱氢酶(ADH)的反应而从反应混合物中除去，并且所述乙醛转化为乙醇。在另外的优选实施方案中，本发明涉及一种方法，其中获得的酮产物、特别是丙酮酸通过与PDC的作用而被除去，其中由此生成的乙醛通^±^>^应混合物施加减压而除去。在另外的优选实施方案中，本发明涉及一种方法，其中获得的酮产物、特别是丙酮酸通过PDC的作用而被除去，其中由此生成的乙醛通过化学反应而除去。在另外的优选实施方案中，本发明涉及一种方法，其中获得的酮产物、特别是丙酮酸通过PDC的作用而被除去，其中由此生成的乙醛通过例如向反应混合物中通入氮气，优选向反应混合物中连续通入氮气而除去，并且其中另外使乙醛与至少一种乙醇脱氢酶(ADH)反应以从反应混合物中除去所述乙醛，并且所述乙醛转化为乙醇。在另外的优选实施方案中，步骤c)得到的酮产物、特别是丙酮酸通过与乳酸脱氢酶(LDH)例如得自大肠杆菌(&c/imV^/flco/,)的乳酸脱氲酶反应而被除去，从而优选得到L-乳酸。在另外的优选实施方案中，步骤c)得到的酮产物、特别是丙酮酸通过与乙酰乳酸^酶反应而被除去，从而优选得到乙酰乳酸。在另外的优选实施方案中，步骤C)得到的酮产物、特别是丙酮酸连续M反应混合物中除去。这些特别优选的实施方案具有能获得特别高的转化率的优点，因为所述方法从平衡>^应中除去了作为副产物的酮产物。迫^A应向产物方向进行，因而获得了对目标产物的高立体选择性以及高转化率。本发明还涉及制备生理活性化合物或用于制备它们的前体和/或中间体的方法，所述生理活性化合物或它们的前体和/或中间体特别地选自3-氛基吡咯烷衍生物、头孢菌素、头孢菌素衍生物、杂环硼酸、L-二羟苯丙氨酸(L-Dopa)、oc-甲基多巴、D-苯基甘氨酸、P-羟基苯基甘氨酸、草铵膦酸(phosphinothricine)、嘧咬并衍生物和吡咯烷酮衍生物，其中可釆用本发明任何一种上文定义的方法。在本发明的上下文中，生理活性化合物为对植物、动物、人、酵母或微生物如原生动物、细菌或病毒具有生理活性的化合物，也就是说，能与有机体的新陈代谢相互作用的化合物。本发明另外的优选实施方案为从属权利要求的主题。通过下文的实施例和附图，对本发明作更详细的说明。附图解釋4兌明本发明。图l所示的是薄层色镨图。图2所示的是河流弧菌(0-TA的相对活性对pH值的依赖性。图3所示的是用不同物质进行培养时B3AP浓度的相对下降。图4所示的是在存在丙酮酸和乙醛时B3AP转化率的相对下降。图5所示的是不同压力下B30P到B3AP的转化率与时间的关系。图6所示的是在不同PDC存在下B30P到B3AP的相对转化率。图7所示的是丙氨酸浓度的升高以及PDC浓度的升高对B3AP的不对称合成的影响。图8所示的是在升高的丙氨酸浓度下B30P到B3AP的转化率。图9所示的是B30P到B3AP的转化率与相对PLP的依赖性。图10所示的是B30P到B3AP的相对转化率与N2存在的关系。图11所示的是在ADH存在下B30P到B3AP的相对转化率。实施例1:B3AP的不对称合成B3AP的不对称合成是在1.5ml的反应管中进行的。采用B30P作为氨基受体，其浓度为5mM(7.5jimo1)。所用的絲给体L-丙氨酸的浓度为5mM。所用试剂和所采用的反应条件见下表l。表l:采用(S)-w转氨酶将丙氨酸的氨基转移至B30P的(S)-B3AP的不对称合成反应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>所用緩冲液为50mM的磷酸钠，pH为7。TA7是指源自河流弧菌的co-转氨酶(JtilichFineChemicals,德国)。TA8是指源自反硝化产碱菌的co-转氨酶(JiilichFineChemicals,德国)。用大肠杆菌提取物作为乳酸脱氢酶。另外，加入NADH直至最终浓度为10mM。丙酮,羧酶的浓JLA变化的。釆用了1.5单位(20pl)和15单位(200jil)酿酒酵母的丙酮,羧酶(PDC1)。采用2单位(3.4nl)和20单位(34nl)酵单胞菌的丙酮躯羧酶(PDC2)。