能够产生嘌呤物质的细菌和用于产生嘌呤物质的方法

专利名称：能够产生嘌呤物质的细菌和用于产生嘌呤物质的方法
技术领域：
本发明涉及用于产生噤呤衍生物质的方法，所述嘌呤衍生物质如嘌呤核
苷酸(其通常包括5'-肌苷酸和5'-鸟苷酸)和嘌呤核苷(如肌苷和乌苷)，它们作
为合成噪呤核苷酸的起始材料是重要的物质，等等，以及用于所述方法的属
于芽孢杆菌属的细菌。嘌呤衍生物质用作调味品(seasoning)、药物(drug)、它
们的原料等。
背景技术：
已知通过发酵来产生肌苷和鸟苷的方法，其使用芽孢杆菌属(S""7/w"细 菌的腺噤呤营养缺陷型菌抹和其进一步被赋予对多种药物(如。票呤类似物)的 抗性的衍生才朱(derivative)(专利文件1至8),和短杆菌属(genus 5rev/kjf"eWww) 这样的微生物(专利文件9和10、非专利文件l)，等。
通常通过如下获得这样的突变菌抹用紫外照射或亚硝基胍(N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍)处理微生物，和使用合适的选择培养基选择目标突变体。
此外，还使用遗传工程技术在芽孢杆菌属细菌(专利文件11至20)、短杆 菌属细菌(专利文件21 )和埃希氏菌属C&c/zen'c/H'fl)细菌(专利文件22)中培育产 生噪呤衍生物质的菌林。具体地，例如，公开了用芽孢杆菌属细菌有效地产 生核酸衍生化合物如次黄嘌呤(hypoxanthine)、尿嘧咬(uracil)、鸟。票呤(guanine) 和腺嘌呤(adenine)的方法，所述细菌中将编码噤呤操纵子阻抑物的基因(pi^i ) 破坏(专利文件23)。
在枯草芽孢杆菌(5a"'〃w wto'fe)中，已知如上所述的嘌呤操纵子阻抑物 调节，除嘌呤操纵子(purineoperon)的基因之外，；wM基因，其涉及AMP生 物合成(非专利文件2); g/，yj基因，其涉及甲酰四氢叶酸(formyltetrahydrofolic acid)生物合成(非专利文件3); ;^wG基因，其编码次黄嘌呤/鸟嘌呤的转运物 (transporter)(非专利文件4);等。
此外，已公开了有效产生肌苷的微生物和使用该微生物产生肌苷的方法， 所述微生物是通过除破坏； wW基因之外破坏琥珀酰-AMP合酶基因(pwM)来
4赋予腺嘌呤营养缺陷型，和通过破坏嘌呤核苷磷酸化酶基因(^oD)来抑制肌 苷分解成次黄噪呤，从而衍生的(专利文件8)。
转醛醇酶是戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)的酶中的一种，其催 化由景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose-7-phosphate)和D-甘油醛-3-磷酸 (D-glyceraldehyde-3画phosphate)产生D-赤藓糖-4画磷酸(D画eiythrose-4-phosphate) 和D-果糖-6-磷酸(D-fructose-6-phosphate)的可逆反应。关于此酶和嘌呤衍生物 质的生物合成途径之间的关系只知晓很少，且已尝试通过降低此酶的活性来 培育产生。票呤衍生物质的细菌。
专利文件1:特公昭(KOKOKU) No. 38-23099 专利文件2:特公昭No. 54-17033 专利文件3:特公昭No. 55-2956 专利文件4:特公昭No. 55-45199 专利文件5:特公昭No. 57-14160 专利文件6:特公昭No. 57-41915 专利文件7:特开昭(KOKAI) No. 59-42895 专利文件8:特开No. 2004-242610 专利文件9:特公昭No. 51-5075 专利文件10:特公昭No. 58-17592 专利文件11:特开昭No. 58-158197 专利文件12:特开昭No. 58-175493 专利文件13:特开昭No. 59-28470 专利文件14:特开昭No. 60-156388 专利文件15:特开平No. 1-27477 专利文件16:特开平No. 1-174385 专利文件17:特开平No. 3-58787 专利文件18:特开平No. 3-164185 专利文件19:特开平No. 5-84067 专利文件20:特开平No. 5-192164 专利文件21:特开昭No. 63-248394 专利文件22:国际专利/>开WO99/03988专利文件23:美国专利No. 6，284，495
非专利文件1 非专利文件2 非专利文件3 非专利文件4
Agric. Biol. Chem,， 1978, 42， 399-405
Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1995, 92， 7455-7459
J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209

发明内容
待通过本发明实现的目的
本发明的目的是构建适用于发酵产生嘌呤衍生物质(如噪呤核苷和/或嘌 呤核苷酸)的芽孢杆菌属细菌，和提供使用这样的细菌产生。票呤衍生物质的方法。
实现所述目的的手段
本发明的发明人进行了多项研究以实现上述目的。结果，他们发现如果 在芽孢杆菌属细菌中减少戊糖磷酸途径的转醛醇酶的酶活性，则该细菌产生 噤呤核苷或噤呤核苷酸的能力得到改进，并完成了本发明。
由此本发明提供如下。
(1) 属于芽孢杆菌属的细菌，其具有产生嘌呤衍生物质的能力，其中所述 细菌已被修饰使得转醛醇酶的酶活性减少。
(2) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中所述嘌呤衍生物质是选自下 组的一种或多种。票呤核苷肌苦、黄苷、鸟苷和腺苦。
(3) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中所述嘌呤衍生物质是选自下 组的一种或多种。票呤核苷酸肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。
(4) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中通过^5皮坏编码转醛醇酶的基 因或减少编码转醛醇酶的基因的表达量来减少所述转醛醇酶活性。
(5) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中编码转醛醇酶的基因是编码 下列(A)或(B)的蛋白质的基因
(A) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白质，
(B) 包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基 酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位并具有转醛醇酶活性。
(6) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得磷酸核糖焦磷酸合成酶活性增加。
(7) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得嘌呤操纵 子的表达量增加。
(8) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中通过破坏pwW基因或缺失
噤呤操纵子的弱化子区的部分来增加噤呤操纵子的表达量，所述，W基因是 编码。票呤操纵子的阻抑物的基因。
(9) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得噪呤核苷
磷酸化酶活性减少。
(10) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得果糖二
磷酸酶活性减少。
(11) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得IMP脱
氢酶活性减少。
(12) 如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其为枯草芽孢杆菌。
(13) 产生噤呤衍生物质的方法，其包括在培养基中培养如上所述的属于 芽孢杆菌属的细菌以在细菌的细胞或培养基中？ 1起嘌呤衍生物质的积累，和 从所述细胞或培养基中收集所述噤呤衍生物质。
(14) 如上所述的方法，其中所述。票呤衍生物质是。票呤核苷或嘌呤核苷酸。
(15) 如上所述的方法，其中所述噪呤衍生物质是选自下组的一种或多种 。票呤核苷肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。
(16) 如上所述的方法，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种或多种 嘌呤核苷酸肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。
(17) 产生嘌呤核苷酸的方法，其包括通过如上所述的方法产生嘌呤核苷， 将所述嘌呤核苷与磷酸盐供体，及微生物或酸性磷酸酶进行反应以产生嘌呤 核香酸，所述磷酸盐供体是选自下组的一种或多种聚磷酸(polyphosphoric acid)、石舞酸苯酉旨(phenyl phosphate)和氨曱酰石岸酸(carbamyl phosphate),所述《数 生物具有产生核苷-5'-磷酸酯的能力，和收集所述嘌呤核苷酸。
实施本发明的最佳方式 <1〉本发明的芽孢杆菌属细菌 (I)赋予产生噪呤衍生物质的能力
本发明的芽孢杆菌属细菌是具有产生嘌呤衍生物质的能力且已被修饰使得转醛醇酶的酶活性减少的芽孢杆菌属细菌。
