酶融合蛋白及其应用的制作方法

专利名称：：酶融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及酶的技术，更准确来说涉及含有催化结构域和纤维素结合结构域的纤维素酶融合蛋白。融合蛋白可以通过重组技术使用也在本发明中涵盖的适合的多核苷酸、表达载体和宿主细胞来生产。融合蛋白及其酶制剂可用于处理纤维素材料，例如纺织材料。此外，融合蛋白可用于纸浆和造纸工业，从植物中提取油、洗涤剂组合物、或用于改进动物饲料的质量。因此，本发明还涉及使用融合蛋白处理纤维素材料的方法，特别是涉及织物和衣物、特别是粗斜纹布的生物石洗或生物精整的方法。本发明还涉及含有融合蛋白的洗涤剂组合物和动物饲料。
背景技术：
：纤维素是高等植物的主要结构成分，在自然状态下仅仅在棉纤维中以几乎纯的形式存在。它为植物细胞提供了高抗拉强度，帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素是葡萄糖残基通过/3-1，4-键连接的线性多糖。在自然界中，纤维素通常与木质素和半纤维素在一起。在自然界中，纤维素质材料由包括细菌和真菌在内的许多不同的生物降解。从纤维素到葡萄糖的生物转化一般需要三种主要类型的酶纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和/5-葡萄糖苷酶(BG)。纤维素酶具有广泛的工业应用范围。在纺织工业中，纤维素酶被用于粗斜纹布的精整，以在生物石洗过程中使粗斜纹布衣料产生流行的石洗外观。纤维素酶也用于例如清理棉制衣物上的绒毛和防止起球，在洗涤剂工业中纤维素酶被用于增亮颜色和防止衣物泛灰和起球。纤维素酶还可用于食品工业和动物饲料生产，并且它们在纸浆和造纸工业中也有极大的潜力，例如用于脱墨，使墨水从纤维表面释放出来，以及用于改进纸浆排水。工业上使用的纤维素酶通常是具有各种不同的活性和底物特异性的酶的混合物。商业化的酶制剂通常包含所有三种纤维素酶活性，即CBH、EG和BG。此外，每种纤维素酶的独特性质使得其中某些比其它的更适合特定的目的，因此，已经进行了尝试，以获得和使用仅具有所需活性的纤维素酶。使用最广泛的真菌来源的纤维素酶源自里氏木霉(7Wc/zodenna^eseZ)。但是，在例如US5,457,046中也建议了其它的真菌来源。用于粗斜纹布处理的纤维素酶通常被分成两个主要类别酸性和中性纤维素酶。酸性纤维素酶典型在pH4.0到5.5起作用，中性纤维素酶在pH6到8的范围内起作用。同时具有酸性和中性类别的性质的纤维素酶可以被称为混杂纤维素酶(hybridcellulase)。在生物石洗中使用的酸性纤维素酶主要源自里氏木霉(有性态为红褐肉座菌(/^/^creay'econ'"a))，中性纤维素酶来自各种不同的真菌，包括漆酶属(Afe/a"ocfl/7w)、腐殖霉属(/f"w/co/a)、毁丝霉属(、,廉ffe菌/萬(Fz^Yzn'w附)、丰支丁页f包霉属(Jcre附om.wm)和金孢属(C7zo^ospoWwm)(Haakana等，2004)。里氏木霉的酶包括例如来自糖基水解酶家族5(内切葡聚糖酶II，EGII)、家族7(纤维二糖水解酶I，CBHI)和家族12(内切葡聚糖酶III，EGIII;Ward等，1993)的纤维素酶，以及来自家族45和家族7的中性纤维素酶、最通常为内切葡聚糖酶(Henrissat，1991;Henrissat和Bairoch,1993，1996)。US5,874,293公开了改进的纤维素酶组合物，含有增加量的里氏木霉EGII内切葡聚糖酶，用于处理含有纤维素的纺织品。