专利名称：：高水平表达蛋白质的宿主细胞的选择的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学和生物
技术领域：
。更具体地，本发明涉及改良高水平表达蛋白质的宿主细胞的选择的方法和手段。
背景技术：
：蛋白质可以在各种宿主细胞中生产并广泛应用于生物学和生物技术中，例如生物制药学。优选真核特别是哺乳动物宿主细胞表达多种蛋白质，例如当这种蛋白质具有某种翻译后修饰如糖基化时。用于这种生产的方法已经被很好地建立，通常需要在宿主细胞内表达编码感兴趣蛋白质的核酸(也被称为"转基因")。通常，该转基因和选择标记基因一起被导入到前体细胞中，并根据选择标记基因的表达来选择细胞，并且鉴定一或多个高水平表达感兴趣蛋白质的克隆，并用于表达感兴趣的蛋白质。转基因表达的一个问题是它是不可预测的，这源于因为基因沉默(McBurneyetal.,2002)而使转基因变成无活性的高可能性，因此为了得到转基因的高表达，需要检测众多的宿主细胞克隆。选择相对高水平表达所需蛋白质的重组宿主细胞的方法已经知道，一些这样的方法在WO2006/048459的介绍里讨论，并入本文参考。在某些现有技术的有利方法中，双顺反子表达载体被描述用于快速和有效地生产稳定的表达重组蛋白质的哺乳动物细胞系。这些载体在感兴趣蛋白质的上游编码序列和选择标记的下游编码序列间含有内部核糖体进入位点(IRES)(Reesetal,1996)。这种载体可商购获得，例如pIRESl载体可得自Clontech(CLONTECHniques，October1996)。用这样的载体导入宿主细胞，然后下游标记蛋白质的充分表达的选择可以自动选择多顺反子mRNA的高转录水平，从而可以用这种载体有力地增加感兴趣蛋白质的高表达的可能性。在这种方法中优选所使用的IRES为使得选择标记基因的翻译为相对低水平的IRES，从而通过选择标记蛋白的表达选择进一步改良选择具有高表达水平的感兴趣蛋白质的宿主细胞的机会(例如参见WO03/106684和WO2006/005718)。本发明目的在于提供选择表达高水平的感兴趣蛋白质的宿主细胞的改良的方法和手段。发明简述WO2006/048459在本申请的优先权日前提交但在此之后公开，以其全文并入本文参考。WO2006/048459揭示了选择高水平表达感兴趣多肽的宿主细胞的概念，这个概念在那里被称为"相依性翻译(reciprocalinterdependenttranslation)"。在该概念中，使用了多顺反子转录单位，其中编码选择标记多肽的序列位于编码感兴趣多肽的序列的上游，其中选择标记多肽的翻译被其中突变削弱，然而感兴趣多肽的翻译却非常高(例如参见该文图13的示意图)。本发明提供了另一种选择表达高水平多肽的宿主细胞的方法和手段。一方面，本发明提供了一种DNA分子，其包含多顺反子转录单位，其编码i)感兴趣多肽和ii)在真核宿主细胞中具有功能的选择标记多肽，其中感兴趣多肽具有与选择标记多肽序列的翻译起始序列相独立的翻译起始序列，其中所述在多顺反子转录单位中，感兴趣多肽的编码序列在选择标记多肽的编码序列的上游，其中在感兴趣多肽的编码序列下游和选择标记多肽的编码序列上游存在内部核糖体进入位点(IRES)，其中在编码链上编码选择标记多肽的核酸序列包含选自如下的翻译起始序列a)GTG起始密码子；b)TTG起始密码子；c)CTG起始密码子；d)ATT起始密码子；和e)ACG起始密码子。在编码链上的选择标记多肽的翻译起始序列包含不同于ATG起始密码子的一个起始密码子如GTG、TTG、CTG、ATT或ACG序列，其中前两个最为优选。这种非ATG起始密码子的侧翼优选为用于相对较好地识别作为起始密码子的非ATG序列的序列，这样至少一些核糖体从这些起始密码子开始翻译，即翻译起始序列优选包含ACC[非ATG起始密码子]G或GCC[非ATG起始密码子]G。在优选的实施方案中，选择标记蛋白提供对选择剂例如抗生素的致死和/或生长抑制作用的抗性。本发明进一步提供包含本发明DNA分子的表达盒，该表达盒进一步包含在多顺反子表达单位上游的启动子，其在真核宿主细胞内具有功能，可以启动多顺反子表达单位的转录，所述表达盒进一步包含在多顺反子表达单位下游的转录终止序列。在优选的实施方案中，这样的表达盒进一步包含至少一个选自如下的染色质控制元件(chromatincontrolelement):基质或支架附着区(MAR/SAR)，绝缘序列，通用染色质开放元件(ubiquitouschromatinopenerelement,UCOE)，和抗阻抑物(STAR)序列。在这方面优选抗阻抑物序列，在某些实施方案中，所述抗阻抑物序列选自如下a)SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.66中的任一个；b)SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.66中任一个的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)在核苷酸序列上和a)或b)至少70X相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)a)到c)中任一个的互补序列。本发明也提供了包含本发明DNA分子的宿主细胞。本发明进一步提供了生产表达感兴趣多肽的宿主细胞的方法，所述方法包括将本发明的DNA分子或表达盒导入到多个前体宿主细胞中，在选择表达选择标记多肽的条件下培养细胞，并且选择至少一个生产感兴趣多肽的宿主细胞。在另一个方面中，本发明提供了生产感兴趣多肽的方法，所述方法包括培养宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的表达盒，并从表达盒表达感兴趣多肽。在优选的实施方案中，感兴趣多肽进一步从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中分离出来。附图简述图1.本发明的表达构建体结果。表达构建体含有在IRES上游的编码感兴趣多肽(这里以d2EGFP为例)的序列，IRES在本发明编码选择标记(这里以zeocin抗性基因为例，具有TTG起始密码子(TTGZeo)(或在其常规ATG起始密码子(ATGZeo)的控制下))序列的上游。详见实施例1。圆点表示单独数据点；直线表示平均表达水平；使用的构建体表示在水平轴，并示意性地在图表上方描述；垂直轴表示d2EGFP信号。图2.以具有dhfr作为维持标记的三顺反子表达盒结果。表达构建体含有zeocin选择标记基因，具有TTG起始密码子，并且在编码感兴趣多肽(这里以d2EGFP为例)的序列上游缺少内部ATG序列，编码感兴趣多肽的序列进一步可操作地通过IRES连接到下游代谢选择标记dhfr基因(带有ATG起始密码子)上。圆点表示单独数据点(在垂直轴上Ze^菌落的GFP荧光信号)，直线表示平均表达水平。使用的构建体显示在图表上方，条件在水平轴表示(d:天)。详见实施例2。图3.如图2，但dhfr基因具有GTG起始密码子。图4.如图2，但dhfr基因具有TTG起始密码子。图5.在不同条件下具有dhfr酶(ATG起始密码子)的克隆的拷贝数。详见实施例3。图6.如图5，但dhfr基因具有GTG起始密码子。图7.如图5，但dhfr基因具有TTG起始密码子。发明详述在一个方面，本发明提供了权利要求1的DNA分子。本发明这种DNA分子可以用于通过对选择标记多肽的表达选择获得表达高水平的感兴趣多肽的真核宿主细胞。随后或同时可以鉴别一或多个表达感兴趣多肽的宿主细胞，进一步用于表达高水平的感兴趣多肽。术语"单顺反子基因"定义为可以提供编码一个多肽的RNA分子的基因。"多顺反子转录单位"，也称为多顺反子基因，定义为可以提供编码至少2个多肽的RNA分子的基因。术语"双顺反子基因"定义为可以提供编码2个多肽的RNA分子的基因。因此，双顺反子基因涵盖于多顺反子基因的定义中。这里使用的"多肽"包含以肽键连接的至少5个氨基酸，可以是例如蛋白质或蛋白质的一部分，例如亚基。大多数情况下，术语多肽和蛋白质在这里可以互换使用。在本发明中使用的"基因"或"转录单位"可以包含染色体DNA、cDNA、人工DNA、其组合等等。包含几个顺反子的转录单位作为单个mRNA转录。本发明的多顺反子转录单位优选是双顺反子转录单位，从5'到3'编码感兴趣多肽和选择标记多肽。因此，感兴趣多肽编码在选择标记多肽的编码序列的上游。IRES可操作地连接到编码选择标记多肽的序列上，因此选择标记多肽的翻译取决于IRES。优选用分离的转录单位表达不同的感兴趣多肽，而且当这些形成多聚体蛋白质的一部分时也是一样的(例如参见WO2006/048459的实施例13，在此并入参考抗体的重链和轻链的每个都由分离的转录单位编码，每个表达单^t为双顺反子表达单位)。本发明的DNA分子可以以双链DNA形式存在，具含一条关于选择标记多肽和感兴趣多肽的编码链和一条非编码链，编码链是一条和翻译的RNA序列相同的链，除了用T代替U。因此，AUG起始密码子是由在编码链上的ATG序列编码，含有这个相应于RNA上AUG起始密码子的ATG序列的链被称为DNA的编码链。