术语"。票呤衍生物质，，(purine-derived substance)指具有嘌呤骨架(purine skeleton)的物质，且其实例包括噤呤核苷、噪呤核香酸，等。噪呤核普包括肌 苷、黄苷、鸟苷、腺苷等，而嘌呤核苷酸包括嘌呤核苷的5'-磷酸酯，例如， 肌芬酸(肌苷-5'-磷酸，此后也称为"IMP")、黄苷酸(黄苷-5'-磷酸，此后也称为 "XMP")、鸟香酸(鸟普-5'-单磷酸，此后也称为"GMP")、腺苷酸(腺苷-5'-单磷 酸，此后也称为"AMP")，等。
短语"产生噪呤衍生物质的能力"指本发明的芽孢杆菌属细菌在培养基中 培养时，所述细菌在细菌细胞或培养基中产生、分泌噤呤衍生物质或引起。票 呤衍生物质积累，其程度使得可从细胞或培养基中收集所述嘌呤衍生物质的 能力。本发明的芽孢杆菌属细菌可具有产生两种或更多种前述嘌呤衍生物质 的能力。
具有产生噤呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌可为内在具有产生嘌呤 衍生物质的能力的细菌，或通过如下方法可得到的细菌使用诱变方法或重 组DNA技术修饰如下所述的芽孢杆菌属细菌使得它们具有产生嘌呤衍生物 质的能力。而且，它可为赋予了产生嘌呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌 或以如稍后描述的方式通过修饰所述细菌使得转醛醇酶的酶活性减少来增强 其产生。票呤衍生物质的能力的细菌。
在本发明中，短语"酶活性减少"包括上述转醛醇酶或稍后描述的分解 噤呤衍生物质的酶(如肌苷单磷酸(IMP)脱氢酶)等的酶活性低于在未修饰的菌 抹，例如芽孢杆菌属细菌的野生型菌抹中的酶活性的状态，和所述活性基本 上消除的状态。这也适用于稍后描述的嘌呤操纵子阻抑物的活性。
用于获得本发明的芽孢杆菌属细菌的芽孢杆菌属细菌的实例包括枯草芽 孢杆菌、解淀粉芽孑包杆菌(S(3c/〃ws awy/o/z々we々c/era)、短小芽孢杆菌CSa"7/w / "附//"力等。
枯草芽孢杆菌的实例包括枯草芽孢杆菌168 Marburg (ATCC 6051)、枯草 芽孢杆菌PY79 (Plasmid, 1984， 12, l-9)等，而解淀粉芽孢杆菌的实例包括解淀 粉芽孢杆菌T(ATCC23842)、解淀粉芽孢杆菌N(ATCC^SM)等。短小芽孢 杆菌的实例包括短小芽孢杆菌Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005，美国专利 No. 3,616,206),等。这些菌抹可由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(地址P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States ofAmerica)获得。
可通过如下获得具有产生噤呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌将例 如，。票呤核苦营养缺陷型或对药物(如噪呤类似物)的抗性赋予如上所述的芽孢 杆菌属细菌(特公昭Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199， 57-14160, 57-41915和 59-42895)。可通过如下获得具有营养缺陷型或药物抗性的芽孢杆菌属细菌 以用于常规诱变处理的诱变剂(mutagen),如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG) 或EMS (甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate))处理细菌。
产生。票呤核苷的芽孢杆菌属细菌的实例包括如下。
作为属于芽孢杆菌属的产生肌苷的菌抹的具体实例，可使用枯草芽孢杆 菌KMBS16菌株。该菌林源自已知的枯草芽孢杆菌trpC2菌林(168 Marburg), 其中破坏了编码噤呤操纵子阻抑物的/7wW基因(purR::spc)、编码琥珀酰-AMP 合酶的基因(purA::erm)、和编码。票呤核芬磷酸化酶的^aD基因 (deoD::kan)(特开昭No. 2004-242610, US2004166575Al)。还可使用枯草芽孢 杆菌AJ3772菌林(FERMP-2555，特开昭No. 62-014794)等。
具有产生鸟苷的能力的芽孢杆菌属细菌的实例包括具有增加的IMP脱氪 酶活性的芽孢杆菌属细菌(特开昭No. 3-58787)、通过将包含如下基因的载体 导入腺噪呤营养缺陷的突变体而获得的芽孢杆菌属细菌，所述基因赋予对嘌 呤类似物或德夸菌素(decoyinine)的抗性(特公昭No. 4-28357),等。
产生。票呤核苷酸的芽孢杆菌属细菌的实例包括如下。
作为产生肌苷酸的芽孢杆菌属细菌，已报道了枯草芽孢杆菌的产生肌苷 的菌株，其具有减弱的磷酸酶活性(Uchida， K.等，Agr. Biol. Chem.， 1961, 25, 804-805; Fujimoto， M., Uchida, K.， Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259)。产生鸟 普酸的芽孢杆菌属细菌的实例包括芽孢杆菌属细菌的如下突变体，其具有腺 。票呤营养缺陷型、对德夸菌素或蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide)的抗性和产 生5'-鸟苷酸(鸟苷-5'-单磷酸，此后称为"GMP")的能力(特公昭No. 56-12438)。
此外，可通过用于培育棒状杆菌型细菌(其典型实例为产氨棒杆菌 (C00^7eZ7a"er/ww a附wom'age"as》的方法构建产生黄脊酸的细菌。例^口，可通 过获得PRPP酰胺转移酶增强的菌抹(特开昭No. 8-168383)、脂肪族氨基酸抗 性菌抹(特开昭No. 4-262790)或脱氲脯氨酸(dehydroproline)抗性菌抹(韩国专 利Unexamined Publication No. 2003-56490)来构建产生黄芬酸的细菌。
而且，用于培育具有产生噪呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌的方法实例还包括增强涉及嘌呤生物合成的酶的活性，所述酶是在细菌细胞中嘌呤 核苷和噤呤核苷酸的生物合成所共有的，即，噤呤生物合成酶。细胞中所述 酶的活性优选增加至大于芽孢杆菌属细菌的未修饰菌林(例如，野生型芽孢杆 菌属细菌)的酶活性的水平。短语"活性增加"包括，例如，每个细胞的酶分子 的数目增加的情况，和每个酶分子的比活性增加的情况，等。例如，可通过 增加酶的基因的表达量来增加活性。
涉及噤呤生物合成的酶的实例包括，例如，磷酸核糖基焦磷酸酰胺转移
酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶[EC: 2.7.6.1]),等。
通过糖源(如流入戊糖磷酸途径的葡萄糖)的代谢产生的 一 些代谢物经由 核酮糖-5-磷酸(ribulose-5-phosphate)转变为核糖-5-磷酸。由生物合成的核糖-5-磷酸，产生磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，其是用于嘌呤核香、组氨酸和色氨酸生 物合成不可缺少的前体。具体地，核糖-5-磷酸通过磷酸核糖焦磷酸合成酶转 变为PRPP。因此，可通过修饰以使其磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加将产 生噤呤衍生物质的能力赋予芽孢杆菌属细菌。
短语"磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加"指磷酸核糖焦磷酸合成酶的活 性与未修饰的菌株如野生型菌抹或亲本菌抹的活性相比增加。可通过例如， Switzer等(Methods Enzymol" 1978, 51, 3-1 l)或Roth等(Methods Enzymol" 1978， 51, 12-17)的方法测量磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性。可通过如下方法来 产生磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加的芽孢杆菌属细菌，例如，根据使用 含有基因的质粒或将基因整合入染色体的方法在芽孢杆菌属细菌中增加编码 磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因的表达，其可以以与在特开昭No. 2004-242610 所述方法相同的方式进行。尽管源自芽孢杆菌属细菌的SEQ ID NO: 3的pra 基因(Genbank登录号X16518)可作为可用于本发明的编码磷酸核糖焦磷酸合 成酶的基因提及，但可以使用源自其它细菌、动物或植物的编码具有磷酸核 糖焦磷酸合成酶活性的蛋白质的任何基因。
此外，当用于噤呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成所不可缺少的前体 PRPP —旦产生时，其中一些通过涉及噪呤生物合成的酶转变为嘌呤核苷酸和 噤呤核苷。编码这些酶的基因的实例包括来自枯草芽孢杆菌的嘌呤操纵子的 基因，具体地，purEKB-purC(orf) QLF-purMNH(J)-purD操纵子的基因(Ebbole D丄和Zalkin H" J. Biol. Chem" 1987， 262， 17， 8274-87)(目前,也称为 purEKBCSQLFMNHD, 5ac"/us sw6"to and Its Closest Relatives,主编A.L.Sonenshein, ASM Press, Washington D.C.， 2002, Genbank登录号NC—000964)， 和来自大肠杆菌(￡^c/2en'c/z/a的pur调节子的基因C&c/zen'c/z/a and 5b/mw e〃fl,第二版，主编F.C, Neidhardt， ASM Press, Washington D.C.， 1996)。