该组合物改进了颜色性质、增加了亮度和视觉外观，并减少了起球的倾向。WO97/14804公开了一个20kDa和一个50kDa的纤维素酶，来自漆酶物种(Me/朋oca^wsp.)，具有内切葡聚糖酶活性，它们在纺织和洗涤剂工业中特别有用。建议用含有与优选来自里氏木霉的纤维素结合结构域相连的20K或50K蛋白的融合蛋白产生新的酶性质。没有给出具体的例子，也没有描述所期望的性质。但是，对于在织物处理和传统上使用纤维素酶的其它领域中更加有效的改进的纤维素酶，包括内切葡聚糖酶，仍然存在着需求。特别是，对于改善工艺的经济性的更有效的纤维素酶，存在着持续的需求。本发明的目的在于满足这些需求。在纺织工业中，近年来"石洗"外观或磨损外观已经成为粗斜纹布生产商的兴趣所在。传统的使用浮石石洗降低了织物的强度并加重洗涤设备的负担。潮流已经趋向酶法粗斜纹布精整工艺，纤维素酶已经代替了浮石或正与浮石一起用于使织物获得所需的"磨损"外观。可控的酶法处理使得对衣物和机器的损伤降低了，并消除了处置石头的需要。与酶法石洗相关的普遍问题是在磨损过程中或之后，除掉的靛蓝染料再沉积引起的返染。靛蓝染料的再沉积降低了白色和靛蓝染色的纱线之间所需的对比度，并且它最容易在粗斜纹布的反面和口袋内面被注意到(显示为蓝色加深)。在正面上，这可以从染色的区域和生物石洗过程中除去染料的区域之间对比度降低而看出。通过在处理过程中使用抗返染剂例如非离子型乙氧化醇、或在漂洗步骤中加入漂白剂，可以减少返染。酶的性质对于返染有影响。一般来说，中性纤维素酶比酸性纤维素酶返染少。WO97/09410描述了将某种类型的纤维素酶加入到具有磨损活性的另一种纤维素酶中，降低了返染。加入的纤维素酶属于家族5或7，但是它本身没有显著的磨损效果。优选所述加入的纤维素酶源自芽孢杆菌属(5鎖.D或梭状芽胞杆菌属(C/齡W謂)。US5,916,799公开了含有纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的纤维素酶组合物，这两种酵已经进行了有限的蛋白水解，从而将酶的核心和结合结构域分开。发现得到的酶组合物降低返染。WO94/07983涉及这样一个发现，即在石洗过程中色料在织物上的再沉积可以通过使用真菌纤维素酶组合物来降低，该组合物基本上不含纤维二糖水解酶类型的组分。W096/23928公开了使用截短的纤维素酶处理含有纤维素的织物。截短的酶缺少纤维素结合结构域(CBD)，被发现能够减少染料的再沉积并增加磨损。上面引用的三个参考文献的普遍性结论在于，纤维素结合结构域对于返染有负面影响。因此，本发明现在提供了尽管存在纤维素结合结构域但仍具有低返染性质的纤维素酶构建物。发明概述本发明是基于令人吃惊的发现，即内切葡聚糖酶的作用可以通过将其与特定的纤维素结合结构域相连而显著增强，同时对返染性质没有损害o本发明的一个目的是提供具有改进的水解性质的新的内切葡聚糖酶融合蛋白，用于纺织工业，特别是粗斜纹布石洗。本发明的融合蛋白具有在酸性和中性pH值下都有活性的优点，并且它们在生物石洗应用中具有高度改进的性能。当用于粗斜纹布处理中时，融合蛋白提供了低的返染效果。由于本发明的内切葡聚糖酶具有改进的功效，使用这些酶显然更加经济。在物流和酶制品的储存方面也具有额外的优势，因为需要的酶制品的量更小。融合蛋白还可以用于洗涤剂组合物，以及其它领域例如食品工业、从植物提取油、或纸浆和造纸工业。本发明的另一个目的是提供编码新的内切葡聚糖酶融合蛋白的多核苷酸。本发明的再一个目的是提供生产融合蛋白的方法。