本领域技术人员清楚起始密码子或翻译起始序列实际上存在于RNA分子中，但是这些可以被同样地认为在编码这种RNA分子的DNA分子上；因此，无论本发明何处提到起始密码子或翻译起始序列，也包括相应的DNA分子，其具有和RNA序列相同的序列但在所述DNA分子的编码链上用T代替U，反之亦然，除非特别指明。换句话说，起始密码子例如是RNA中的AUG序列，但在DNA编码链上的相应ATG序列在本发明中也同样被称为起始密码子。同样的用法也用于提及"符合读框的(inframe)"编码序列上，意指在RNA分子上翻译成氨基酸的三联体(3个碱基)，但也被解释为在DNA分子的编码链上相应的三核苷酸序列。由多顺反子基因编码的选择标记多肽和感兴趣多肽每个都具有它们自己的翻译起始序列，因此每个都有它们自己的起始密码子(以及终止子)，即它们由分别的开放读框编码。术语"选择标记"或"可选择标记"典型地指其在细胞中的存在可以直接或间接被检测的基因和/或蛋白质，例如使选择剂失活及保护宿主细胞不受选择剂致死或生长抑制作用影响的多肽(例如抗生素抗性基因和/或蛋白质)。另一种可能性是所述选择标记诱导荧光或颜色沉积物(例如绿色荧光蛋白(GFP)和衍生物(例如d2EGFP)、荧光素酶、lacZ、碱性磷酸酶等等)，这些可以用于选择表达诱导颜色沉积物的多肽的细胞，例如用荧光活性细胞筛选器(FACS)来选择表达GFP的细胞。优选地，本发明的选择标记多肽提供对选择剂的致死和域生长抑制作用的抗性。选择标记多肽由本发明的DNA编码。本发明的选择标记多肽必须在真核宿主细胞中具有功能，因此能够在真核宿主细胞中被选择。任何符合这种标准的选择标记多肽原则上都可以用于本发明。这种选择标记多肽在本领域中已经熟知，并常规用于获取真核宿主细胞克隆，这里提供了几个实例。在某些实施方案中，用于本发明的选择标记为zeocin。在另一些实施方案中，使用杀稻瘟素。本领域技术人员知道其它选择标记也可以获得和使用，例如新霉素、嘌呤霉素、博来霉素和潮霉素等等。在另一些实施方案中，使用卡那霉素。在另一些实施方案中，DHFR基因用作选择标记，该基因可以用甲氨蝶呤来选择，特别是用增加浓度的甲氨蝶呤可以用来选择DHFR基因拷贝数增加的细胞。DHFR基因也可以用于在具有叶酸和缺少甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷的培养基中弥补dhfr-缺陷，例如在具有dhfr—表型的CHO细胞中。类似地，也可以使用谷氨酸合成酶(GS)基因，可以通过在没有谷氨酰胺的培养基中培养而在缺乏GS的细胞(例如NS-0细胞)中进行选择，或者通过加入GS抑制剂甲硫氨酸磺基月亏(methioninesulphoximine，MSX)而在具有充足GS的细胞(例如CHO细胞)中进行选择。其它可以使用的选择标记基因和它们的选择剂例如在美国专利5，561，053的表1中描述，其在本文并入参考；也可参见Kaufman,MethodsinEnzymology，185:537-566(1990)。如果选择标记多肽为Wz>，在有利的实施方案中宿主细胞培养在含有叶酸的培养基中，该培养基基本上不含次黄嘌呤和胸苷，优选也不含甘氨酸。当两个多顺反子转录单位按本发明在单个宿主细胞中选择时，每个优选含有不同选择标记的编码序列，使得可以对两个多顺反子转录单位进行选择。当然，两个多顺反子转录单位可以存在于一个核酸分子上或者每个存在于分别的核酸分子上。术语"选择"典型地定义为用选择标记/可选择标记和选择剂来鉴别具有特异性遗传性质(例如宿主细胞含有整合到其基因组中的转基因)的宿主细胞的过程。本领域技术人员清楚地知道多种选择标记的组合是可行的。一种特别有利的抗生素是zeocin，因为zeocin-抗性蛋白(zeocin-R)通过结合药物使得它变成无害的来起作用。因此可以容易地滴定杀死低水平表达zeocin-R的细胞的药物量，同时让高水平表达细胞存活。其它所有常用的抗生素抗性蛋白均为酶，因此通过催化起作用(和药物不是l:1)。因此，抗生素zeocin是优选的选择标记。另一个优选的选择标记是5,6，7,8-四氢叶酸合成酶(dhfr)。但是，本发明对其它选择标记也适用。本发明的选择标记多肽是由本发明核酸编码的蛋白质，该多肽功能上用于选择，例如因为它提供了对选择剂如抗生素的抗性。因此，当使用抗生素作为选择剂时，DNA编码赋予对选择剂抗性的多肽，该多肽为选择标记多肽。编码这种选择标记多肽的DNA序列是已知的，几个编码选择标记蛋白的野生型DNA序列的实例在这里提供(例如WO2006/048459的图26一32，并入本文参考)。清楚的是，依照本发明，选择标记的突变体或衍生物也可以适用，因此包含在术语"选择标记多肽"的范围内，只要选择标记蛋白还有功能。为了方便，同样也被本领域技术人员所普遍接受，在很多发表物以及本文中，经常将编码对选择剂的抗性的基因和蛋白分别称为"选择剂(抗性)基因"或"选择剂(抗性)蛋白"，虽然正式的名称可能不同，例如编码赋予对新霉素(以及对G418和卡那霉素)抗性的蛋白质的基因经常被称为新霉素(抗性)(或nec/)基因，而正式名称为氨基糖苷3'-磷酸转移酶基因。对于本发明，选择标记多肽的表达水平低有好处，这样可以进行严格的选择。在本发明中，这是由于使用了具有非-ATG起始密码子的选择标记编码序列。在选择中，只有那些仍然具有足够水平的选择标记多肽的细胞才被选择，意味着这些细胞一定具有足够的多顺反子转录单位的转录和足够的选择标记多肽的翻译，这提供了对细胞的选择，该细胞中多顺反子转录单位已经被整合或者存在于宿主细胞中这个转录单位的表达水平高的某个位置。本发明的DNA分子在感兴趣多肽的编码序列下游具有选择标记多肽的编码序列。因此，多顺反子转录单位在5'到3'方向包含(在DNA的转录链和所得的转录RNA两者中)编码感兴趣多肽的序列和选择标记多肽的编码序列。IRES位于选择标记多肽的编码序列的上游。依照本发明，感兴趣基因的编码区优选从帽依赖ORF翻译，感兴趣多肽大量产生。选择标记多肽从IRES翻译。为降低选择标记顺反子的翻译，依照本发明，编码选择标记多肽的核酸序列在起始密码子中包含突变，降低选择标记多肽在真核宿主细胞中的翻译起始效率。优选地，GTG起始密码子或更优选地，TTG起始密码子被工程化到选择标记多肽中。在同样的细胞中，翻译效率低于相应的野生型序列，即突变造成每时间单位每细胞中更少的多肽，因而更少的选择标记多肽。翻译起始序列在本领域内经常被称为"Kozak序列"，并且一个最佳的Kozak序列为RCCATGG，起始密码子用下划线标明，R为嘌呤，即A或G(见KozakM，1986，1987，1989,1990，1997,2002)。因此，除了起始密码子本身，其上下的碱基，特别是-3到-l和+4位置的核苷酸也有关系，最佳的翻译起始序列在最佳的前后序列中包含最佳的起始密码子(即ATG)(即ATG之前直接为RCC，之后直接为G)。当存在最佳的Kozak序列时，通过核糖体的翻译也最为有效(见KozakM，1986,1987,1989,19卯，1997,2002)。但是，在一小部分情况下，非最佳翻译起始序列被核糖体识别并用来起始翻译。本发明利用了这种原理，使得降低甚至微调翻译的量以及选择标记多肽的表达量，这因此可以用来增加选择系统的严格性。在本发明中选择标记多肽的ATG起始密码子被突变成另一个密码子，该密码子已经被报道过可以提供某些翻译起始，例如突变为GTG、TTG、CTG、ATT或ACG(在这里统称为"非ATG起始密码子")。在优选的实施方案中，ATG起始密码子突变成GTG起始密码子。这提供了比用完整的ATG起始密码子但在非最佳序列中更低的表达水平(更低的翻译)。更优选地，ATG起始密码子突变成TTG起始密码子，这比用GTG起始密码子提供了甚至更低的选择标记多肽表达水平(KozakM,1986，1987,1989,19卯,1997，2002;也可参见WO2006/048459的实施例9一13，并入本文参考)。在本发明的多顺反子转录单位中的选择标记多肽的编码序列中使用非ATG起始密码子在现有技术中没有被揭示或提议，优选和染色质控制元件组合，导致非常高水平的感兴趣多肽的表达，也如WO2006/048459中所示，并入本文参考。本发明非ATG起始密码子的使用，强烈优选为这样的起始密码子提供最佳的前后碱基序列，即非ATG起始密码子优选直接跟在位于-3到-1位置的RCC核苷酸后面，并于其后直接跟着G核苷酸(位置+4)。但是，有报道说用TTT^ISG序列(起始密码子以下划线标明)，至少在体外观察到某些起始作用，所以虽然强烈优选，但可能并不是绝对的需要为非ATG起始密码子提供最佳的前后碱基序列。在多肽的编码序列之内的ATG序列(不包括ATG起始密码子)被称为"内部ATG"，并且如果这些与ORF符合读框，因此编码甲硫氨酸，所得的多肽中的甲硫氨酸被称为"内部甲硫氨酸"。在发明WO2006/048459中，编码选择标记多肽的编码区域(在起始密码子之后，不必需包括起始密码子)在DNA的编码链上不包含任何ATG序列，直到(但不包括)感兴趣多肽的起始密码子。WO2006/048459揭示了如何做到这一点并且如何检测所得选择标记多肽的功能性。对于本发明，选择标记多肽编码序列位于IRES下游和感兴趣多肽的编码序列下游时，编码选择标记多肽的序列中内部ATG可以保留不动。