因此，增强这些基因的表达赋予或增强产生噤呤衍生物质的能力。此外， 可用于本发明的嘌呤操纵子的基因不限于这些，并且还可使用源自其它微生 物、动物和植物的基因。
用于增加。票呤操纵子的表达量的方法的实例包括通过使用含有基因的质 粒或将基因整合入染色体等的方法在芽孢杆菌属细菌中增加嘌呤操纵子的基 因的表达。
用于增加噤呤操纵子的表达量的第二种方法包括用更强的启动子代替。票 呤操纵子的启动子，和用共有序列代替天然启动子的-35或-10区。
例如，在枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹，ATCC6051)中， 嘌呤操纵子的-3 5序列是共有序列(TTGACA)，但-10序列是TAAGAT,其不 同于共有序列TATAAT (Ebbole， D丄和H, Zalikn, J. Biol. Chem.， 1987, 262， 8274-8287)。因此，通过将-10序列(TAAGAT)改变为类似的共有序列TATAAT、 TATGAT或TAAAAT，可增加噪呤操纵子的转录活性。可通过下述与基因取 代的方法相同的方法代替启动子序列。
用于增加噤呤操纵子的表达量的第三种方法包括降低噪呤操纵子阻抑物 的表达量(美国专利No. 6，284，495)。短语"噪呤操纵子阻抑物的表达"包括嘌呤 操纵子基因的转录和转录产物的翻译二者。此外，"表达量减少"包括表达量 低于未修饰的菌株如野生型芽孢杆菌属细菌中的表达量的情况，和表达已基 本上消除的情况。
可通过如下方法来减少。票呤操纵子阻抑物(嘌呤阻抑物)的表达量例如， 可采用以紫外线照射或用于常规诱变处理的诱变剂如NTG或EMS处理芽孢 杆菌属细菌并选择显示。票呤阻抑物的表达量减少的突变体。
此外，显示。票呤阻抑物的表达量减少的芽孢杆菌属细菌也可通过如下方 法获得例如，除诱变处理之外，通过使用基因重组技术的同源重组用相应 的不正常发挥功能的基因(此后，也称为"破坏型基因")代替在染色体上编码嘌 呤阻抑物的基因(pw^， GenBank登录号NC—000964,编码区对应于核苷酸号 54439至55293， SEQ ID NO: 5) (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S.禾口 Mizushima， S.， J. Bacteriol,，1985， 162， 1196-1202)。
例如，可用破坏型基因以如下所述的方式代替宿主染色体上的正常基因。 在下文中，解释了 ； wW基因的破坏。可类似地破坏其它基因，如/wM、 ^oD、 ，S、 *和，7/基因。
将具有与染色体上的序列同源的序列且不能在芽孢杆菌属细菌的细胞中 复制的质粒等导入细胞中时，导致在具有同源性的序列的位点以一定频率的 重组。然后将整个质粒重组入染色体中。其后，如果重组又在染色体上具有 同源性的序列的位点发生，则将质粒从染色体中去除。此时，依赖于重组发 生的位点，可将破坏型基因保留在染色体上，且可将原始的正常基因与质粒 一起从染色体去除。通过选择这样的菌抹，可能获得其染色体上正常的； m^ 基因已被破坏型；^W基因代替的菌林。
已经建立了这样的基于同源重组的基因破坏技术，且其包括使用线性 DNA的方法、使用温度敏感型质粒的方法等。此外，还可通过使用如下质粒 来破坏基因，所述质粒含有其中已插入标记基因(如药物抗性基因)的 戶W基因且其不能在目标细菌细胞中复制。即，在已用如上所述的质粒转化 的转化体中，将标记基因并入染色体DNA并赋予药物抗性。由于通过将质粒
组将标记基因以高比率(high rate)并入染色体，因此可有效地选择/ m^ 基因破 坏的菌林。
可通过如下获得用于基因破坏的破坏型； wW 基因具体地，通过用限制 酶消化和再连接(re-ligation)来缺失基因的某个区域，将另一个DNA片 段(标记基因等)插入，W基因中，或在； w^基因的编码区、启动子区等的核 苷酸序列中引起一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，其通 过位点特异性诱变(Kramer, W.和Frits， H.J.， Methods in Enzymology, 1987， 154, 350-367)或通过重组PCR (PCR Technology, Stockton Press (1989))或通过用化 学试剂(如碌b代石克酸钠(sodium hyposulfite)或羟胺(hydroxylamine))处理(Shortle: D.和Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1978, 75， 2170-2174)来进行，然 后是选择其中由，W基因编码的阻抑物的活性减少或基因的转录减少的菌 林。在这些方法中，考虑到可靠性和稳定性，通过用限制酶消化和再连接来 缺失戸W基因的某个区域或另一个DNA片段插入戶W基因中是优选的。 戸W基因的待缺失的某个区域可为，W基因的5'端序列、内部序列或3'端序列。然而，如果该区域占pwri 基因全长的90%以上，更优选95%以上，特别 是97%以上，则阻抑物活性降低的确定性增加。此外，当pwW基因的编码区 中核苷酸的缺失或插入引起移码突变时，考虑到确定地降低阻抑物活性，优 选的是引起核苷酸在多个位点的缺失或插入和引起核苷酸在3'端侧上的缺失 或插入。
也可通过如下得到噤呤阻抑物活性的降低除前述的基因破坏之外，基 于常规的诱变方法将降低胞内噤呤阻抑物活性的突变导入染色体上的； w^ 基因。例如，可通过导入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)或添 加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变，或通过部分地或全部地缺失基因来
得到。此外，也可通过将转座子插入染色体上的J5WW基因来减少阻抑物的活性。
还可通过如下得到。票呤阻抑物活性的降低用较弱的表达控制序列代替 /wW基因的表达控制序列，如染色体DNA上的启动子。通过RNA合成的起 始(initiation)的频率来定义启动子的强度。Goldstein等的文章(Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev" 1995, 1, 105-128)等中描述 了用于评价启动子强度的方法及强启动子的实例。此外，还可能在目标基因 的启动子区域中导入几个核苷酸的核苷酸取代，并由此修饰待弱化的(to be weakened)启动子，如国际专利公开WO00/18935中所披露的。此外，已知核 糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区(spacer),尤其是起始密码子 紧邻上游的序列中几个核苷酸的取代极大地影响了 mRNA的翻译效率。可将 RBS的此修饰与减少目标基因的转录进行组合。
此外，可制备重组DNA并将其转化入宿主芽孢杆菌属细菌，在所述重组 DNA中导入使由pw^基因转录的信使RNA不稳定的突变。
也可以与上述相同的方式减少由稍后描述的pwM、 deoZX gwa5、yZ)/ 和 少w;7/基因编码的酶的活性。
可使用基于pwi 基因的已知核苷S交序列制备的寡核苷酸作为引物通过 PCR由具有嘌呤操纵子的微生物的染色体DNA获得基因。还可使用基 于基因的已知核苷酸序列制备的寡核苷酸作为探针通过杂交由具有嘌 呤操纵子的微生物的染色体DNA文库获得戶W基因。已报道了枯草芽孢杆 菌168 Marburg菌抹的/7wW基因的核苷酸序列(GenBank登录号D26185 (编码 区对应于核苷酸号118041至118898)，或NC—000964 (编码区对应于核苷酸号54439至55296))。; iW 基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列示 于序列表的SEQ IDNOS: 5和6 (特开昭No. 2004-242610)。
用于获得pwi 基因的用于PCR的引物可为能够扩增基因的部分或 全长的任何引物，而具体实例包括具有示于SEQ ID NO: 17 (GAAGTTGATGATCAAAA)和SEQ ID NO: 18 (ACATATTGTTGACGATAAT) 的核苷酸序列的寡核普酸。
用于制备破坏型基因的，W基因不一定需要是全长，W基因，而它可 具有引起基因破坏所需的长度。而且，对用于获得各个基因的微生物没有特 别的限制，只要微生物中的基因具有与用于构建基因破坏菌林的芽孢杆菌属 细菌的；wri 基因的同源性，其程度使得它们引起同源重组。然而，通常优选 使用源于与目的芽孢杆菌属细菌相同的芽孢杆菌属细菌中的基因。
上述标记基因的实例包括药物抗性基因，如大观霉素(spectinomycin)抗性 基因、卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因。可通过由大肠杆菌ECE101菌 株(从芽孢杆菌属遗传原种中心(5"c/〃M Genetic Stock Center) (BGSC)商业上 可得到的)制备质粒pDGl726并从质粒中作为盒(as a cassette)去除抗性基因来 获得粪肠球菌(五w&racocc^/aecato)的大观霉素抗性基因。可通过由大肠杆菌 ECE91菌抹(从芽孢杆菌属遗传原种中心(BGSC)商业上可得到的)制备质粒 pDG646并从质粒中作为盒去除抗性基因来获得金黄色葡萄球菌 (5^p/^/ococcwm^M"的红霉素抗性基因。可通过由大肠杆菌ECE94菌株(从 芽孢杆菌属遗传原种中心(BGSC)商业上可得到的)制备质粒pDG783并从质 粒中作为盒去除抗性基因来获得源自粪链球菌(5^印tococcw /^c"to)的卡那 霉素抗性基因。此外，可通过由枯草芽孢杆菌1E17菌抹(从芽孢杆菌属遗传 原种中心(BGSC)商业上可得到的)制备质粒pC194并使用该质粒作为模板进 行PCR以扩增该质粒来获得金黄色葡萄球菌的氯霉素抗性基因。可通过由大 肠杆菌ECE99菌抹制备质粒pDG1513并从质粒中作为盒去除抗性基因来获 得无乳链球菌(5^e/ tococc^ ag<a/ac""e)的四环素抗性基因(Gene， 1995, 167:335-336)。