本发明的再一个目的是提供含有该多核苷酸的新的表达载体，用于生产内切葡聚糖酶融合蛋白，以及用所述表达载体转化的新宿主。本发明的再一个目的是提供含有一种或多种新的内切葡聚糖酶融合蛋白的酶制剂。本发明的再一个目的是提供用融合蛋白处理纤维素材料的方法，用于例如纺织、洗涤剂、动物饲料、从植物提取油、或纸浆和造纸工业，特别是用于纺织品的精整，尤其是用于粗斜纹布的生物石洗和生物精整。本发明的另一个目的是提供含有融合蛋白的动物词料或洗涤剂组合物。本发明涉及纤维素酶融合蛋白，它含有第一个氨基酸序列的内切葡聚糖酶核心和第二个氨基酸序列，所述第二个氨基酸序列含有与SEQIDNO:15具有至少75%同一性的接头和纤维素结合结构域(CBD)，或其具有纤维素结合活性的变异体或片段。本发明还涉及分离的多核苷酸，它选自a)SEQIDNO:3或5的核苷酸序列，或编码权利要求1中的纤维素酶融合蛋白的序列，b)a)的互补链，c)由于遗传密码的原因而与序列a)或b)的任何一个简并的序列。本发明还涉及包含所述核苷酸序列的表达载体，和包含该表达载体的宿主细胞，以及含有融合蛋白的酶制剂。本发明还包涵生产融合蛋白的方法，包括的步骤如下用编码所述融合蛋白的表达载体转化宿主细胞，以及在能够表达所述融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收和纯化产生的融合蛋白。本发明还进一步包涵处理纤维素质材料的方法，其中所述方法包括将纤维素质材料与融合蛋白相接触。本发明还涉及生物石洗的方法，该方法包括将纤维素酶融合蛋白或酶制剂与粗斜纹布织物或衣物相接触的步骤，还涉及生物精整的方法，该方法包括将纤维素酶融合蛋白或酶制剂与纺织材料像织物或衣物或纱线相接触的步骤。最后，本发明涉及含有融合蛋白和洗涤辅助剂的洗漆剂组合物，涉及含有融合蛋白的动物饲料，并涉及具有登记号为E.co//DSM18159的大肠杆菌(E"/zn'c/n'flco")菌株。本发明的具体实施方案在从属权利要求中示出。本发明的其它目的、细节和优点从下面的附图、详细说明和实施例中将变得明显。附图简述图i显示了用于转化里氏木霉原生质体生产金黄色嗜热子囊菌(r.awmw"ac^)EG28或EG28+CtCBD纤维素酶的表达盒的示意图。ce/5A或ce/5A—Ctce/7A接头CBD基因在里氏木霉cMl启动子(cbhlprom)的控制之下，并通过加入cbhl终止子(cbhlterm)确保了转录的终止。包含amc/S基因(amdS)用于筛选转化子。用于EG28和EG28+CtCBD生产的表达盒被分别分离为来自pALK1930的8.6kb7VwI片段或来自pALK1948的8.9kb7VwI片段。图2显示了异源生产的金黄色嗜热子囊菌EG28纤维素酶的pH依赖性，通过从培养上清液使用CMC为底物、在50°C进行10分钟反应进行测定(A)。EG28纤维素酶的最适温度在最适pH(6.0)下测定。反应含有CMC作为底物，进行10分钟(B)。测得EG28+CtCBD融合蛋白的最适pH和最适温度与野生型EG28纤维素酶相同。图3显示了通过在不同温度和pH6下测量颜色而获得的EG28纤维素酶的生物石洗效果。图4显示了通过在不同pH值和50°C下测量颜色而获得的EG28+CtCBD纤维素酶的生物石洗效果。图5显示了通过在不同pH值和60°C下测量颜色而获得的EG28+CtCBD纤维素酶的生物石洗效果。图6显示了通过在不同温度下(pH6)测量颜色而获得的EG28+CtCBD纤维素酶的生物石洗效果。