清楚地，本发明强烈优选感兴趣多肽的翻译起始序列包含最佳翻译起始序列，即具有共有序列RCCG(起始密码子以下划线标明)。这会导致感兴趣多肽的非常有效的翻译。通过提供具有不同突变的标记的编码序列导致几种降低的翻译效率水平，可以增加选择的严格性。因此使用本发明的多顺反子转录单位可以微调选择系统例如用GTG作为选择标记多肽的起始密码子，只有少数几个核糖体会从这个起始密码子翻译，造成低水平的选择标记蛋白，因而导致选择的高严格性；用TTG起始密码子甚至进一步增加了选择的严格性，因为更少的核糖体会从这个起始密码子翻译选择标记多肽。在并入本文参考的WO2006/048459中表明该文揭示的多顺反子表达单位可以用于非常稳健的选择系统，产生非常大比例地如所需以高水平表达感兴趣多肽的克隆。另外，所获得的感兴趣多肽的表达水平比用至今已知的选择系统筛选甚至更大量菌落时获得的克隆的表达水平显著更高。除了降低的翻译起始效率外，它对降低选择标记多肽的翻译延伸效率是有益的，例如通过突变其编码序列使得其包含几个非优选的宿主细胞密码子，以进一步降低标记多肽的翻译水平，并且如果需要的话，可以使用更严格的选择条件。在某些实施方案中，除了本发明降低翻译效率的突变外，选择标记多肽进一步包含降低选择标记多肽活性(较之野生型)的突变。这可用于进一步增加选择的严格性。作为非限制性实例，在zeocin抗性多肽位置9的脯氨酸可被突变成例如Thr或Phe(见WO2006/048459的实施例14，并入本文参考)，对于新霉素抗性多肽，氨基酸残基182或261或两者可进一步被突变(见例如WO01/32901)。在本发明的一些实施方案中，所谓的间隔序列置于编码选择标记多肽的起始密码子的序列的下游，该间隔序列优选为是和起始密码子符合读框的序列并编码几个氨基酸，不含有二级结构(Kozak,1990)。如果选择标记多肽(例如对于zeocin，或者对于杀稻瘟素)的RNA中存在二级结构，这种间隔序列可用来进一步降低翻译起始频率(Kozak，1990)，因而增加本发明选择系统的严格性(见WO2006/048459的实施例14，并入本文参考)。将会清楚，也可以使用任何如上所述的但在编码选择标记蛋白的第一个ATG序列(起始密码子)下游的序列中具有突变的DNA分子，并且其因此也涵盖于本发明的范围内，只要各自编码的选择标记多肽仍有活性。例如任何由于遗传密码的冗余而不改变所编码蛋白的沉默突变也被涵盖。其它造成保守氨基酸突变或其它突变的突变也被涵盖，只要编码的蛋白质仍有活性，这种活性可能比或可能不比该序列所编码的野生型蛋白的活性低。特别地，优选编码的蛋白质与各自代表序列所编码的蛋白质至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少95%相同(例如如在本申请中序列表的SEQIDNO.68-80中所提供的)。对选择标记蛋白的活性的检测可以常规方法进行。本发明的一个优选方面是提供包含本发明的具有多顺反子转录单位的DNA分子的表达盒。这样的表达盒可用于表达感兴趣的序列，例如在宿主细胞中。这里用到的"表达盒"是包含至少一个与需要表达的序列功能性连接的启动子的核酸序列。优选地，表达盒进一步含有转录终止和多聚腺苷酸化序列。也可以包含其它调控序列如增强子。因此，本发明提供了表达盒，其以如下顺序包含5'-启动子-本发明多顺反子转录单位，编码感兴趣多肽和其下游的选择标记多肽-转录终止序列-3'。启动子必须能够在真核宿主细胞中具有功能，即它必须能驱动多顺反子转录单位的转录。启动子因此可操作地连接到多顺反子转录单位。表达盒可任选地进一步含有本领域已知的其它元件，例如剪接位点以包含内含子等等。在一些实施方案中，内含子存在于启动子之后和编码感兴趣多肽的序列之前。IRES可操作地连接到含有选择标记多肽编码序列的顺反子上。在进一步的实施方案中，编码第二种选择标记的序列存在于多顺反子转录单位中(即在这些实施方案中这至少是三顺反子转录单位)。在优选的实施方案中，所述编码第二种选择标记多肽的序列a)具有与感兴趣多肽的翻译起始序列分离的翻译起始序列，b)位于所述编码感兴趣多肽的序列上游，c)在编码链中所述第二种选择标记多肽的起始密码子到感兴趣多肽的起始密码子之间无ATG序列，及d)具有非最佳翻译起始序列，例如GTG起始密码子或TTG起始密码子。对于这样的实施方案，优选的选择标记多肽为5，6,7，8-四氢叶酸合成酶(dhfr)。这使得可以对感兴趣多肽的高水平表达进行连续选择，见实施例2所述。为获得编码蛋白的核酸序列的表达，本领域技术人员己知能够驱动这种表达的序列可以功能性地连接到编码所述蛋白的核酸序列上，产生可表达形式的编码蛋白的重组核酸序列。在本发明中，表达盒包含多顺反子转录单位。通常，启动子序列位于被表达序列的上游。在本领域内可获得广泛使用的表达载体，例如Invitrogen的pcDNA和pEF载体系列，BDSciences的pMSCV和pTK-Hyg，Stratagene的pCMV-Script等等，这些可用来获得适当的启动子和/或转录终止子序列，polyA序列，等等。编码感兴趣多肽的序列被合适地插入到控制编码的多肽转录和翻译的序列中，所产生的表达盒可用来生产感兴趣多肽，称为表达。驱动表达的序列可能包括启动子、增强子等及其组合。这些应该在宿主细胞中能够具有功能，因而驱动那些与之功能性连接的核酸序列的表达。本领域技术人员认识到不同启动子可用于获得基因在宿主细胞中的表达。启动子可以是组成型的或调节的，可以得自不同来源，包括病毒、原核或真核来源，或人工设计。感兴趣核酸的表达可能从天然启动子或其衍生物或从完全异源的启动子(Kaufman,2000)开始。按照本发明，优选在所选的真核细胞中给出高转录水平的强启动子。合适的启动子对本领域技术人员是熟知的并可以获得的，一些在WO2006/048459中(例如28—29页)描述，并入本文参考，包括CMV立即早期(IE)启动子(这里被称为CMV启动子)(例如从Invitrogen的pcDNA获得)和许多其它的。在某些实施方案中，本发明的DNA分子是载体例如质粒的一部分。这样的载体易于用本领域技术人员所熟知的方法来操作，并且能够例如被设计成能在原核和/或真核细胞中复制。另外，许多载体可以直接或以从中分离的所需片段的形式用于转化真核细胞，并将整个或部分整合入这些细胞的基因组中，产生稳定的在基因组中包含所需核酸的宿主细胞。传统的表达系统是以重组质粒或重组病毒基因组形式的DNA分子。质粒或病毒基因组被导入(真核)细胞并且优选通过本领域已知方法整合入它们的基因组中，这其中的一些方面在WO2006/048459中描述(例如30一31页)，并入本文参考。被广泛认同的是，染色质结构和其它外遗传调控机制可以影响真核细胞中转基因的表达(例如Whitelaweta1，2001)。本方面多顺反子表达单位形成具有严格的选择方式的选择系统的一部分。这通常需要所选宿主细胞中的高转录水平。为了增加在严格选择方式下找到存活的宿主细胞克隆的机会，并可能增加所获得的克隆中表达的稳定性，通常优选增加转录的可预测性。因此，在优选的实施方案中，本发明的表达盒进一步包含至少一个染色质控制元件。这里的"染色质控制元件"是DNA序列的统称，这些DNA序列对真核细胞内染色质结构有一定作用于是对在它们附近的转基因的表达水平和/或表达稳定性也有作用(它们以"顺式"起作用，因此优选位于转基因的5kb、更优选2kb、更优选1kb之内)。这些元件有时候被用来增加具有所需转基因表达水平的克隆的数量。可以用于本发明的几种类型的这些元件在WO2006/048459中描述(例如32—34页)，并入本文参考，为了本发明目的，染色质控制元件选自如下基质或支架附着区(MAR/SAR)，绝缘子如P-球蛋白绝缘子元件(鸡j3-球蛋白基因座的5'HS4)，scs，scs，等等，通用染色质开放元件(ubiquitouschromatinopeningelement,UCOE)和抗阻抑物序列(也被称为"STAR"序列)。优选地，所述染色质控制元件为抗阻抑物序列，优选选自a)SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.66中的任一个；b)SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.66中任一个的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性("功能性片段")；c)在核苷酸序列上和a)或b)至少70%相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性("功能性衍生物");d)a)到c)中任一个的互补序列。优选地，所述染色质控制元件选自STAR67(SEQ.ID.NO.66),STAR7(SEQ.ID.NO.7)，STAR9(SEQ,ID.NO.9),STAR17(SEQ.ID.NO.17),STAR27(SEQ.ID.NO.27),STAR29(SEQ.ID.NO.29),STAR43(SEQ.ID.NO.43),STAR44(SEQ.ID.NO.44)，STAR45(SEQ.ID.NO.45),STAR47(SEQ.ID.NO.47)，STAR61(SEQ.ID.NO.61),或所述STAR序列的功能性片段或衍生物。