将药物抗性基因用作标记基因时，可通过如下来获得，W 基因破坏的菌 林将药物抗性基因在适当的位点插入质粒中的pm^基因，用得到的质粒转 化微生物和选择变成药物抗性的转化体。可通过使用Southern印迹或PCR分使用能够扩增这些基因的引物通过PCR来确认将前述的大观霉素抗性基因、
红霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因并入染色体DNA。
还已知通过位于启动子下游的纟冬止子-抗终止子(terminator-antiterminator) 序列(此后称为弱化子(attenuator)序列)调节。票呤操纵子的表达(Ebbole， D丄和 Zalkin， H., J. Biol. Chem.， 1987， 262, 8274-8287; Ebbole D丄和Zalkin H.， J. Biol. Chem.， 1988， 263, 10894-10902; Ebbole, D丄和Zalkin， H.， J. Bacteriol.， 1989， 171,2136-2141)。因此，可通过将弱化子序列缺失来增加噤呤操纵子的表达量。 可通过与用于破坏，W的方法相同的方法得到弱化子序列的缺失。
为了进一步增加嘌呤操纵子的转录，可将上述方法进行组合。例如，可 将戸W基因破坏，并进一步，可使用质粒扩增其中弱化子序列缺失的嘌呤操 纵子或可将这样的。票呤操纵子的多个拷贝导入染色体。
也可通过如下方法来增强涉及嘌呤生物合成的酶的活性使涉及噤呤生 物合成的酶对其调节脱敏，例如，根据使酶对反馈抑制脱敏的前述方法 (WO99/03988)进行。
此外，还可通过减弱细胞对嘌呤衍生物质的摄取来增强产生嘌呤衍生物 质的能力。例如，可通过将涉及细胞对嘌呤核苷的摄取的反应阻断来减弱细 胞对嘌呤核苷的摄取。涉及细胞对噪呤核苷的摄取的反应的实例包括通过核 香通透酶(nucleoside permease)催化的反应。
此外，当产生嘌呤核苷时，可减少分解噤呤核苷的酶的活性以增强产生 噤呤核芬的能力。这样的酶的实例包括嘌呤核苷磷酸化酶。
将通过涉及嘌呤生物合成的酶由PRPP生物合成的。票呤核苷酸脱磷酸化 (dephosphorylate)并由此转变为嘌呤核苷。为了有效地引起嘌呤核苷的积累， 优选降低嘌呤核香磷酸化酶的活性，所述酶进一步将噪呤核苷降解为次黄嘌 呤等。即，优选减弱或消除利用嘌呤核苷(如肌苷)作为底物的嘌呤核苷磷酸化 酶的活性。
具体地，可通过在芽孢杆菌属细菌中破坏编码。票呤核苷磷酸化酶的^oD 和基因来减少嘌呤核苷磷酸化酶活性。可通过破坏tfeoD和pw/ G基因 中的一种或两者来修饰本发明的芽孢杆菌属细菌。作为^aD和pwpC 基因， 例如，可使用源自芽孢杆菌属细菌的那些基因(&oZ): Genbank登录号 NC—000964 (SEQ ID NO: 7)， Genbank登录号NC—000964 (SEQ ID NO:
9)),并且可以以与用于前述破坏/ wW基因相同的方式获得基因破坏的菌抹。也可通过减少琥珀酰-AMP合酶的活性来增强产生噤呤衍生物质的能力。
编码琥珀酰-AMP合酶的基因的实例包括基因。基因的实例包括， 例如，具有登记为GenBank登录号NC一000964 (编码区对应于互补链的核苷 酸号4153460至4155749， SEQ ID NO: ll)的核苷酸序列的那些。
也可通过减少肌苷单磷酸(IMP)脱氢酶的活性来增强产生噪呤衍生物质 的能力。编码IMP脱氢酶的基因的实例包括^/"万基因。gw"5基因的实例包 括，例如，具有登记为GenBank登录号NC一000964 (编码区对应于核苷酸号 15913至17376， SEQIDNO: 13)的核苷酸序列的那些。
此外，还可通过减少果糖二磷酸酶的活性来增强产生噤呤衍生物质的能
力。编码果糖二磷酸酶的基因的实例包括yz^基因。y&p基因的实例包括，例
如，具有登记为GenBank登录号NC_000964 (编码区对应于核苷酸号4127053 至4129065, SEQ ID NO: 15)的核香酸序列的那些。
而且，作为增强产生噤呤衍生物质的能力的方法，可预期的是扩增编码 如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有分泌嘌呤衍生物质的活性。其中这样的 基因已得到扩增的细菌的实例包括，其中A"基因得到扩增的芽孢杆菌属细 菌(特开昭No. 2003-219876)。
如上所述待破坏的pwi 、 deoD、 ；w/ G、 pwM、 gwa5和基因和其表 达待增强的； M基因可为保守的变体，例如，编码分别具有SEQIDNOS: 6、 8、 10、 12、 14、 16和4的氨基酸序列的蛋白质的DNA，其包括一个或几个 氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，且分别具有嘌呤阻抑物、嘌 呤核普磷酸化酶、琥珀酰-AMP合酶、IMP脱氢酶、果糖二磷酸酶或磷酸核 糖焦磷酸合成酶的活性。前述术语"几个"所指的数目为，例如2至50，优 选2至30，更优选2至10。
如上所述的氨基酸序列的这种变化通常是保守的变化，其保持蛋白质的 活性。保守氨基酸取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、 His或 Lys取代Arg;用Glu、 Gln、 Lys、 His或Asp取代Asn;用Asn、 Glu或Gin 取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、 Glu、 Lys、 His、 Asp或Arg取代 Gin;用Asn、 Gln、 Lys或Asp取代Glu;用Pro取 Gly;用Asn、 Lys、 Gln、 Arg或Tyr取代His;用Leu、 Met、 Val或Phe取代Ile;用Ile、 Met、 Val或 Phe取代Leu;用Asn、 Glu、 Gln、 His或Arg取代Lys;用Ile、 Leu、 Val或 Phe取代Met;用Trp、 Tyr、 Met、 Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、 Phe或Tip取代Tyr; 和用Met、 lie或Leu取代Val。
上述pwi 、 ^feoD、 / w; G、 /wM、 gwa5和/Z / 基因和/ w基因的保守变体 的具体实例包括分别与具有SEQIDNOS: 5、 7、 9、 11、 13、 15和3的核苷 酸序列的DNA显示例如，70%以上，优选80%以上，更优选90°/。以上，特别 优选95%以上的同源性的DNA。更具体地，保守变体的实例包括在严格条件 下能够与具有与SEQ ID NOS: 5、 7、 9、 11、 13、 15和3的核苷g吏序列互补 的核苦酸序列的DNA杂交的DNA。严格条件的实例包括在60°C和lxSSC 的盐浓度、0.1%SDS，优选0.1xSSC、 0.1%SDS洗涤一次或多次，优选两次 或三次的条件。
可通过BLAST检索、FASTA检索、CrustalW的计算方法等评价DNA的 同源性。
BLAST (基本局部比对才企索工具(basic local alignment search tool))是程序 blastp、 blastn、 blastx、 megablast、 tblastn和tblastx所使用的探索式的4全索算 法(heuristic search algorithm),而且在使用Karlin、 Samuel和Stephen F. Altschul 的统计方法("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993， 90:5873-7)的基础上 通过这些程序获得的结果被认为是显著的。W.R. Pearson描述了 FASTA检索 方法("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 19卯183:63-98)。 Thompson J.D,、 Higgins D.G.和 Gibson T丄描述了 Clustal W方法("CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res.， 1994, 22:4673-4680)。
而且，用于制备破坏型基因的DNA也可为pwi 、 fifeoD、 / m; G、 / wM或 gz^S基因的保守变体。
可以与稍后描述的用于编码转醛醇酶的基因相同的方式将目标基因并入 芽孢杆菌属细菌的染色体DNA。(II)用于减少转醛醇酶的酶活性的j奮饰
可通过如下获得本发明的芽孢杆菌属细菌修饰具有产生噪呤衍生物质
的能力的菌抹(如上述的那些)使得转醛醇酶的酶活性减少。对修饰的次序没有 限制，且在修饰细菌使得其转醛醇酶的酶活性减少之后，可将产生噤呤核苷 酸的能力赋予细菌。
转醛醇酶是催化由景天庚酮糖-7-磷酸和D-甘油醛-3-磷酸可逆地产生D-赤藓糖_4-磷酸和D-果糖-6-磷酸的反应的酶，且此反应是戊糖磷酸途径的反应 中的一个。"戊糖磷酸途径，，指如下途径其中将吸收入细胞中的葡萄糖通过 葡萄糖激酶磷酸化以生物合成葡萄糖-6-磷酸，而葡萄糖-6-磷酸氧化转变为核 糖_5-磷酸，和由通过差向异构酶、转酮醇酶(EC: 2.2.1.l)和转醛醇酶(EC: 2.2丄2)的作用将丙糖、丁糖(tetrolose)、戊糖、己糖和庚糖的磷酸酯互相转换 的可逆过程组成的途径。