表2:采用TA8进行B3AP的不对称合成所得到的转化率和光学纯度。计算结果基于0(:分析(+/-5%)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>现在参照上表2，显然，在采用了co-转氨酶TA8的6个试验的每一个中，能够获得光学纯度非常高的所得(S)-B3AP。还可以观察到，如果不影响反应平衡(试验l),则无论使用TA7还是TA8，转化率仅仅为中等。采用10-50倍过量的丙氨酸只能稍微提高转化率。在试验3、4、5和6中，在转氨化反应过程中从反应体系中除去了反应的酮产物，即丙酮酸。采用TA8和源自大肠杆菌的乳酸脱氢酶(试验6)显著提高了转化率，同时保持甚至提高对映体选择性。该规律对于源自酵单胞菌的丙酮B羧酶实质上也适用(试验35)。但是，PDC1只能稍微提高转化率，PDC2如果反应24小时则能中等程度提高转化率(试验4)，而反应72小时则能显著提高转化率(试验5)。除了试验5的反应时间为72小时以外，所有的反应都进行了24小时。附图所示的是按表l进行的反应的薄层色镨图。"A"表示源自反硝化产碱菌的co-转氨酶，而"V"表示源自河流弧菌的co-转氨酶；"K"表示单独釆用TA7或TA8的试验l(试验1)。PDC1表示用酿酒酵母丙酮自羧酶进行的试验(试验3),LDH表示用源自大肠杆菌的乳酸脱氢酶进行的试验(试验6),PDC2表示用酵单胞菌丙酮酸脱羧酶进行的试验(24小时和72小时后)(试验4和5)。因此，结果清楚地表明可以以非常高的对映体选择性由前手性酮B30P制备(S)-B3AP。但是，采用co-转氨酶作为制备方法中唯一的酶，得到中等的转化率。这种中等的转化率可通iWw平衡反应中除去丙酮酸而得到大幅提高，特别是采用乳,氢酶或丙酮自羧酶。尤其是采用丙酮自羧酶，具有不需要辅因子回收(NADH)(co-factorrecycling)的优点。另外有利地用PDC酶去除丙酮酸，并由此具有额外的优点，即消除或避免产物(产物酮)抑制以及^Jl应平衡右移从而获得较高的转化率(理想情况下为100%)。实施例2:在(S)-aMBA转化为苯乙酮的转化Jl应中co-转氨酶活性的pH值依赖性在石英比色杯中进行合成，釆用50nl100mM丙酮酸，4单位/ml的河流弧菌(后文也称之为，co-TA(12jil)和388jul磷酸钠緩冲液，50mM，pH值以0.2的梯度由pH6.0向pH7.4变化。以50jli1100mM(S)-ocMBA作为^JJ^开始进行反应，测量在250~260nm处的吸光度增大。所述吸光度增大是由于苯乙酮的生成造成的。其他底物对吸光度没有明显的影响，因此反应速率可以通过测量苯乙酮的吸光度而加以确定。将pH值为7.4时的活性i殳定为100%，计算其他pH值时的相对活性，结果见图2。图2所示的是河流弧菌co-TA的相对活性与给定pH值的关系。图2表明在低pH值如6.0、6.2或6.4时，还存在相当的活性，例如在pH值为6.0时，活性为11%。这样，该结果表明，即使在低pH值时，也能获得显著的转氨酶活性，从而使底物的反应能在低pH值下进行，进而允许通过采用对较高pH值敏感的PDC来提高转化率。实施例3:不同pH值下B3AP的不对称合成在本实施例中，由丙氨酸和B30P不对称合成B3AP，是在存在或不存在丙酮Wt羧酶(PDC)下进行的。对于pH值为6.0、6.4和7.0的每种情况，都进行了三次试验。试验1采用酵单胞菌(野生型细胞提取物)PDC,试验2采用棕榈发酵细菌的PDC(在大肠杆菌中的重组体)，试验3为不采用PDC、仅釆用转氨酶的对照试验。为获得比较结果，两种PDC的活性都在pH值为6下用乙醇脱氢酶进行测定，在上述试验中采用具有相同活性量的PDC。表3给出了所用的物质的体积(ia1)。每种>^应试验在pH值为6.0、6.4和7.0下进行三次。pH值用B30P底物溶液的緩冲液调节。pH值为7.0时，PDC的活性为约2.5单位/ml。底物和酶的浓度也能从下表3中很明显地看到。IO分钟，30分钟，60分钟和120分钟后，提取IOO|i1试样，并加入100卩11MNaOH中止反应。