在优选的实施方案中，所述STAR序列为STAR67(SEQ.ID.NO.66)或其功能性片段或衍生物。在某些优选的实施方案中，STAR67或其功能性片段或衍生物位于驱动多顺反子转录单位表达的启动子的上游。在其它优选的实施方案中，本发明的表达盒两侧侧翼由至少1个抗阻抑物序列包围，例如被SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.65中的一个在两侧包围，优选每个这些序列的3'末端都朝向转录单位。在某些实施方案中，本发明的表达盒从5'到3'顺序包含抗阻抑物序列A—抗阻抑物序列B—[启动子一本发明多顺反子转录单位(编码感兴趣多肽和其下游的功能性选择标记蛋白)一转录终止序列]一抗阻抑物序列C，其中A、B和C可能相同也可能不同。具有抗阻抑物活性的序列(抗阻抑物序列)和其特征，以及其功能性片段或衍生物，以及其结构和功能定义，和获得并使用它们的方法(这些序列可用于本发明)在WO2006/048459中描述(例如34—38页)，并入本文参考。对于多聚体蛋白质的生产，可以使用2个或多个表达盒。优选地，两个表达盒都是本发明的多顺反子表达盒，每个编码一个不同的选择标记蛋白，这样可以对两个表达盒进行选择。这个实施方案已经被证明可以获得良好的结果，例如用于抗体重链和轻链的表达。人们将清楚地认识到，在被导入宿主细胞之前，两个表达盒可以位于一个核酸分子上或两个可以分别存在于不同的核酸分子上。将它们放在一个核酸分子上的好处在于这两个表达盒在导入宿主细胞中时是以一个预先设定的比例(1:1)存在的。另一方面，当存在于两个不同的核酸分子上时，当导入到宿主细胞中时可以改变两个表达框盒的摩尔比例，这对于那些优选摩尔比例不是l:l或者事先不知道什么是优选摩尔比例的情况来说是有利的，这样本领域技术人员可以容易地进行变化并且通过经验发现最佳比例。依照本发明，优选至少一个表达盒，但更优选，每个表达盒包含染色质控制元件、更优选抗阻抑物序列。在另一个实施方案中，多聚体蛋白的不同亚基或部分存在于一个表达盒中。有用的抗阻抑物组和表达盒的构型已经在WO2006/048459(例如40页)中描述，并入本文参考。在某些实施方案中，提供的本发明转录单位或表达盒进一步包含了转录暂停(TRAP)序列，基本上如WO2006/048459的40—41页所述，并入本文参考。一个TRAP序列的非限制性实例在SEQ.ID.NO.81中给出。其它TRAP序列实例、发现其的方法以及其应用在WO2004/055215中描述。包含本发明多顺反子转录单位和/或表达盒的DNA分子可以用于改良核酸的表达，优选地在宿主细胞中。术语"细胞"/"宿主细胞"和"细胞系'7"宿主细胞系"分别典型地限定为可以通过本领域已知方法在细胞培养中维持的细胞及其同源群体，并且其具有表达异源或同源蛋白质的能力。几个可以使用的宿主细胞实例在WO2006/048459(例如41一42页)中描述，并入本文参考，这样的细胞包括例如哺乳动物细胞，包括但不限于CHO细胞、例如CH0-K1，CHO-S,CHO-DG44,CHO-DUKXBll，包括具有dhfr—表型的CHO细胞，以及骨髓瘤细胞(例如Sp2/0，NS0)，HEK293细胞和PERX6细胞。这些真核宿主细胞可以表达所需多肽，并且经常用于这些目的。它们可以通过导入本发明的DNA分子优选地以表达盒的形式到细胞中而获得。优选地，该表达盒整合到宿主细胞的基因组里，在不同的宿主细胞中可以整合到不同位点，可以选择转基因整合到合适位点的克隆，产生在表达水平、稳定性和生长特征等方面具有所需性质的宿主细胞克隆。或者，多顺反子转录单位可能被靶向或随机选为整合入染色体转录活性区域，例如在基因组中存在的启动子之后。使用本领域技术人员已知的常规方法，通过选择标记多肽的选择来进行含有本发明DNA的细胞的选择。当这样一个多顺反子转录单位整合到基因组的启动子之后，本发明的表达盒可以在原位产生，即在宿主细胞的基因组之中。优选地，宿主细胞是从按照本领域技术人员已知的标准方法选择和传代的稳定克隆获得的。如果这些细胞包含本发明的多顺反子转录单位，这样一个克隆的培养物就可以生产感兴趣多肽。向细胞中导入被表达的核酸可以通过几种方法中的一种来进行，这些方法对于本领域的技术人员是已知的，并取决于所导入核酸的形式。所述方法包括但不限于转染、感染、注射、转化等等。合适的表达感兴趣多肽的宿主细胞可以通过选择来获得。在优选的实施方案中，包含本发明多顺反子转录单位的DNA分子优选为表达盒的形式，整合入本发明的真核宿主细胞的基因组中。这将提供多顺反子转录单位的稳定遗传。对选择标记多肽的存在进行选择，进而对表达的选择，可以在刚刚获得细胞的时候进行。在某些实施方案中，在培养过程中至少部分时间在培养基中存在有选择剂，要么以足够的浓度来选择表达选择标记多肽的细胞，要么以更低的浓度。在优选的实施方案中，在多肽表达时的生产阶段，培养基中不再存在选择剂。本发明的感兴趣多肽可以是任何蛋白质，可能是单体蛋白或多聚体蛋白(或一部分)。多聚体蛋白包含至少两条多肽链。本发明的感兴趣蛋白质的非限制性实例为酶、激素、免疫球蛋白链、治疗蛋白例如抗癌蛋白、血凝蛋白例如因子VIII、多功能蛋白例如红细胞生成素、诊断蛋白、或用于接种目的的蛋白或其片段，所有这些都是本领域技术人员所已知的。在某些实施方案中，本发明的表达盒编码免疫球蛋白重链或轻链或抗原结合部分，其衍生物和/或类似物。在优选的实施方案中，提供了本发明蛋白表达单位，其中所述感兴趣蛋白质是免疫球蛋白重链。在另一个优选的实施方案中，提供了本发明的蛋白表达单位，其中所述感兴趣蛋白质是免疫球蛋白轻链。当这两个蛋白表达单位存在于同一个(宿主)细胞中时，多聚体蛋白，更具体地，免疫球蛋白被合成了。因此，在某些实施方案中，感兴趣蛋白质为是多聚体蛋白的免疫球蛋白，例如抗体。优选地，这样一个抗体是人类或人源化抗体。在某些实施方案中，它是IgG、IgA或IgM抗体。免疫球蛋白可以被不同表达盒上或一个表达盒上的重链和轻链编码。优选地，重链和轻链存在于不同的表达盒上，每个具有其自己的启动子(对于两个表达盒，这些启动子可以相同或不同)，每个包含本发明的多顺反子转录单位，重链和轻链为感兴趣多肽，优选地每个编码不同的选择标记蛋白，这样当表达盒导入和/或存在于真核宿主细胞中时，可以对重链和轻链表达盒进行选择。感兴趣多肽可以来自任何来源，在某些实施方案中为哺乳动物蛋白，人工蛋白(例如融合蛋白或突变蛋白)，优选为人类蛋白。明显地，当最终目的不是生产感兴趣多肽而是RNA本身例如从表达盒生产数量增加的RNA(其可能用于调节其它基因(例如RNAi、反向RNA)的目的，基因治疗，体外蛋白表达等等)，也可以使用本发明的表达盒构型。在一方面，本发明提供了生产表达感兴趣多肽的宿主细胞的方法，该方法包括向多个前体细胞中导入本发明的DNA分子或表达盒，在选择条件下培养所生产的细胞并选择至少一个生产感兴趣多肽的宿主细胞。这种新方法的优点与WO2006/048459中(例如46—47页)所述的可供选择的方法类似，并入本文参考。当可以获得具有相对低拷贝数的多顺反子转录单位和高表达水平的克隆时，本发明的选择系统仍然可以和扩增方法结合来更进一步改良表达水平。例如这可以通过用甲氨蝶呤通过扩增共整合的dhfr基因来实现，例如通过将dhfr置于和本发明多顺反子转录单位的同一个核酸分子上，或者当dhfr在不同的DNA分子上时进行共转染实现。dhfr基因也可以是本发明的多顺反子表达单位的一部分。本发明也提供了生产一或多个感兴趣多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞。培养细胞使得它可以代谢和/或生长和/或分裂和/或生产感兴趣的重组蛋白。这可以通过本领域技术人员所熟知的方法来实现，包括但不限于提供养料给细胞。所述方法包含贴壁生长、悬浮生长或其组合。培养可以例如在培养皿、转瓶或生物反应器中进行，使用分批、补料分批、连续系统例如灌注系统等等。为了实现通过细胞培养物大规模(连续)生产重组蛋白质，本领域优选使用可以悬浮培养的细胞，优选使用可以在缺乏动物或人类来源的血清或动物或人类来源的血清成分的条件下培养的细胞。生长或繁殖细胞的条件(见例如TissueCulture,AcademicPress,KruseandPaterson,editors(1973))以及本领域技术人员已知表达重组产物的条件。通常，最大化哺乳动物细胞培养物的生产力的原理、规程和操作技术可见于MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach(M.Butler,ed"IRLPress,1991)。在优选的实施方案中，被表达的蛋白是从细胞或从培养基或从两者中收集(分离)的。它可以被进一步用已知的方法例如本领域技术人员所熟知的过滤、柱层析等等纯化。本发明的选择方法在没有染色质控制元件的情况下也能起作用，但当多顺反子表达单位和这样的元件一起提供时，得到改良的结果。本发明的选择方法在使用的本发明表达盒包含至少一个抗阻抑物序列时工作特别好。取决于选择剂和条件，在某些情况中选择可以如此严格，以至于只有非常少或甚至没有宿主细胞在选择中存活，除非存在抗阻抑物序列。