可通过如下方法测量转醛醇酶的酶活性。例如，可通过用磷酸丙糖异构 酶(phosphoglucoisomerase)将产生的D-甘油醛-3-磷酸转变为羟基丙酮磷酸并 使用甘油-3-磷酸脱氢酶和NADH测量羟基丙酮磷酸来测量活性(Ochoa, T.和 Horecker, B丄.，1966， Methods Enzymol., 9, 499-505)。
转醛醇酶的酶活性减少的这样的修饰可通过如下得到例如，如上面用
于破坏/ wi 基因所说明的，通过同源重组用不正常发挥功能的相应基因(例 如，通过将标记基因(如药物抗性基因)插入转醛醇酶基因所获得的破坏型基因) 取代染色体上的转醛醇酶基因。此外，如用于；^W 基因所述，可通过常规诱 变方法将降低胞内转醛醇酶的酶活性的突变导入染色体上的转醛醇酶基因。
枯草芽孢杆菌的转醛醇酶的实例包括由SEQIDNO: 2中所示的212个氨 基酸残基组成的蛋白质，而且可将编码蛋白质的基因，优选具有SEQIDNO: 1的核苷酸序列的基因(j^/H基因，Genbank登录号NC—000964)用于修饰。 ;^/7/基因存在于枯草芽孢杆菌染色体上的大约325°处。
编码转醛醇酶的基因还可像前述基因一样为ywy/f基因的保守的变体。具 体地，实例包括编码如下蛋白质的DNA，所述蛋白质具有SEQ ID NO: 2的 氨基酸序列，包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位， 并具有转酪醇酶的酶活性。实例还包括编码如下蛋白质的DNA，所述蛋白质 与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列显示50%以上，优选70%以上，更优选 80%以上，特别优选90%以上，最优选95%以上的同源性，并具有转醛醇酶
18的酶活性。更具体地，实例包括在严格条件下能够与具有SEQIDNO: 1的核 苷酸序列的DNA杂交的DNA。严格条件包括在60°C和lxSSC的盐浓度、 0.1%SDS，优选60。C、 O.lxSSC、 0.1%SDS洗涤一次或多次，优选两次或三 次的条件。
如上所述，这样的编码基本上与转醛醇酶相同的蛋白质的DNA可通过如 下获得，例如，修饰编码所述酶的核苷酸序列使得特定部分的氨基酸残基通 过位点特异性诱变进行取代、缺失、插入、添加或倒位。如上所述，也可通 过常规已知的诱变处理获得这种修饰的DNA。诱变处理的实例包括体外处理 DNA然后用羟胺诱变处理，和处理含有DNA的微生物如埃希氏菌属细菌然 后用紫外照射或用于常规诱变处理的诱变剂(如N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍 CNTG)或亚硝酸)诱变处理。
例如，可使用芽孢杆菌属细菌的染色体DNA作为模板和基于目标基因的 核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物通过PCR方法(聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction), White, T.J.等，Trends Genet" 1989， 5， 185-189)获得 目标基因。可通过，例如Saito和Miura的方法(H. Saito和K. Miura， Biochem. Biophys. Acta, 1963, 72， 619-629; Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98， Baiflikan， 1992)等由作为DNA供体的细菌制备染色体DNA。用于PCR的引物可基于 芽孢杆菌属细菌的已知基因序列，或基于有关在其序列已知的其它细菌的基 因中保守的区域的信息来制备。
用于将目标基因并入芽孢杆菌属细菌的染色体DNA的载体的实例包括 具有温度敏感型复制起点的载体，如pHV1248 (Prtit， M,A"等，J. Bacteriol., 1990， 172, 6736-6740);用于大肠^干菌的载体，如pHSG398 (Takara Shuzo)和 pBluescript SK-(Stratagene); 等。
为了连接目的基因和携带在芽孢杆菌属细菌中发挥功能的标记物的载体 以制备重组DNA,将载体用与目的基因的末端匹配的限制酶消化。通常使用 连接酶如T4 DNA连"l妾酶进行连接。
为了将如上所述制备的重组DNA导入芽孢杆菌属细菌，可使用到目前为 止已报道的任何公知的转化方法。实例包括，例如，由处于生长期的细胞制
R.， J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-22l)和将宿主细胞制成可容易吸收(take up)重组
19DNA的原生质体或原生质球，然后将重组DNA导入DNA受体细胞的方法 (Chang， S.和Choen, S.N.， Molec. Gen. Genet.， 1979, 168, 111-115)。
<2>用于产生噤呤书f生物质的方法
技术领域：
本发明的芽孢杆菌属细菌有效地产生嘌呤衍生物质。因此，通过在适当 的培养基中培养本发明的芽孢杆菌属细菌，可在细菌的细胞或培养基中产生
并积累噤呤衍生物质，如噪呤核苷和嘌呤核普酸。
至于用于本发明的培养基，可使用常规培养基以常规方式进行培养，所
述培养基包含碳源、氮源和矿物盐以及有机痕量营养物如氨基酸和维生素， 根据需要。可使用合成培养基或天然培养基。可使用任何种类的碳源和氮源， 只要待培养的菌抹可以使用它们。
作为碳源，使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、 阿拉伯糖、木糖、海藻糖、核糖、淀粉水解物和糖蜜，和醇如甘油和甘露醇， 而且也可独立地使用或与其它碳源组合使用有机酸如葡糖酸、乙酸、柠檬酸、 马来酸、富马酸和琥珀酸。
作为氮源，使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵、 硝酸盐、有机氮如大豆水解物，等。
作为有机痕量营养物，使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、含有这些 物质的那些如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物等。 当使用生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌林时，需要补充所需的营养物。
作为矿物盐，使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
虽然培养条件可根据待使用的芽孢杆菌属细菌的类型而变化，但将枯草 芽孢杆菌，例如，作为通气培养物培养，同时将发酵温度控制为20至50。C, 将pH控制为4至9。在培养过程中当pH下降时，用碱如氨气中和培养基。 在大约40小时至3天的如上所述方式的培养后，在培养基中积累嘌呤核苷。
培养完成后，可以常规的方式收集在培养基中积累的肌苷。例如，它可 通过沉淀、离子交换层析等来分离。
此外，如果用于本发明的微生物缺少编码核苷酶或核芬酸酶的基因，则 可积累相应的核苦或核苦酸。此外，如果赋予肌苷营养缺陷型，则可积累涉 及其生物合成途径的相关物质或前体。
此外，通过将由本发明的方法制备的肌苷或鸟苷与噪呤核苷磷酸化酶或磷酸核糖基转移酶反应，可获得5，-肌普酸或5'-鸟苦酸。
而且，还可能通过使磷酸转移酶与。票呤核苷反应将使用本发明的微生物
产生的嘌呤核苷进行磷酸化以产生噪呤核苷酸(核苷5'-磷酸酯)(特开昭No. 2000-295996)。例如，可使用如下方法使用埃希氏菌属细菌产生噪呤核苷酸 的方法，所述细菌中导入了编码大肠杆菌的肌苷鸟苷激酶的基因 (WO91/08286),和使用产氨棒杆菌产生。票呤核苷酸的方法，所述细菌中导入 了编码乙酰微小杆菌(五jdgwo&cten^m ace&//cMm)的肌苷鸟苷激酶的基因 (WO96簡01)。
而且，还可能通过将使用本发明的微生物产生的嘌呤核苷与磷酸盐供体， 及微生物或酸性磷酸酶(EC 3丄3.2)反应来产生噪呤核芬酸(核普5'-磷酸酯)， 所述磷酸盐供体是选自下组的一种或多种聚磷酸、磷酸苯酯和氨曱酰磷酸， 所述微生物具有产生核苷5'-磷酸酯的能力。虽然对具有产生核苷5'-磷酸酯 的能力的微生物没有特别的限制，只要选择了具有将嘌呤核苷转变为噪呤核 苷酸的能力的微生物，实例包括，例如，国际专利公开WO96/37603中披露 的微生物。
而且，也可以使用蟑螂埃希氏菌(^c/^n'c/n'a 6/a"ae) JCM 1650、无花果 沙雷氏菌(&rra"a,canVz) ATCC 33105、植生克雷伯氏菌(《/eZwW/a ; /"/^co/a) IFO 14939 (ATCC 33531)、肺炎克雷伯氏菌(A7efo/e〃a pwewmom'ae) IFO 3318 (ATCC 8724)、 土生克雷伯氏菌(《/efc/e〃a fem'ge朋)IFO 14941 (ATCC 33257)、 摩氏摩才艮氏菌(Afo《"we〃" wo/^"w7) IFO 3168、产气肠4干菌(五"feraZ^"w 野og函)IFO 12010、产气肠杆菌IFO 13534 (ATCC 13048)、河流色杆菌 (C7^cwo6acfer/ww _/7wv/"///e) IAM 13652 、 紫色色斥干菌(C7 ;-owo6"c/e/-/ww v/o/acewm) IFO 12614 、 氏西地西菌(Ce&cea /apage/) JCM 1684、戴氏西;也 西菌(CedecM d"v&/ae) JCM 1685、奈氏西地西菌(Ce^fecea w"eW) JCM 5909 、 等，其公开于特开昭No. 07-231793。
作为酸性磷酸酶，例如，可使用特开昭No. 2002-000289中公开的酸性磷 酸酶，而且可更优选地使用对核苷的亲和性增加的酸性磷酸酶(特开昭No. 10-201481)、核苷酸酶活性减少的突变体酸性磷酸酶(W096/37603)、磷酸酯 水解活性减少的突变体酸性磷酸酶(特开昭No. 2001-245676)等。