采用CE(毛细管电泳)对B3AP的浓度ii行定量分析。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>下表4所示的是对于不同的PDC,在不同pH值下的转化率。很明显，PDC的使用提高了转化率。同样明显，源自棕榈发酵细菌(Z/;")的PDC的转化率比源自酵单胞菌(Z附o)的PDC的转化率高一些。同样明显，在低pH值如6.0或6.4下，观察到采用PDC的试验的转化率有显著的提高，而在没有PDC的对照试验中则观察不到。在所有的反应试验中，都能观察到120分钟后转化率下降。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>n.d.=没有测定实施例4:在不对称合成反应的不同反应物存在下B3AP的稳定性为了表示在不同反应物存在下B3AP的稳定性，在反应管中，在下表5所列的不同反应物的存在下，对1mMB3AP进行3小时的培养。本实施例是在pH值6和7(磷酸钠緩冲液)下进行的。反应物刚开始反应即提取第一个试样T。，3小时后提取另一个试样1\。萃取后，通过CE用内标(ocMBA)法确定胺的浓度。从获得的浓度差，计算出B3AP浓度的下降。/。(参见图3)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>从图3可以看出，不同反应物对B3AP浓度没有显著影响(试验1~9)。反应试验11~13表明了乙醛的影响。从试验ll可以清楚地看出，在不存在转氨酶时，B3AP浓度没有下降；而当存在转氨酶和乙醛时，可以观察到B3AP浓度大幅下降。乙醛在转氨酶反应中起着氨基受体(如丙酮酸)的作用，明显导致B3AP浓度的下降。实施例5:B3AP与氨基受体丙酮酸和乙醛的反应本实施例中表明了用于底物B3AP和丙酮酸以及用于B3AP和乙搭的河流弧菌和反硝化产碱菌co-TA的转氨酶活性。将2mMB3AP与2mM丙酮酸或2mM乙醛反应(相对于每0.5ji1反应体积的36pl>^硝化产碱菌04^)或6pl河流弧菌(，的转氨酶，对应于2单位/n1转氨酶反应30分钟)。图4所示的是结果。B3AP通过这两种酶转化为B30P，其中这两种酶中的每一种与丙酮酸和与乙醛一^^吏用时没有明显的差异。实施例6:B3AP在减压、pH6条件下的不对称合成在本实施例中，对反应混合物施加减压，以进行不对称合成反应来生成B3AP。作为对照试验，在常压、没有PDC的糾下进行同样的反应。反应終最^L积1.5ml50mM磷酸钠緩沖液，pH6300fil河流弧菌转氨酶60jUZ/wi-PDC(相应于pH7时8单位/ml)5mMB30P10mMD,L-丙氨酸0.1mMTPP,PLP5mMMgCl2减压是用旋转蒸发器施加的(150毫巴)。用CE进行测量。图5所示的;l—在不同压力下，B30P到B3AP的转化率与时间的关系。显然，转化率与施加的压力几乎无关。关于所达到的最大转化率，在150亳巴压力下的转化率与在1000亳巴压力下的转化率相似。实施例7:不同丙酮B羧酶的比较在本实施例中，釆用了三种不同的丙酮酸脱羧酶用于不对称合成B3AP。除了pH值为7之外，反应条件与实施例6相同。采用了源自酵单胞菌、棕榈发酵细菌的PDC和得自Biocatalytics的PDC(目录号PDC-101)。所述PDC由ADH检测得到的活性相同(1.6单位/ml)。图6表明所有三种PDC得到了基本上相等的转化率。实施例8:酶和辅助底物浓度对B30P到B3AP的转化率的影响在本实施例中，表明了PDC的浓度对采用丙氨酸作为M给体将B30P转化为B3AP的转化率的影响。而且，也表明了丙氨酸浓度对B30P转化为B3AP的转化率的影响。反应条件见实施例6，除了pH值为7和除非另外声明，使用棕榈发酵细菌TA之外。由图7可见，在没有PDC的反应中，丙氨酸的浓度升高至5倍(由5mM升至25mM)导致转化率翻倍(2小时后，12%对5.3%)。在存在PDC时，在5倍丙氨酸过量下转化率翻倍(卯分钟后，30%对17%)。