因此，新的选择方法和抗阻抑物序列的组合提供了一种非常吸引人的获得有限数目的克隆的方法，这些克隆具有大大改良的高表达感兴趣多肽的机会，同时获得的包含具有抗阻抑物序列的表达盒的克隆提供了感兴趣多肽的稳定表达，即它们比传统表达盒较不倾向于沉默或其它降低表达的机制。在一方面，本发明提供了具有与WO2006/048459所揭示的构型不同构型的多顺反子转录单位在本发明的不同构型中，编码感兴趣多肽的序列位于编码选择标记多肽的序列的上游，选择标记多肽可操作地连接到不依赖帽的翻译起始序列，优选地为内部核糖体进入位点(IRES)。这样的多顺反子转录单位同样为已知的(例如Reesetal，1996，WO03/106684)，但还没有和非ATG起始密码子组合。依照本发明的不同方法，选择标记多肽的起始密码子变成非ATG起始密码子，来进一步降低选择标记的翻译起始率。因此这造成所需的选择标记多肽表达水平的降低，并可以造成表达高水平感兴趣多肽的宿主细胞的高效选择，如WO2006/048459中所示实施方案所述。与WO2006/048459的实施方案相比，本发明中这个不同方面的一个可能好处是选择标记多肽的编码序列不需进一步修饰内部ATG序列，因为那里的任何内部ATG序列可以保持不变，这是由于它们已不再和下游多肽的翻译有关。这在选择标记多肽的编码序列含有几个内部ATG序列的时候尤为有利，因为对于本发明，不再需要进行改变这些序列并测试所得构建体的功能性的工作在这种情况中只要突变ATG起始密码子就足够了。下文(实施例1)显示了本发明提供的这种改变方法也产生非常好的结果。本发明DNA分子中选择标记多肽的编码序列是在IRES的控制下翻译的，然而感兴趣多肽的编码序列优选以帽依赖方式翻译。感兴趣多肽的编码序列包含终止密码子，这样第一个顺反子的翻译在IRES的上游终止，这个RES可操作地连接第二个顺反子。本领域技术人员阅读完本发明后将易于发现，如同具有相反顺序的感兴趣多肽和选择标记多肽的编码序列的多顺反子表达单位一样(即WO2006/048459的多顺反子转录单位，并入本文参考)，这些多顺反子表达单位的大部分可以相同方式被有利地改变。例如，选择标记多肽的优选起始密码子、整合进表达盒、宿主细胞、启动子、染色质控制元件的存在等等可以在如上所述的优选实施方案中被改变和使用。这些多顺反子表达单位和表达盒的应用也如上所述。因此，这个方面的确是WO2006/048459中所述方法和手段的替代方法或手段，主要区别在于多顺反子表达单位中多肽的顺序是相反的，并且IRES现在对于选择标记多肽的翻译是必需的。如这里所使用的"内部核糖体进入位点"或"IRES"指的是一种元件，它促进直接的内部核糖体进入顺反子(蛋白编码区域)的起始密码子如通常的ATG,但在本发明中优选为GTG或TTG，从而产生不依赖帽的基因翻译。例如参见JacksonRJ，HowellMT,KaminskiA(1990)TrendsBiochemSci15(12):477-83)和JacksonRJandKaminski,A.(1995)RNA1(10):985-1000。本发明涵盖了任何不依赖帽的翻译起始序列的使用，特别是任何可以促进直接内部核糖体进入顺反子起始密码子的IRES元件。这里所用的"在IRES的翻译控制下"指的是翻译与IRES相关并以不依赖帽的方式进行。这里使用的术语"IRES"包括IRES序列的功能性变体，只要这些变体能够促进直接内部核糖体进入顺反子起始密码子。这里使用的"顺反子"指的是感兴趣蛋白质、多肽、或肽的多核苷酸序列或基因。"可操作地连接"指的是所描述的成分处于使它们可以意图方式起作用的关系中的状态。这样，例如，启动子"可操作地连接"到顺反子是以这样的方式连接，顺反子的表达是在和启动子相容的条件下获得的。同样地，IRES的核苷酸序列可操作地连接到顺反子是以这样一种方式连接，顺反子的翻译是在和IRES相容的条件下获得的。内部核糖体结合位点(IRES)元件可以从病毒和哺乳动物基因中获知(Martinez-Salas,1999)，并且也已经在小合成寡核苷酸的筛选中鉴定(Venkatesan&Dasgupta，2001)。脑心肌炎病毒的IRES已经被详细分析过(Mizuguchietal.,2000)。IRES是编码于DNA中的元件，在转录的RNA中产生一个真核核糖体可以结合并起始翻译的结构。IRES允许2个或多个蛋白从单个RNA分子上产生(第一个蛋白通过结合在RNA5'端帽子结构的核糖体而被翻译(Martinez-Salas，1999))。从IRES元件的蛋白翻译比帽依赖翻译效率更低从IRES依赖的开放读框(ORF)获得的蛋白量范围比从第一个ORF的量少20%到50%(Mizuguchietal.,2000)。IRES依赖翻译效率的降低为利用本发明这个实施方案提供了一个优点。此外，IRES元件的突变可以减弱它们的活性，降低从IRES依赖ORF的表达到低于第一ORF的10%(LopezdeQuinto&Martinez-Salas,1998,Reesetal.,1996)。因此，本领域技术人员清楚改变IRES可以对IRES的基本功能不产生影响(因此，提供了具有减低的翻译效率的蛋白翻译起始位点)，产生修饰的IRES。因此使用这种仍然能提供小百分比翻译(与5'帽子翻译相比)的修饰的IRES也包含于本发明中。本发明使用非ATG起始密码子来显著进一步降低选择标记ORF的翻译起始，于是进一步改良了获得优选宿主细胞即表达高水平感兴趣重组蛋白的宿主细胞的机会。美国专利5,648,267和5,733,779描述了具有削弱的共有Kozak序列(rPylxxATG「Pvl，其中[Py]是嘧啶核苷酸(即C或T)，X是核苷酸(即G、A、T或C)，ATG起始密码子以下划线标明)的显性选择标记序列的应用。美国专利6，107，477描述了选择标记基因的非最佳Kozak序列(AGATCTTTATGGACC，其中ATG起始密码子以下划线标明)的应用。这些专利中没有一个描述了非ATG起始密码子的应用，也没有提供这样做的任何建议。进一步地，他们对与IRES的组合也只字不提。而且，因为IRES本身已经具有比帽依赖翻译降低的翻译起始，在本发明前不可能预见将IRES和选择标记的非ATG起始密码子的组合是否能够提供选择标记多肽的足够翻译以产生任何可选择水平的选择标记多肽。本发明示出了这个结果，提供了令人惊讶的有效选择系统。本发明也提供了包含可操作地连接到IRES序列的编码选择标记多肽的序列的DNA分子，其中编码选择标记多肽的编码序列包含选自如下的翻译起始序列a)GTG起始密码子；b)TTG起始密码子；c)CTG起始密码子；d)ATT起始密码子；和e)ACG起始密码子。本领域技术人员将知道对本发明的进一步修饰是可行的，例如那些US2006/0195935所述，特别是其实施例20—27，并入本文参考。在某些实施方案中，通过从培养基中去除次黄嘌呤和胸苷(优选也去除甘氨酸)和在培养基中包括叶酸(或者(二氢)叶酸)，哺乳动物5，6，7,8-四氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶(^2>)可以在具有dhfr—表型的细胞中(例如CHO-DG44细胞)用作选择标记(Simonsenetal,1988)。d/^基因可以例如来自于小鼠基因组或小鼠cDNA并用于本发明，优选地给它提供GTG或TTG起始密码子(见SEQ.ID.N0.73的d/^基因序列)。在所有这些实施方案中，"从培养基中去除"指的是培养基中基本上不含所示成分，意味着在培养基中没有足够的所示成分存在以维持细胞的生长，这样当所示酶的遗传信息在细胞中表达及所示前体成分存在于培养基中时，可以进行良好选择。例如，所示成分存在的浓度低于它在某种细胞类型的培养基中通常所使用的浓度的0.1%。优选地，所示成分不存在于培养基中。本领域技术人员可以依照标准方法制备不含所示成分的培养基，或可以从商业培养基供应商那里获得。用这些类型的代谢酶作为选择标记多肽的一个潜在优点在于它们可以用于将多顺反子转录单位置于连续选择的条件下，这样可能导致感兴趣多肽的更高表达。另一方面，本发明使用^斤代谢选择标记作为在本发明多顺反子转录单位上的一个额外的选择标记。在这样的实施方案中，具有高表达的宿主细胞克隆的选择首先通过使用例如抗生素选择标记例如zeocin、新霉素等建立，本发明这些标记的编码序列将具有GTG或TTG起始密码子。在合适的克隆选择之后，抗生素选择结束，使用代谢酶选择标记的连续或间断选择可以通过在缺乏合适的上述鉴定的成分和含有合适的上述前体成分的培养基中培养细胞来进行。在这方面，代谢选择标记可操作地连接到IRES上，并可以具有它通常的ATG成分，起始密码子可以从GTG或TTG中适当选择。在这方面，多顺反子转录单位至少是三顺反子。本发明操作将利用除非特别指明传统的免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术，这些都在本领域技术人员的知识范围内。