还可能通过将使用本发明的微生物产生的嘌呤核苷以化学方法进行磷酸 4匕来获4寻噪p令核苷酸(Bulletin of the Chemical Society of Japan, 42， 3505)。而且，还可以使用如下方法通过将本发明的具有产生XMP的能力的微生物和 使用微生物的ATP再生系统的XMP脱氨基酶(aminase)活性偶联来获得GMP 的方法，和通过偶联肌苷激酶来获得IMP的方法(Biosci. Biotech. Biochem.， 51, 840 (1997);特开昭No. 63-230094)。
通过本发明方法制备的用于前述嘌呤核苷酸制备的肌苷、鸟苷或嘌呤核 苷可为纯化的产物或嘌呤核普发酵液，或含有噤呤核苷的粗产物。
实施例
此后，将参考实施例更具体地说明本发明。
实施例1
<构建在编码嘌呤核苷磷酸化酶的； wpG和丄oD基因中有缺陷的细菌菌
林〉
如下所述，由重组菌抹KMBS310构建在。票呤核苷磷酸化酶基因(&oD) 中有缺陷的菌抹。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹，ATCC 6051)的KMBS310菌林(日本专利申请No. 2005-280186)在嘌呤操纵子阻抑物 基因(pw^)、琥珀酰-AMP合酶基因OwM)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(p甲G)中 有缺陷，并具有减弱的IMP脱氢酶基因(gwW)，其中对PRPP合成酶基因(pra) 的SD序列和噤呤操纵子启动子区进行修饰(日本专利申请No. 2005-280186)。 通过分别修饰启动子区和SD序列增强了 。票呤操纵子和PRPP合成酶基因的表 达。
将通过Fouet和Sonenshein的方法(J. Bacteriol.， 1990, 172, 835隱844)由 KMBS16菌抹(purR::spc purA::erm deoD::kan,特开昭No. 2004-2426IO)制备
1971, 56, 209-221)制备的枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹的感受态细胞，并获 得在含有5 pg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上生长的菌落。从获得的菌落中选 择未变成大观霉素抗性也不是红霉素抗性的菌落，并将它们之中的一个菌抹 命名为KMBS5 (deoD::kan)。
将通过Fouet和Sonenshein的方法(J. Bacteriol" 1990， 172, 835-844)由
(J. Mol. Biol.， 1971, 56, 209-221)制备的KMBS310菌抹的感受态细胞，并获得
22在含有5 pg/ml卡那霉素和20 jug/ml鸟噪呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从 如上所述获得的菌落中选择几个菌落，并将一个转化体命名为KMBS321，所 述转化体中可以证实用deoD::kan取代野生型cfeoZ)基因，且源自KMBS310 的所有突变未被野生型序列代替。
实施例2
<构建在编码果糖二磷酸酶的基因和编码转醛醇酶的ywy7/基因的任 一个或两者中有缺陷的细菌菌抹、其培养及评价> (1)制备_/^基因缺陷的菌抹
如下所述，由前述的重组菌林KMBS321构建在果糖二磷酸酶基因(/Z^) 中有缺陷的菌林。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168 Marburg菌株，ATCC 605 l)的KMBS321菌株在噤呤操纵子阻抑物基因(pwW)、琥珀酰-AMP合酶基
因(pM")和。票呤核苷磷酸化酶基因(p"pC7)中有缺陷，并具有减弱的IMP脱氢 酶基因(g^5)，其中对PRPP合成酶基因(pM)的SD序列和嘌呤操纵子启动子
区进行修饰。
(i) 通过PCR扩增上游区
基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC—000964和V01277)制备具有 如下核苷酸序列的28聚物(28-mer)和50聚物(50-mer) PCR引物。
TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA (SEQ ID NO: 19) cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA (SEQ ID NO: 20,以小写字母表示的核苷酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(c^)的 启动子上游区)
使用枯草芽孢杆菌168 Marburg菌林的染色体DNA作为模板和前述的引 物进行PCR (98。C 10秒、55。C 30秒、72°C 1.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有基因5，端区和大约1350 bp上 游区的扩增片段。
(ii) 通过PCR扩增下游区
基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC—000964和V01277)制备具有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)和27聚物(27-mer) PCR引物。
acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG (SEQ ID NO: 21，以小写字母表示的核苷酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(caf)的 结构基因的下游区)
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA (SEQ ID NO: 22)
使用枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹的染色体DNA作为模板和前述的引 物进行PCR(98。C 10秒、55。C 30秒、72°C 1.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有/Z)p基因3，端区和大约1770 bp下 游区的扩增片段。
(iii) 通过PCR扩增基因
基于基因数据库的信息(GenBank登录号VO1277和NC—000964)制备具有 如下核苦酸序列的50聚物(50-mer) PCR引物。
tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ ID NO: 23，以小写字母表示的核苷酸对应于y&p基因的5'端区的序列，且对它们进 行设计使其互补于SEQ ID NO: 20的3，端区)
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ ID NO: 24，以小写字母表示的核芬酸对应于^p基因的3'端区的序列，且对它们进 行设计使其互补于SEQ ID NO: 21的3'端区)
使用携带氯霉素抗性基因(ca/)的质粒pC194作为模板和前述的引物进行 PCR (98°C 10秒、55°C 30秒、72。C 1.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系 统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有cW基因的大约980 bp的扩增片段。
(iv) 通过重组PCR扩增包含插入有caf基因的/Z:，p区的片段
使用MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech)纯化上述(i) 至(iii)中扩增的DNA片段，然后将它们的混合物以适当的量用作模板，连同 SEQ ID NOS: 19和22的序列以进行PCR (98。C 10秒、55°C 30秒、72。C 4.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer),并由此获得包
含插入有基因的区的片段。
(v)制备#p破坏的产生肌苷的菌抹
将(iv)中获得的包含其中已插入cW基因的》p区的DNA片段(fbp::cat)进 行琼脂糖凝胶电泳，并从该凝胶提取目标片段。将如上所述纯化的DNA片段 用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J. Mol. Biol.， 1971, 56, 209-221)制备的枯草芽孢杆菌KMBS321菌抹的感受态细胞，并获得在含有 2.5吗/ml氯霉素和20吗/ml鸟。票呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从这些菌 落制备染色体DNA，通过(iv)所述的PCR方法鉴定如下菌抹，其中通过双重 组用其内部序列被氯霉素抗性基因代替的区(fbp::cat)代替染色体上的 区，并将这些菌抹中的一个命名为TABS 133。
(2)制备_yw_/7/基因缺陷的菌株
如下所述，由前述的重组菌抹KMBS321构建在转醛醇酶基因(yvvy/7)中有 缺陷的菌株。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹，ATCC 6051) 的KMBS32—1菌抹(日本专利申请No. 2005-280186)在噤呤操纵子阻抑物基因 (pwW )、琥珀酰-AMP合酶基因(p^4)和噪呤核苷磷酸化酶基因(pwpG)中有缺 陷，并具有减弱的IMP脱氢酶基因(gwaB),其中对PRPP合成酶基因(pra)的 SD序列和噤呤操纵子启动子区进行修饰，和嘌呤核苷磷酸化酶基因(&oD)中 有缺陷。