在通常的丙氨酸浓度下，PDC的用量由1.6单位/ml升至50单位/ml时，转化率也随之升高，但是，升高系数〈2(40分钟后，29%对17%)。在另外的试验中表明了丙氨酸和PDC同时过量(pH为6和7的两种情况下)的影响。pH值为6时，反应较快，尽管在转化率达到49%后，B3AP的浓度下降也较快。在pH值为7时，转化率升至56%。实施例9:丙氨酸浓度对B3AP的不对称合成的影响在四组v^应中，采用了5mM，25mM，110mM,300mM和500mM的丙氨酸浓度。对于每组试验，都进行了一次不含PDC的对照试验和一次含PDC的试验。pH值被调节为7.0。在3个小时的反应时间内，每半小时取样一次。对应于图8给出的转化率的>^应时间为5mM:40分钟，25mM:60分钟，110至500mM:卯分钟。图8示出了当丙氨酸浓度增大时，B3AP的不对称合成的转化率。图8清楚地表明，转化率可达60~70%。显然，丙氨酸浓度由25mM升至110mM对B30P到B3AP的转化率有显著的影响，而当进一步升高至500mM时，对转化率只有轻微的影响。PDC对转化率的影响随着丙氨酸浓度的升高而减弱。可根据对照反应的数据，按照如下方法计算出B3AP合成的平衡常数B3AP=[Pyr[B30P=C((,B30P-[B3AP和Ala=c0，Ala-[B3AP]因此，采用测得的B3AP的浓度，可以计算出平衡常数<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>c0,[Alal[B3APK-10'3553,225123,1110243,5300353,2500402,8K的平均值3,1表6所示的是计算值。由此得到，B3AP反应的平衡常数为3.1x10-3。因而，与其他酮相比，底物B30P是用于不对称合成的合适的底物。实施例10:PLP对B3AP的不对称合成的影响本实施例中表明了PLP(吡哆搭-5，-磷酸)对B30P到B3AP的转化率的影响。研究了如下三个反应试验。a)试验1采用0.1mMPLP，而不再加入另外的PLP。b)在试验2中，在反应过程中，一旦由于反应介质中PLP的存在而产生的黄色褪去，就加入PLP。为此，加入l2pl的饱和PLP溶液，从而重新获得深黄色。据认为，这种体积的微小增加对胺的浓度的影响低于1%,因而可以忽略不计。c)不存在PLP，也不加入PLP。反应^fr:1ml的最^f^积，37li1的P^7-转氨酶，5mM的B30P，pH7.0的磷酸盐緩冲液。L-丙氨酸的浓度为110mM。采用CE测定，以ot-MBA作为内标。图9所示的是转化率随时间的关系。将加入PLP的试验b)与试验a)比较，可以看出PLP的添加对最大转化率没有显著影响。没有PLP的反应速率较慢，尽管其能达到与其他反应相同的转化率。与对照试验相比，在试验b)中加入PLP使胺的浓度的降低稍大一些。实施例ll:通过通入氮气除去乙醛的B3AP的不对称合成以下实施例详细描述了一种通过除去乙醛提高B3AP的不对称合成的转化率的方法。反应糾底物5mMB30P500mML-丙氨酸32U/mlZ戸-PDC37fil/ml^/7-转氨酶0.1mMPLP和TPP(二磷酸硫胺素(thiaminediphosphate))5mMMgCl2由于反应溶液含有大量的蛋白质，因而有形成泡沫的强烈的趋势。为了抑制这种起泡，在Jl应试验中加入0，6p1的消泡剂A浓缩物(Sigma，硅氧烷聚合物)。所述浓缩物能在很大程度上抑制泡沫的产生，但是不能完全抑制。为了排除所述消泡剂浓缩物对酶具有抑制作用，补充l故了不通入氮气但加入消泡剂A的对照试验。由于千燥氮气的通入会导致7K从反应溶液中蒸发，因而对氮气加湿。图10所示的是计算得到的B3AP相对转化率。使用消泡剂A但不通入氮气的对照试验(Nr对照P^7-TA,Z/fl-PDC，消泡剂，无N2)与不使用消泡剂A的反应试验(^/7-TA，Z/m-PDC)精确吻合。由此可见，酶没有受到消泡剂浓缩物加入的影响。