图7显示了造粒温度对添加了EG28纤维素酶的饲料的/5-葡聚糖酶活性回收的影响。图8显示了造粒温度对添加了EG28+CtCBD纤维素酶的饲料的纤维素酶活性回收的影响。发明具体说明纤维素酶含有表达纤维素酶活性的催化结构域/核心(CD)。除了催化结构域之外，纤维素酶分子可含有一个或多个"纤维素结合结构域"("CBD")，也称为碳水化合物结合结构域/模块(CBD/CBM)，它可以位于催化结构域的N-末端或C-末端。CBD具有碳水化合物结合活性，并且它们介导纤维素酶与结晶纤维素的结合，但是对于酶对可溶性底物的水解活性的效力很小或没有。这两个结构域通常通过柔性的和高度糖基化的接头区域相连，该接头区域在本文中称为"接头"。这样的结构在例如Srisodsuk等1993中有描述。某些天然存在的内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶具有纤维素结合结构域(CBD)，而其它则没有。内切葡聚糖酶(EG)是三种类型的纤维素酶中的一种，在将纤维素生物转化为葡萄糖中是通常所需的。内切葡聚糖酶切开内部/3-1,4-糖苷键，而纤维二糖水解酶从纤维素聚合物链的末端切下二糖纤维二糖，/3-1，4-葡萄糖苷酶将纤维二糖和其它短的纤维寡糖水解成葡萄糖。本发明涉及到的"内切葡聚糖酶"("EG")是指被分类为E.C.3.2丄4的酶。它们是1,4-Z3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，催化葡萄糖的聚合物例如纤维素中的1，4-Z3-D-糖苷键的内切水解。某些内切葡聚糖酶也可以水解例如还含有1，3-连接键的/3-D-葡聚糖中的1，4-连接键。因此它们也可以被分类为内切-1,3(4)-/3-葡聚糖酶(E.C.3.2丄6)。因此，酶可以催化对几种底物的反应，可以属于多个类别。包括内切葡聚糖酶的纤维素酶还可以根据它们的一级结构分类成各种不同的糖基水解酶家族，这得到了对该家族一些成员的三维结构分析的支持(Henrissat1991，Henrissat和Bairoch1993，1996)。例如，家族45(以前称为celK)包含内切葡聚糖酶(EC3.2丄4)，家族5(以前称为celA)主要由内切葡聚糖酶(EC3.2丄4)组成。家族7(以前称为纤维素酶家族celC)包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。某些糖基水解酶是多功能的酶，含有属于不同糖基水解酶家族的催化结构域。对于本发明的目的来说，融合蛋白的内切葡聚糖酶部分优选属于糖苷水解酶家族45或家族5，更优选为家族5。按照本发明的优选实施方案，融合蛋白的内切葡聚糖酶部分源自真菌，优选为嗜热子囊菌属(J7^rmowcw)，更优选源自金黄色嗜热子囊菌(rAemwa"/^做ra""ac^)。这样的内切葡聚糖酶已经被例如Hong等2003描述。WO03/062409建议将该酶用于饲料应用，因为除了内切葡聚糖酶活性外，它还具有/3-葡聚糖酶活性。最优选内切葡聚糖酶源自保藏为CBS116239的金黄色嗜热子囊菌菌株ALK04242。所述菌株的内切葡聚糖酶基因已经插入到质粒pALK1926中，并保藏为DSM17326。该基因编码的蛋白在本文中被称为"TaEG28"，或简称为"EG28"。或者，融合蛋白的内切葡聚糖酶部分可以从枝顶孢霉属获得，优选从嗜热枝顶孢霉(AAw附op/u7wm)获得，更优选从具有保藏为CBS116240的菌株ALK04245的特征的菌株获得。可从该菌株获得并由基因"/45A编码的内切葡聚糖酶在本文中被称为"AtEG40"，或简称为"EG40"。