参见Sambrook,FritschandManiatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual:第二版,1989;CurrentProtocolsinMolecularBiology,AusubelFM,etal,eds,1987;theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);PCR2:APracticalApproach,MacPhersonMJ，HamsBD,TaylorGR,eds,1995;Antibodies:ALaboratoryManual,HarlowandLane,eds，1988。本发明将在下列实施例中进一步阐明。实施例不是以任何方式来限制本发明。它们仅仅用来阐明本发明。实施例实施例1描述了具有本发明多顺反子转录单位的选择系统，很明显在并入本文参考的WO2006/048459的实施例8—26中描述的变化也可以用于并测试本发明的多顺反子转录单位。对于US2006/0195935的实施例20—27也是一样的。实施例1:通过将修饰的Zeocin抗性基因置于IRES序列后进行严格选择WO2006/048459的实施例8—26(以全文并入本文参考)已经示出了一种选择系统，其中在多顺反子转录单位上编码选择标记蛋白的序列在编码感兴趣蛋白的序列的上游，其中选择标记的翻译起始序列是非最佳的，其中其余的内部ATG已经从选择标记编码序列中去除。该系统造成高严格性选择系统。例如，其中翻译起始密码子变为TTG的Zeo选择标记示出非常高的选择严格性，以及下游编码的感兴趣蛋白的非常高水平的表达。在另一个可能的选择系统(即本发明的系统)中，选择标记例如Zeo置于IRES序列的下游。这产生了多顺反子mRNA，从这个mRNA上Zeo基因产物通过IRES依赖的起始作用进行翻译。在通常的d2EGFP-IRES-Zeo构建体中(即现有技术的一种构建体，例如WO2006/005718)，Zeo起始密码子为最佳的ATG。我们测试了改变ZeoATG起始密码子为例如TTG(称为IRES-TTGZeo)与通常的IRES-ATGZeo相比是否造成增加的选择严格性。结果使用的构建体示于图l。对照构建体由CMV启动子、d2EGFP基因、IRES序列(使用的IRES的序列(Reesetal，1996)在这个实施例中为AATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACC丁GCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCCGGGATA;SEQ.ID.NO.82)禾BTTGZeo选择标记即具有TTG起始密码子的zeocin抗性基因组成('d2EGFP-IRES-TTGZeo')。另一个构建体也一样，但是含有位于表达盒上游的STAR7和STAR67以及表达盒下游的STAR7的组合('STAR7/67d2EGFP-IRES-TTGZeoSTAR7')。两个构建体都转染CHO-K1细胞中并在含有100ng/mlZeocin的培养基中进行选择。用对照构建体转染后出现4个克隆，而用含有STAR的构建体转染后出现6个克隆。这些独立的菌落在分析d2EGFP表达水平前分离培养。如图1所示，在构建体中整合STAR元件导致具有高d2EGFP表达水平的菌落的形成。而没有STAR元件的对照菌落('d2EGFP-IRES-TTGZeo，)只有一个克隆表现出一些d2EGFP表达。表达水平也比那些用其它用含有IRES(所述IRES具有含有标准ATG起始密码子的常规Zeo)而有或无STAR元件('d2EGFP-IRES-ATGZeo'和'STAR7/67d2EGFP-IRES-ATGZeoSTAR7，；在这些ATGZeo构建体中也有STAR元件的增强作用，但与新的TTGZeo变体相比则是低的)的对照构建体的表达水平高出很多。这些结果表明将具有TTG起始密码子的Zeo选择标记置于IRES序列的下游，组合STAR元件，能很好的运作并建立起一个严格的选择系统。从这些数据和WO2006/048459的实施例8—26以及US2006/0195935的实施例20—27，很清楚标记可以WO2006/048459的实施例8—26以及US2006/0195935的实施例20—27的相同方式变化。例如，代替TTG起始密码子，可以使用GTG起始密码子，标记可以从Zeo变成不同的标记，例如Neo、Blas、dhfr、puro等等，所有都具有GTG或TTG作为起始密码子。STAR元件可以用不同的STAR序列或其不同的置换来改变，或将它们替换为其它染色质控制元件，例如MAR序列。这导致了对现有技术中具有通常ATG起始密码子的标记的IRES的选择系统的改良。作为非限制性实例，代替修饰的Zeo抗性基因(TTGZeo)，修饰的新霉素抗性基因被置于IRES序列的下游。这个修饰为Neo编码序列的翻译起始密码子ATG被置换为TTG翻译起始密码子，产生TTGNeo。被或不被STAR元件包围的CMV-d2EGF-IRES-TTGNeo构建体转染CHO-K1细胞。挑选菌落并增殖细胞和检测d2EGFP值。这个('IRES-TTGNeo，)导致了对已知在IRES下游具有ATG起始密码子的Neo('IRES-ATGNeo')的选择系统的改良。这个改良在TTGNeo构建体包含STAR元件时特别明显。实施例2:将修饰的dhfr基因置于IRES序列后的表达的稳定性修饰Zeocin选择标记的翻译起始密码子为一个比通常ATG密码子使用频率少很多的翻译起始密码子，产生了高严格性选择系统。在wo2006/048459所述的选择系统中，TTGZeo置于感兴趣基因的上游。在另一个可能的选择系统中，Zeo选择标记置于IRES序列的下游(本申请，见实施例1)。这产生了双顺反子mRNA，从中Zeo基因产物从IRES序列中的翻译起始密码子开始翻译。在这个实验中，我们组合了这两个系统的实施方案。我们将TTG选择标记置于报告基因的上游，并将具有IRES的GTG或TTG修饰的代谢标记与报告基因偶联。可以使用不同的选择标记基因，例如Zeocin和新霉素抗性基因，以及dhfr基因。这里我们将修饰的Zeocin抗性基因TTGZeo(见WO2006/048459)置于感兴趣基因的上游，将dhfr选择基因置于感兴趣基因的下游，并偶联IRES(图2)。这个表达盒的目的在于选择生产高水平蛋白质的哺乳动物细胞克隆，首先对Zeocin进行选择。TTGZeo-感兴趣基因构型最有效地达到这个目标。在这个初步选择期之后，dhfr-蛋白的特征被用来维持在没有Zeocin抗生素时的高表达水平。活性选择压力对于使TTGZeo选择菌落的蛋白表达水平在很长的时期内保持相同高水平似乎是有益的。这可以例如通过在培养基中保持最少量的Zeocin实现，但这在工业设置上由于经济上或可能的管理上的原因(Zeocin有毒而且昂贵)并不受欢迎。另一种方法是将感兴趣基因偶联到在代谢途径中代谢1或多个关键步骤的酶的选择标记上。关键指的是细胞不能自己合成特殊的关键性代谢成分，意味着这些成分必须存在于培养基中以使细胞存活。熟知的例子为哺乳动物细胞不能合成的必需氨基酸，这必须存在于培养基中以使细胞存活。另一个实例涉及5,6,7,8-四氢叶酸合成^^基因。相应的dhfr蛋白是叶酸代谢途径中的酶。dhfr蛋白特异性地转化叶酸为5,6,7，8-四氢叶酸，为从头合成嘌呤(次黄嘌呤)、胸苷酸(胸苷)和氨基酸甘氨酸所需的甲基穿梭体(shuttle)。操作上，非毒性物质叶酸必须存在于培养基中(Urlaubetal，1980)。而且，培养基必须缺乏次黄嘌呤和胸苷，因为当细胞可以获得这些成分时，就会跳过对dhfr酶的需求。CHO-DG44细胞缺乏^斤基因，因而这些细胞需要在培养基中有甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷来维持生存。但是，如果终产物甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷这些在培养基中不存在而存在叶酸，并且由于在细胞中的表达盒上存在而提供了d々斤基因时，细胞可以转化叶酸为5，6，7,8-四氢叶酸，并在这样的培养基中存活。这个原理已经被运用多年作为生产稳定转染的哺乳动物细胞系的选择方法。这里，我们运用这种原理，不是用来最初选择稳定克隆(这一点通过Zeocin来实现)，而是用来维持细胞在代谢选择压力下。这样做的优点在于初始的非常高的蛋白表达可以通过TTGZeo选择系统获得，并且在培养基中不需要保持Zeocin也可以维持这些高表达水平。或者，Zeocin可以从培养基中去除，在培养基中缺乏甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷(GHT)或仅仅缺乏次黄嘌呤和胸苷(HT)己经足够维持足够高的选择压力来确保高水平的蛋白表达。这样一种构型需要存在两种选择标记，Zeocin抗性基因和基因两者都需要存在于表达盒中。如上所述，当两个基因和感兴趣基因以这样一种构型即三顺反子mRNA从同一个启动子转录的构型存在时，可以有效获得。当修饰的Zeocin抗性基因(TTGZeo)位于d2EGFP基因上游时，^^基因需要通过例如IRES序列偶联d2EGFP基因的下游(图l)。结果我们制备了这样的构建体，其中TTGZeo选择标记位于d2EGFP报告基因的上游，dhfr选择标记位于d2EGFP基因的下游，通过IRES序列偶联(图2)。这些构建体两侧为STAR7/67/7。