用氮气处理的试验(N2试验P^-TA，Z/m-PDC，消泡剂，N2)显示在60、卯和l抑分钟后转化率提高。实施例12:在不同条件下的B3AP的不对称合成反应她最终体积imi37fil限转氨酶32单位/mlZ/m-PDC或BiocatalyticsPDC或3.2单位/mlZ附oPDC5mMB30P500mML-丙氨酸辅因子0.1mMPLP和TPP，5mMMgCl2图10所示的是在上述同时采用P^7-转氨酶和每种PDC的反应试验中，B30P到B3AP的转化率。在图10中，以N2表示的试验是含有J^7-转氨酶和Z/w-PDC并用氮气和消泡剂A处理的试验。N2对照试验是含有P^f-转氨酶、Z/m-PDC和消泡剂A但不用氮气处理的试样。显然，由于通入到>^应溶液中的氮气的存在，由N2对照试验到N2试样，转化率显著升高。由此可见，向反应介质中通入氮气能显著提高B30P到B3AP的转化率。实施例13:在乙醇脱氢酶(ADH)存在下B3AP的不对称合成为了从反应混合物中除去由PDC反应产生的乙醛，可用ADH将乙醛转化为乙醇。反应条件110mML-丙氨酸5mMB30P37nl/ml^-转氨酶32单位/mlZ戸画PDC0.1mMPLP和TPP5mMMgCl2进行了如下反应试验反应试验1:使用PDC和转氨酶的反应反应试验2:使用PDC和转氨酶并添加5mM乙醇(最终浓度)和NADH的反应反应试验3:4吏用PDC、ADH和NADH的反应所用的ADH为源自酿酒酵母的ADH，其活性为50~100单位/ml。PDC的活性为32单位/ml。在反应开始时，在反应试验2中加入无水乙醇，使其最终浓度为5mM。在反应开始时，在反应试验2和3中加入5nmolNADH，对应于最终浓度为5mMNADH。在每10分钟后，再加入2.4jimo1NADH(4jd在50mM磷酸盐緩冲液中的0.6MNADH溶液，pH8.5)。NADH溶液储藏在水中，并且在即将4吏用之前配制。结果见图11和表5。ADH的影响是非常明显的。转化率升至约卯％。不加ADH但加入5mM乙醇的对照试验2仅仅稍微偏离对照试验1。由此可见，加入ADH能显著提高由B30P不对称合成B3AP的转化率。权利要求1.一种制备旋光手性胺的方法，包括:a)提供氨基受体和氨基给体，b)使所述氨基受体和所述氨基给体与转氨酶反应，和c)获得期望的旋光手性胺和酮副产物。2.权利要求l所述的方法，其中所述转氨酶是(R)-或(S)-选择性转氨酶。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述氨基受体选自苯丙酮酸及其盐、丙酮酸及其盐、苯乙酮、2-酮戊二酸、3-氧代丁酸、2-丁酮、3-氧代吡咯烷(3-OP)、3-吡啶基甲基酮(3-PMK)、3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)、3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)、N-l-boc-3-氧代哌咬酮、N-l-boc-3-氧代吡咯烷(B30P)、3-氧代哌啶、烷基-3-氧代丁酸酯、曱氧基丙酮和1-氧代四氢萘酮。4.如权利要求1~3任一项所述的方法，其中所述氨基给体选自胺或氨基酸，特别是选自P-丙氨酸，丙氨酸，a-甲基千基胺(oc-MBA)，谷氨酸，苯丙氨酸和Y-氨基丁酸，甘氨酸，3-氨基丁酸，异丙胺，2-氨基丁烷，和其中任一种的盐如氯化物。5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中得到的胺为特别是单或双环胺的胺，特别是5或6元环的胺，或者是S-、O-或N-取代的杂环烃基或芳香胺的胺，特别是烷基或垸氧基取代的芳香胺。6.如前述权利要求任一项所述的方法，其中得到的胺选自苯丙氨酸、丙氨酸、3-氨基哌啶、烷基-3-氨基-丁酸酯、3-氨基吡咯烷(3-AP)、3-吡啶基-l-乙胺(3-PEA)、N-l-boc-3-氨基吡咯烷(B3AP)、3-氨基丁酸乙酯(3-ABEE)、3-氨基戊酸甲酯(3-APME)、ot-甲基千基胺(a-MBA)、1-氨基四氢化萘、a-甲基-4-(3-吡咬基)-丁胺、谷氨酸、P-氨基丁酸、仲丁胺、甲氧基异丙胺、3-氨基吡咯烷的衍生物、l-N-boc-3-氨基哌啶、头孢菌素和头孢菌素的衍生物。