本文中使用的内切葡聚糖酶"核心"是指至少表现出内切葡聚糖酶活性的酶的催化结构域/核心(CD)。这样的催化结构域可以是其天然存在的形式(即完整的)，或者它可以被修饰。根据本发明的一个实施方案，内切葡聚糖酶核心与SEQIDNO:2(TaEG28)具有至少75、80、85、90、95、98或99%的同一性。优选核心至少包含对应于SEQIDNO:2的19位到334位氨基酸的成熟蛋白。使用程序SignalPV3.0(Nielsen等，1997，Bendtsen等2004)进行信号序列的预测；使用神经网络和HMM值，采用隐马尔可夫模型(hiddenMarkovmodels)获得NN值。或者，融合蛋白的内切葡聚糖酶部分与SEQIDNO:8中包含的多核苷酸编码的AtEG40内切葡聚糖酶核心具有至少75、80、85、90、95、98或99%的同一性。优选核心至少包含对应于EG40的22位到297位氨基酸的成熟蛋白。本文中使用的"纤维二糖水解酶"或"CBH"是指从葡萄糖链的末端裂解纤维素并且主要产生纤维二糖的酶。它们也被称为l，4-/3-D-葡聚糖纤维二糖水解酶或纤维素1，4-/3-纤维二糖糖苷酶。它们从含有1,4-Z3-D-糖苷键的聚合物例如纤维素的还原或非还原端水解所述键，并由此释放出纤维二糖。包含接头的CBD优选源自嗜热毛壳菌(C/zae/07m'wmAe/7膨p/u7wm)，特别是源自保藏为CBS730.95的菌株ALK04265的纤维二糖水解酶(CBHI/Cel7A)编码基因。该包含接头的CBD被称为"CtCBD"。根据本发明的优选实施方案，接头加纤维素结合结构域具有的序列与SEQIDNO:15(对应于SEQIDNO:4中的335-415位氨基酸)有至少80、85、90、95、98或99%的同一性。根据另一个优选实施方案，第二个氨基酸序列含有SEQIDNO:4的335-379位氨基酸。术语"源自"与微生物源结合时，是指多肽可以被所述特定的微生物源天然产生，或者可以从所述微生物源分离编码多肽的多核苷酸，或者该术语是指宿主细胞，其中已经导入了来自所述微生物源的编码多肽的多核苷酸。但是，它不排除对序列的少量修饰，例如取代、缺失、倒位和/或插入一个或几个氨基酸/密码子，只要被编码的蛋白的生物活性仍然保留就行。核心和接头/CBD也可以分别是所述序列的片段或变异体，其中所述片段或变异体具有纤维素酶活性和/或纤维素结合活性。例如第一个氨基酸序列可以包含与SEQIDNO:2或8具有至少75%同一性的氨基酸序列的片段或变异体，第二个氨基酸序列可以包含与SEQIDNO:15具有至少75%同一性的氨基酸序列的片段或变异体。在本文中，"纤维素酶活性"是指水解纤维素或其衍生物的催化能力，例如内切葡聚糖酶或/3-葡聚糖酶活性。除了内切葡聚糖酶和/或/3-葡聚糖酶活性之外，某些纤维素酶还可以具有半纤维素酶和/或木聚糖酶活性。当用于本文中时，术语"同一性"指两个氨基酸序列从相应的基因编码的第一个氨基酸到最后一个氨基酸进行彼此比较时的整体同一性。全长序列的同一性通过使用EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套装(EuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite);Rice等，2000)软件包3.0.0版中的Needleman-Wimsch整体比对程序进行测定，使用下面的参数EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，扩展罚分0.5。该算法在Needleman和Wunsch(1970)中被描述。本