(i)通过PCR扩增jw///上游区
基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC—000964和V01277)制备具有 如下核苷酸序列的28聚物(28-mer)和50聚物(50-mer) PCR引物。
ATGGACGGAATCGAAATCTTAAAACGGA (SEQ ID NO: 25) cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC (SEQ ID NO: 26， 以小写字母表示的核苦酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(c^)的启动 子上游区)使用枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹的染色体DNA作为模板和前述的引 物进行PCR (98。C 10秒、55。C 30秒、72°C 1.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有j/v^/7/基因5，端区和大约1420 bp 上游区的扩增片段。
(ii) 通过PCR扩增ywy//下游区
基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC—000964和V01277)制备具有 如下核普酸序列的50聚物(50-mer)和28聚物(28-mer) PCR引物。
acagctccagatccatatcc加tTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG (SEQ ID NO: 27,以小写字母表示的核苷酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(caO的 结构基因的下游区)
GGATGACGTTATCGATAATGACTTCCTT (SEQ ID NO: 28)
使用枯草芽孢杆菌168 Marburg菌林的染色体DNA作为模板和前述的引 物进行PCR (98°C 10秒、55。C 30秒、72°C 1.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有yw/7/基因3'端区和大约1370 bp 下游区的扩增片段。
(iii) 通过PCR扩增基因
基于基因数据库的信息(GenBank登录号VO1277和NC—000964)制备具有 如下核苷酸序列的50聚物(50-mer) PCR引物。
gagaagcgaatgaattaggaattctAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ ID NO: 29，以小写字母表示的核苷酸对应于yuy7/基因的5'端区的序列，且对它 们进行设计使其互补于SEQ ID NO: 26的3，端区)
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ ID NO: 30,以小写字母表示的核苷酸对应于yvv/i/基因的3，端区的序列，且对它们进 行设计使其互补于SEQ ID NO: 27的3，端区)
使用携带氯霉素抗性基因(caO的质粒pC194作为模板和前述的引物进行PCR (98。C 10秒、55。C 30秒、72。C 1.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系 统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有c^基因的大约980 bp的扩增片段。
(iv) 通过重组PCR扩增包含插入有caf基因的区的片段
使用MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech)纯化上述(i) 至(iii)中扩增的DNA片段，然后将它们的混合物以适当的量用作模板，连同 SEQ ID NOS: 25和28的序列以进行PCR (98°C 10秒、55。C 30秒、72。C 4 分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)，并由此获得包 含插入有基因的yw7'//区的片段。
(v) 制备yw///破坏的产生肌苷的菌林
将(iv)中获得的包含其中已插入基因的ywy/f区的DNA片段(ywjH::cat) 进行琼脂糖凝胶电泳，并从该凝胶提取目标片段。将如上所述纯化的DNA片 段用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J. Mol. Biol.， 1971， 56， 209-221)制备的枯草芽孢杆菌KMBS321菌抹的感受态细胞，并获得在含有 2.5 pg/ml氯霉素和20 pg/ml鸟嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从这些菌 落制备染色体DNA,通过(iv)所述的PCR方法鉴定如下菌抹，其中通过双重 组用其内部序列被氯霉素抗性基因代替的ywj7/区(ywjH::cat)代替染色体上的 yw77/区，并将这些菌林中的一个命名为TABS135。
(3)构建#/ 和"vj7/双缺陷的菌抹
如下所述，由重组菌抹TABS133构建在转醛醇酶基因(ywj7/)中有缺陷的 菌林。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹，ATCC 6051)的 TABS 133菌抹在嘌呤操纵子阻抑物基因(pwW)、琥珀酰-AMP合酶基因(^w力、 嘌呤核苷磷酸化酶基因(pw; G)和果糖二磷酸酶基因(/Z，p)中有缺陷，并具有减 弱的IMP脱氬酶基因(gw^)，其中对PRPP合成酶基因(pra)的SD序列和噤呤 操纵子启动子区进行修饰。
①通过PCR扩增ywy//上游区
基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC—000964和M29725)制备具 有如下核苷酸序列的26聚物(26-mer)和50聚物(50-mer) PCR引物。TAAAGCGTGATAGACATACAGTGCTG (SEQ ID NO: 31) cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC (SEQ ID NO: 32 以小写字母表示的核苷酸对应于PDG1513中克隆的四环素抗性基因(tef)的启 动子上游区)
使用枯草芽孢杆菌168 Marburg菌林的染色体DNA作为模板和前述的引 物进行PCR(98。C 10秒、55。C30秒、72。C2.5分钟，30个循环，GeneAmp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有yw)/f基因5，端区和大约2250 bp 上游区的扩增片段。
(ii) 通过PCR扩增yw///下游区
基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC—000964和M29725)制备具 有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)和26聚物(26-mer) PCR引物。
gagagagttcaaaattgatcctttTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG (SEQ ID NO: 33，以小写字母表示的核普酸对应于pDG1513中克隆的四环素抗性基因O") 的结构基因的下游区)
TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA (SEQ ID NO: 34)
使用枯草芽孢杆菌168 Marburg菌抹的染色体DNA作为模板和前迷的亏1 物进行PCR (98°C 10秒、55°C 30秒、72。C 2.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有jwj^基因3'端区和大约2280 bp 下游区的扩增片段。
(iii) 通过PCR扩增W基因
基于基因数据库的信息(GenBank登录号M29725和NC—000964)制备具 有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer) PCR引物。
gagaagcgaatgaattaggaattctGCTTGGTGAAAAAAGTCTTGCAATG (SEQ ID NO: 35，以小写字母表示的核苷酸对应于j^/7/基因的5'端区的序列，且对它们进行设计使其互补于SEQ ID NO: 32的3'端区)
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC (SEQ ID NO: 36，以小写字母表示的核苷酸对应于y^7/基因的3，端区的序列，且对它们进 行设计使其互补于SEQ ID NO: 33的3，端区)
使用携带四环素抗性基因O0的质粒pDG1513作为模板和前述的引物进 行PCR (98。C 10秒、55。C 30秒、72。C 2.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR 系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有W基因的大约2070 bp的扩增片段。
(iv) 通过重组PCR扩增包含插入有时基因的_yviy7/区的片段