7.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述co-转氨酶源自河流弧菌(柳n》y7謂'fl嗣、反滩化产械菌(/4/cfl/,》ew^sflfew/加yoiws)、肺炎克雷伯氏菌(A/eAwW/tf/mew附OM/fle)或苏云金芽抱軒菌(5鎖7/"s18.如前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤c)中获得的酮副产物是丙酮酸。9.如前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤c)中获得的酮副产物在另外的步骤d)中，通过与至少一种酶的反应，从反应混合物中除去。10.如权利要求9所述的方法，其中步骤d)所用的酶为脱羧酶。11.如权利要求9所述的方法，其中步骤d)所用的酶为合成酶。12.如权利要求9所述的方法，其中步骤d)所用的酶为脱氢酶。13.如权利要求9或IO任一项所述的方法，其中所述酶为丙酮酸脱羧酶(PDC)。14.如权利要求9或12任一项所述的方法，其中所述酶为乳酸脱氲酶(LDH)。15.如权利要求9或ll任一项所述的方法，其中所述酶为乙酰乳酸合酶。16.如权利要求13所述的方法，其中将通过所述PDC的作用生成的乙醛除去。17.如权利要求16所述的方法，其中通过与至少一种酶反应除去所述乙醛。18.如权利要求17所述的方法，其中所述酶是乙醇脱氢酶。19.如权利要求16所述的方法，其中通过向所述反应混合物中通入氮气除去所述乙醛。20.如权利要求16所述的方法，其中通过向所述反应混合物施加减压除去所述乙醛。21.如权利要求16所述的方法，其中通过化学方法除去所述乙醛。22.如前述权利要求任一项所述的方法，其中从步骤c)或d)中获得的反应混合物中除去步骤c)或d)中获得的旋光手性胺。23.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法是在pH值为5.0~9.5、优选为6.0~7.0、优选为6.0~6.9的反应混合物+实施的。24.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法的反应时间为40~70分钟。25.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述氨基受体是B30P。26.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述氨基给体是丙氨酸。27.如前述权利要求13、25或26任一项所述的方法，其中通过向反应混合物中通入氮气(N2)除去通过PDC的反应生成的乙醛。28.如前述权利要求13、25或26任一项所述的方法，其中所述反应是在至少一种丙酮酸脱羧酶和至少一种乙醇脱氢酶的存在下进行的。29.如前述权利要求13、25或26任一项所述的方法，其中所述反应是在至少一种丙酮酸脱羧酶、至少一种乙醇脱氢酶和另外在氮气(N2)的存在下进行的。30.—种制备生理活性化合物的方法，所述化合物选自3-氨基吡咯烷酮衍生物、头孢菌素、头孢菌素衍生物、杂环硼酸、L-二羟基苯丙氨酸(L-Dopa)、a-曱基多巴、D-苯基甘氨酸、P-羟基苯基甘氨酸、草铵膦酸、嘧啶并衍生物和吡咯烷酮衍生物，其中采用权利要求1~29任一项所述的方法。全文摘要本发明涉及光学纯仲胺的制备，所述仲胺可在例如药物的合成中用作中间体。文档编号C12P13/00GK101384723SQ200780005239公开日2009年3月11日申请日期2007年2月13日优先权日2006年2月13日发明者乌韦·博恩朔伊尔,卡伦·罗宾斯,马蒂亚斯·赫内申请人:罗扎股份公司