制备了这种构建体的三种版本ATGdhfr,GTGdhfr或TTGdhfr，每个名字代表了用于^斤基因的起始密码子。这些构建体转染CHO-DG44细胞。DNA转染用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行，细胞生长在存在400吗/mlZeocin的IMDM培养基(Gibco)+10%FBS(Gibco)十HT-supplement中。在400pg/mlZeocin存在时测量时，在14个TTGZeoIRESdhfr克隆中的平均d2EGFP值为341(第一天)。测量后，细胞被分开并培养于三种条件下(1)在培养基中含有400pg/mlZeocin以及次黄嘌呤和胸苷(HT-supplement)，(2)在培养基中不含Zeocin,但含有HT-supplement，(3)不含Zeocin禾口HT-supplement。简要来说，在条件1，细胞只在Zeocin选择压力下，在条件2，细胞不在任何选择压力下，在条件3，细胞在DHFR选择压力下。最后的条件3需要连续的dhfr基因表达以使dhfr蛋白表达而使细胞存活。65天后我们再次测量d2EGFP值。TTGZeoIRESM￡dhfr克隆在Zeocin选择下的平均d2EGFP值现在为159(图2)。TTGZeoIRESATGdhfr克隆在没有Zeocin但有HTsupplement的条件下的平均d2EGFP值为20(图2)。TTGZeoIRESATGdhfr克隆在没有Zeocin选择和没有HTsupplement条件下的平均d2EGFP值为37(图2)。整体上我们观察到了d2EGFP值的下降，但最严重的是在缺乏Zeocin的时候，不管HTsupplement存不存在。我们以同样的方法进行了TTGZeoIRESdhfr构建体的实验。在存在400ng/mlZeocin测量时，在15个TTGZeoIRESGTGdhfr克隆中平均d2EGFP值为455(第一天)(图3)。测量后细胞被分开并按上述三个条件进一步培养。65天后重新测量d2EGFP值。TTGZeoIRESGTGdhfr克隆在Zeocin选择下的平均d2EGFP值现在为356(图3)。TTGZeoIRESGTGdhfr克隆在没有Zeocin选择但有HTsupplement的条件下的平均d2EGFP值为39(图3)。TTGZeoIRESGTGdhfr克隆在没有Zeocin选择和没有HTsupplement条件下的平均d2EGFP值为705(图2)。在这个例子中，我们观察到d2EGFP值的下降仅发生在缺乏Zeocin但有HTsupplement的条件下(条件2)。在缺乏Zeocin同时也缺乏HTsupplement的条件下d2EGFP值变得非常高(条件3)。这可能表明dhfr蛋白的表达水平，由于GTGdhfrmRNA的翻译频率的削弱，低到足够产生非常高的选择严格性。这种选择压力，在不含有任何毒性物质的条件下，已经足够高来维持长期的高蛋白表达水平，并且很明显地甚至还随着时间改良了这些表达水平。我们以同样的条件对TTGZeoIRESU￡dhfr构建体进行了实验。在4存在00吗/mlZeocin测量时，在18个TTGZeoIRESGTGdhfr克隆中平均d2EGFP值为531(第一天)(图4)。测量后细胞被分开并按上述三个条件进一步培养。65天后重新测量d2EGFP值。TTGZeoIRESTTGdhfr克隆在Zeocin选择下的平均d2EGFP值现在为324(图4)。TTGZeoIRESTTGdhfr克隆在没有Zeocin选择但有HTsupplement的条件下的平均d2EGFP值为33(图4)。TTGZeoIRESTTGdhfr克隆在没有Zeocin选择和没有HTsupplement条件下的平均d2EGFP值为1124(图4)。再一次地，我们观察到d2EGFP值的下降仅发生在缺乏Zeocin但有HTsupplement的条件下(条件2)。在缺乏Zeocin同时也缺乏HTsupplement的条件下，d2EGFP值变得甚至比TTGZeoIRESGTGdhfr构建体还要高(条件3)。因为TTG变体比GTG变体更严格，预期TTGdhfr所翻译的dhfr蛋白甚至比GTGdhfr变体所翻译的还要少。这种TTGdhfr变体的增加的选择压力，在不存在任何毒性物质的条件下，足够高地来维持长期的高蛋白表达水平，并且很明显地甚至随着时间也改良了蛋白表达水平。数据显示通过IRES偶联W>基因的非ATG起始密码子变体到d2EGFP基因获得在CHO-DG44细胞中高稳定性的高水平d2EGFP表达。这发生在培养基中不含Zeocin和必需代谢终产物时。通过修饰的TTGZeo选择标记对Zeocin的预先选择使得有效地建立起具有高水平d2EGFP表达的菌落。现在仅仅需要简单地改变一下培养基(去除Zeocin和HT)就能够维持d2EGFP的高水平表达，并甚至改良这些表达水平。实施例3:将修饰的dhfr基因置于弱化的IRES序列后的表达提高不是基因扩增的结果。在现有技术中，用一斤基因作为选择标记通常依赖于说#基因的扩增。一种毒性剂，甲氨蝶呤用于这种系统中来扩增dhfr基因，并伴随着所需的转基因，其中多至数千个拷贝可以在这样的扩增后整合到CHO细胞的基因组中。虽然这些高拷贝数量产生了高表达水平，它们也被认为是一种缺点，因为这么多的拷贝可能造成基因组不稳定性的增加，并且随后的从培养基中去除甲氨蝶呤会造成许多扩增的基因座的快速去除。在实施例2中，没有使用甲氨蝶呤来抑制dhfr酶活性。只有次黄嘌呤和胸苷前体从培养基中去除，这足够获得蛋白表达的稳定性，并且甚至能提高表达水平。因此我们认定是我们设计中dhfr酶的使用导致了基因扩增。结果我们在测量d2EGFP值的同一天(65)，从实施例2中描述的克隆中分离DNA。我们用这个DNA来确定d2EGFP的拷贝数。在Zeocin选择下TTGZeoIRESATGdhfr克隆中的平均d2EGFP拷贝数为86(条件1)(图5)。TTGZeoIRESATGdhfr克隆在没有Zeocin选择但有HTsupplement的条件下的平均d2EGFP拷贝数为53(条件2)(图5)。TTGZeoIRESATGdhfr克隆在没有Zeocin选择和没有HTsupplement条件下的平均d2EGFP拷贝数为59(条件3)(图5)。在Zeocin选择下TTGZeoIRESGTGdhfr克隆中的平均d2EGFP拷贝数为23(条件l)(图6)。TTGZeoIRESGTGdhfr克隆在没有Zeocin但有HTsupplement的条件下的平均d2EGFP拷贝数为14(条件2)(图6)。TTGZeoIRESGTGdhfr克隆在没有Zeocin选择和没有HTsupplement条件下的平均d2EGFP拷贝数为37(条件3)(图6)。在Zeocin选择下TTGZeoIRESTTGdhfr克隆中的平均d2EGFP拷贝数为33(条件1)(图7)。TTGZeoIRESTTGdhfr克隆在没有Zeocin但有HTsupplement的条件下的平均d2EGFP拷贝数为26(条件2)(图7)。TTGZeoIRESTTGdhfr克隆在没有Zeocin选择和没有HTsupplement条件下的平均d2EGFP拷贝数为32(条件3)(图7)。在任一个情况中，我们均没有观察到去除HTsupplement后d2EGFP拷贝数的明显增加，在GTGdhfr和TTGdhfr变体的情况中导致了d2EGFP值的增加。使用这两种构建体d2EGFP值随时间保持稳定甚至显著提高的事实一定是由于dhfr蛋白的作用。而且，在TTGZeoTTGdhfr克隆中没有观察到任何的d2EGFP拷贝数增加，在TTGZeoGTGdhfr克隆中也仅仅观察到微量的增加。有趣的是，在最低生产者、TTGZeo^dhfr克隆中的总体d2EGFP拷贝数比在两种变体中的都高，而这些克隆没有维持最初的高d2EGFP荧光值(见实施例2)。我们从这些数据中得出结论，通常所知的当使用dhfr蛋白组合添加甲氨蝶呤中观察到的基因扩增对随时间维持d2EGFP表达水平稳定以及观察到的这些表达水平的提高没有作用。相反，在GTG和TTGdhfr变体中，似乎每个d2EGFP基因拷贝表达更多的d2EGFP蛋白。我们如上进一步分析不同克隆在不同条件下的d2EGFPmRNA水平，发现这些mRNA水平普遍地具有d2EGFP荧光值的趋势。因此我们得出结论，d2EGFP荧光值的增加是由于mRNA水平的增加，而不是改变了翻译效率。参考文献Kaufman,RJ.(2000)OverviewofvectordesignformammaliangeneexpressionMolBiotechnol16,151-160.KozakM.(1986)PointmutationsdefineasequenceflankingtheAUGinitiatorcodonthatmodulatestranslationbyeukaryoticribosomes.Cell44:283-292.KozakM.(1987)Ananalysisof5'-noncodingsequencesfrom699vertebratemessengerRNAs.NucleicAcidsRes.15:8125-8148.KozakM.