叶吏用MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech)纟屯J匕上述(i) 至(iii)中扩增的DNA片段，然后将它们的混合物以适当的量用作模板，连同 SEQ ID NOS: 31和34的序列以进行PCR (98。C 10秒、55°C 30秒、72。C 7 分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer),并由此获得包 含插入有W基因的；^/7/区的片段。
(v) 制备和jk^T/破坏的产生肌苷的菌抹
将(iv)中获得的包含其中已插入W基因的yw乂//区的DNA片段(ywjH::tet) 进行琼脂糖凝胶电泳，并从该凝胶提取目标片段。将如上所述纯化的DNA片 段用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J. Mol. Biol., 1971， 56， 209-221)制备的枯草芽孢杆菌TABS133菌株的感受态细胞，并获得在含有 12.5 pg/ml四环素和20吗/ml鸟噪呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从这些菌 落制备染色体DNA，通过(iv)所述的PCR方法鉴定如下菌抹，其中通过双重 组用其内部序列被四环素抗性基因代替的；^;7/区(ywjH::tet)代替染色体上的 ywy7/区，并将这些菌抹中的一个命名为TABS174。
(4)通过在^p基因和ywy/Z基因中的任一个或两者中有缺陷的产生肌苷 的菌林产生嘌呤核苷。
yZ^基因缺陷菌抹TABS133、 >^/7/基因缺陷菌抹TABS135、两基因缺陷 菌林TABS174和对照菌抹KMBS321各自均匀地涂布于含有20 mg/L鸟嘌呤 的LB培养基平板上，并在34。C培养过夜。将对应于平板的1/8的细胞接种入500-ml容积坂口烧瓶(Sakaguchi flask)中所含的20 ml发酵培养基中，然后 将50 g/L碳酸钩加入培养基，并在34°C摇动培养细胞。培养开始后72小时， 对培养基取样，并通过已知方法测量培养基中所含的肌苷和次黄嘌呤的量。 以基因缺陷菌株TABS 133和ywy//基因缺陷菌抹TABS 135观察到的积累 的肌苷量高于以KMBS321菌株作为对照菌抹观察到的肌苷量。此外，以在 两个基因均有缺陷的菌抹观察到的积累的肌苷量高于TABS133菌林或 TABS135菌林观察到的肌普量。
<formula>formula see original document page 30</formula>[序列表的说明]SEQ ID NO:1:ywy/7基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:2:转醛醇酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:pra基因的核普酸序列
SEQ ID NO:4:磷酸核糖焦磷酸合成酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:5:pm^基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:6:嘌呤阻抑物的氨基S臾序列
SEQ ID NO:7:^feoD基因的核香酸序列
SEQ ID NO:8:基因产物(噤呤核苷磷酸化酶)的氨基酸序列
SEQ ID NO:9:; wpG基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:10pwpG基因产物(。票呤核苷磷酸化酶)的氨基酸序列
SEQ ID NO:11; M"基因的核苷iW列
SEQ ID NO:12琥珀酰-AMP合酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:13gwW基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:14IMP脱氢酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:15yz^基因的核苷^列
SEQ ID NO:16果糖二磷酸酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:17用于，W基因扩增的引物
SEQ ID NO:18用于，W基因扩增的引物
SEQ ID NO:19用于yz^基因上游区扩增的引物
SEQ ID NO:20用于yz^基因上游区扩增的引物
SEQ ID NO:21用于#p基因下游区扩增的引物
SEQ ID NO:22用于_/^基因下游区扩增的引物
SEQ ID NO:23用于c^基因扩增的引物
SEQ ID NO:24用于c^基因扩增的引物
SEQ ID NO:25用于JMy7/基因上游区扩增的引物
SEQ ID NO:26用于yw乂//基因上游区扩增的引物
SEQ ID NO:27用于ywy/z基因下游区扩增的引物
SEQ ID NO:28用于yvvy/f基因下游区扩增的引物
SEQ ID NO:29用于CW基因扩增的引物SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
用于CW基因扩增的引物
用于_y>v///基因上游区扩增的引物 用于>^///基因上游区扩增的引物 用于；n^7f基因下游区扩增的引物 用于ywj7/基因下游区扩增的引物 用于？"基因扩增的引物 用于似基因扩增的引物
工业实用性
通过使用本发明的芽孢杆菌属细菌，可改进嘌呤核苷和/或嘌呤核苷酸的 生产效率。
权利要求
1. 属于芽孢杆菌属的细菌，其具有产生嘌呤衍生物质的能力，其中所述细菌已被修饰使得转醛醇酶的酶活性减少。
2. 根据权利要求1的属于芽孢杆菌属的细菌，其中所述噪呤衍生物质是 选自下组的一种或多种噪呤核苷肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。
3. 根据权利要求1的属于芽孢杆菌属的细菌，其中所述嘌呤衍生物质是 选自下组的一种或多种噤呤核普酸肌芬酸、黄普酸、鸟芬酸和腺苷酸。
4. 根据权利要求1至3中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌，其中通过破 坏编码转醛醇酶的基因或减少编码转醛醇酶的基因的表达量来减少所述转醛 醇酶活性。
5. 根据权利要求4的属于芽孢杆菌属的细菌，其中编码转醛醇酶的基因 是编码下列(A)或(B)的蛋白质的基因(A) 包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列的蛋白质，(B) 包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基 酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位并具有转醛醇酶活性。
6. 根据权利要求1至5中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一 步修饰使得果糖二磷酸酶活性减少。
7. 根据权利要求1至6中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一 步修饰使得磷酸核糖焦磷酸合成酶活性增加。
8. 根据权利要求1至7中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一 步修饰使得。票呤操纵子的表达量增加。
9. 根据权利要求8的属于芽孢杆菌属的细菌，其中通过破坏； w^基因 来增加嘌呤操纵子的表达量，所述，W基因是编码嘌呤操纵子的阻抑物的基 因。
10. 根据权利要求1至9中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进 一步修饰使得噤呤核苷磷酸化酶活性减少。
11. 根据权利要求1至10中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进 一步修饰使得IMP脱氢酶活性减少。
12. 根据权利要求1至11中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌，其为枯草 芽孢杆菌。
13. 产生。票呤衍生物质的方法，其包括在培养基中培养根据权利要求1至12中任一项的属于芽孢杆菌属的细菌 以在细菌的细胞或培养基中引起。票呤衍生物质的积累，和 从所述细胞或培养基中收集所述噪呤衍生物质。
14. 根据权利要求13的方法，其中所述嘌呤衍生物质是嘌呤核苷或嘌呤核苷酸。
15. 根据权利要求14的方法，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种 或多种噤呤核苷肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。
16. 根据权利要求14的方法，其中所述。票呤衍生物质是选自下组的一种 或多种。票呤核苷酸肌苷酸、黄普酸、鸟普酸和腺苷酸。
17. 产生嘌呤核苷酸的方法，其包括 通过根据权利要求15的方法产生噤呤核苷，将所述嘌呤核苷与磷酸盐供体，及微生物或酸性磷酸酶进行反应以产生 噤呤核芬酸，所述磷酸盐供体是选自下组的一种或多种聚磷酸、磷酸苯酯 和氨曱酰磷酸，所述微生物具有产生核苷-5'-磷酸酯的能力，和收集所述。票呤核苷酸。
全文摘要
嘌呤物质可如下生产在培养基中培养芽孢杆菌属的细菌，其能够产生嘌呤物质且具有减少的转醛醇酶的酶活性从而在培养基或细菌的细胞中产生并积累嘌呤物质，和从所述培养基或细胞中收集嘌呤物质。
文档编号C12P19/40GK101432418SQ20078001492
公开日2009年5月13日 申请日期2007年4月17日 优先权日2006年4月24日
发明者松野洁, 森由起子, 浅原贵之 申请人:味之素株式会社