(1989)Contexteffectsandinefficientinitiationatnon-AUGcodonsineucaryoticcell-freetranslationsystems.MolCellBiol.9:5073-5080.KozakM.(1990)Downstreamsecondarystructurefacilitatesrecognitionofinitiatorcodonsbyeukaryoticribosomes.ProcNatlAcadSciUSA87:8301-8305.KozakM.(1997)RecognitionofAUGandalternativeinitiatorcodonsisaugmentedbyGinposition+4butisnotgenerallyaffectedbythenucleotidesinpositions+5and+6.EMBOJ.16:2482-2492.KozakM.(2002)Pushingthelimitsofthescanningmechanismforinitiationoftranslation.Gene299:1-34.LopezdeQuinto，S，andMartinez-Salas,E.(1998)ParametersinfluencingtranslationalefficiencyinaphthovirusIRES-basedbicistronicexpressionvectorsGene217,51-6.Martinez-Salas,E.(1999)InternalribosomeentrysitebiologyanditsuseinexpressionvectorsCurrOpinBiotechnol10，458-64.McBurney，MW，Mai，T,Yang，X,andJardine,K.(2002)Evidenceforrepeat-inducedgenesilencinginculturedMammaliancells:inactivationoftandemrepeatsoftransfectedgenesExpCellRes274，1-8.Mizuguchi,H,Xu，Z，Ishii-Watabe,A,Uchida,E，andHayakawa，T.(2000)IRES-dependentsecondgeneexpressionissignificantlylowerthancap-dependentfirstgeneexpressioninabicistronicvectorMolTher1,376-82.Rees,S,Coote，J，Stables,J,Goodson,S,Harris,S，andLee,MG.(1996)Bicistronicvectorforthecreationofstablemammaliancelllinesthatpredisposesallantibiotic-resistantcellstoexpressrecombinantproteinBiotechniques20，102-104,106，108-110.Urlaub，G-&Chasin，LA.IsolationofChinesehamstercellmutantsdeficientindihydrofolatereductaseactivity.ProcNatlAcadSciUSA77，4216-20(1980)Venkatesan,A,andDasgupta,A.(2001)Novelfluorescence-basedscreentoidentifysmallsyntheticinternalribosomeentrysiteelementsMolCellBiol21,2826-37.Whitelaw,E，Sutherland,H,Kearns，M,Morgan,H,Weaving,L，andGarrick,D.(2001)EpigeneticeffectsontransgeneexpressionMethodsMolBiol158,351-68.权利要求1.DNA分子，其包含包含编码i)感兴趣多肽，和ii)在真核宿主细胞中具有功能的选择标记多肽，的至少一个编码序列的多顺反子转录单位其中所述感兴趣多肽具有与选择标记多肽的翻译起始序列相独立的翻译起始序列，其中感兴趣多肽的至少一个编码序列在所述多顺反子转录单位中位于选择标记多肽的至少一个编码序列的上游，其中内部核糖体进入位点(IRES)位于感兴趣多肽的至少一个编码序列的下游和选择标记多肽的至少一个编码序列的上游，并且特征在于编码选择标记多肽的编码序列包含选自如下一组的翻译起始序列a)GTG起始密码子；b)TTG起始密码子；c)CTG起始密码子；d)ATT起始密码子；及e)ACG起始密码子。2.权利要求1的DNA分子，其中选择标记多肽的翻译起始序列包含GTG起始密码子或TTG起始密码子。3.前述任何一项权利要求的DNA分子，其中选择标记多肽提供对选择剂的致死或生长抑制作用的抗性。4.权利要求3的DNA分子，其中所述选择剂选自zeocin，嘌呤霉素，杀稻瘟素，潮霉素，新霉素，甲氨蝶呤，甲硫氨酸磺基肟(methioninesulphoximine)禾卩卡另卩毒素。5.权利要求3的DNA分子，其中所述选择剂为zeocin。6.权利要求1或2的DNA分子，其中所述选择标记多肽是5,6，7,8-四氢叶酸合成酶(dhfr)。7.前述任何一项权利要求的DNA分子，其中所述多顺反子转录单位进一步包含编码第二种在真核细胞中具有功能的选择标记多肽的序列，其中编码第二种选择标记多肽的所述序列a)具有与感兴趣多肽序列的翻译起始序列相独立的翻译起始序列，b)位于所述编码感兴趣多肽的序列的上游，c)在所述第二种选择标记多肽的起始密码子之后直至感兴趣多肽的起始密码子的编码链上没有ATG序列，并且d)具有GTG起始密码子或TTG起始密码子。8.包含前述任一项权利要求的DNA分子的表达盒，所述表达盒包含在所述多顺反子转录单位上游的启动子和在所述多顺反子转录单位下游的转录终止序列，其中所述表达盒在真核宿主细胞中具有功能，能起始多顺反子转录单位的转录。9.权利要求8的表达盒，进一步包含至少一个选自如下一组的染色质控制元件基质或支架附着区(MAR/SAR)，绝缘序列，通用染色质开放元件(UCOE)和抗阻抑物(STAR)序列。10.权利要求9的表达盒，其中所述至少一个染色质控制元件为选自如下一组的抗阻抑物序列a)SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.66的任一个；b)SEQ.ID.NO.1到SEQ.ID.NO.66中任一个的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)在核苷酸序列上与a)或b)至少70%相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)a)到c)中任一个的互补序列。11.一种包含权利要求l一7中任一项的DNA分子或权利要求8—10中任一项的表达盒的宿主细胞，所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，tt;选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。12.—种生产能够表达感兴趣多肽的宿主细胞的方法，所述方法包括:a)将权利要求l一7中任一项的DNA分子或权利要求8—10中任一项的表达盒导入到多个前体细胞中；及b)在适合于表达选择标记多肽的条件下培养所述多个前体细胞，及；c)选择至少一个表达感兴趣多肽的宿主细胞。13.—种表达感兴趣多肽的方法，包括培养包含权利要求8—10中任一项的表达盒的宿主细胞，并从表达盒表达感兴趣多肽。14.权利要求13的方法，进一步包括收获感兴趣多肽。15.权利要求13或14的方法，其中所述宿主细胞为具有dhfr-表型的CHO细胞，并且其中所述表达盒包含选择标记多肽的编码序列，所述选择标记多肽为5，6,7，8-四氢叶酸合成酶(dhfr),其中所述细胞培养在含有叶酸的培养基中，该培养基基本上不含有次黄嘌呤和胸苷。全文摘要本发明提供了一种DNA分子，其包含编码如下的多顺反子转录单位i)感兴趣多肽，和ii)在真核宿主细胞中具有功能的选择标记多肽，其中感兴趣多肽具有与选择标记多肽的翻译起始序列相独立的翻译起始序列，且其中感兴趣多肽的编码序列在所述多顺反子转录单位中位于选择标记多肽的编码序列的上游，且其中内部核糖体进入位点(IRES)位于感兴趣多肽的编码序列的下游和选择标记多肽的编码序列的上游，且其中编码链中编码选择标记多肽的核酸序列包含GTG或TTG起始密码子。本发明也提供了获得表达感兴趣多肽的宿主细胞的方法，所述宿主细胞包含本发明的DNA分子。本发明进一步提供了感兴趣多肽的生产，包括培养包含本发明的DNA分子的宿主细胞。文档编号C12N15/85GK101389763SQ200780006236公开日2009年3月18日申请日期2007年2月21日优先权日2006年2月21日发明者A·P·奥特,H·J·M·范布洛克兰,R·G·A·B·西沃尔特,T·H·J·克瓦克斯申请人:科罗迈吉尼科斯公司