技术领域：
的专业人员将会认识到这样的事实使用Needleman-Wunsch算法的结果只有在对序列的相应结构域进行比对时才具有可比性。因此，进行例如含有CBD或信号序列的纤维素酶序列与缺乏这些元件的序列的比较是不包括在内的，因为没有意义。根据本发明的一个实施方案，融合蛋白含有与大肠杆菌DSM17326中包含的基因相等价的基因编码的内切葡聚糖酶核心。优选编码融合蛋白的融合基因等价于包含在大肠杆菌DSM18159中的融合基因。本文中使用的"等价"是指基本上类似或类似。根据本发明的具体的实施方案，融合蛋白含有包含SEQIDNO:2的序列的内切葡聚糖酶核心、包含SEQIDNO:15的序列的接头和CBD。特别是，它包含SEQIDNO:4或6的氨基酸序列，或其具有纤维素酶和纤维素结合活性的变异体或片段。"片段"被理解为是特定氨基酸序列的部分，其长度足以具有所需的生物学活性。换句话说，片段可以例如仅仅是氨基酸序列的成熟部分或甚至是成熟部分的子序列。氨基酸序列是特定氨基酸序列的"变异体"，是指该氨基酸序列与该特定的氨基酸序列不一致，而是含有至少一些氨基酸的变化，即缺失、取代、到位、插入等，但当用于所需的目的时，与特定氨基酸序列的相似活性相比，这些变化基本上不影响蛋白的生物学活性。在本发明中，生物学活性是指纤维素酶活性、纤维素结合活性，或同时指两者。本发明的融合蛋白可以使用熟知的用于生产所需重组蛋白的重组DNA技术，将内切葡聚糖酶核心部分与适当的编码DNA中的接头和CBD部分连接起来而制备。简单来说，将编码融合配偶体的多核苷酸进行扩增和克隆，也可以合成核苷酸。将融合的多核苷酸插入到表达载体中，转化到宿主细胞中并表达。优选接头和CBD连接在内切葡聚糖酶核心的C-端。"表达载体"是克隆质粒或载体，在转化到所需宿主中后能够表达编码内切葡聚糖酶融合蛋白的DNA。当使用真菌宿主时，优选将目的基因作为整合到真菌染色体中的克隆或表达载体的部分、或使目的基因整合到宿主染色体中的克隆或表达载体的部分而提供给真菌宿主。在整合过程中，其它作为克隆载体或表达载体的部分的序列也可以与所述DNA整合。此外，在真菌中，表达载体或其部分可以耙定在预定的基因座。或者，所需的融合基因作为自主复制的质粒提供。编码内切葡聚糖酶融合蛋白的DNA优选置于载体提供的某些控制序列例如启动子序列的控制之下(即与它们可操作地连接)。在转化后，这些控制序列与目的基因一起整合到宿主基因组中。或者，控制序列也可以是位于整合位点处的控制序列。表达载体的表达控制序列根据载体是被设计用于在原核宿主还是在真核宿主中表达某个基因而变化(例如，穿梭载体可以提供在细菌宿主中的筛选基因)。表达控制序列可以含有转录调控元件例如启动子、增强子元件，以及转录终止序列和/或翻译调控元件，例如翻译起始和终止位点。多核苷酸分子，例如DNA，如果它含有的表达控制序列含有转录调控信息，并且所述序列与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接，那么它被说成是能够表达多肽。可操作的连接是这样的连接，其中序列与调控序列的连接方式使得将序列的表达置于调控序列的影响或控制之下。两个DNA序列(例如启动子区序列连接到蛋白编码序列的5'-末端)，如果启动子的功能导致了转录，就被称为是可操作地连接的。本发明的载体还可以含有其它的可操作地连接的调控元件，例如增强子序列。在优选的实施方案中，构建了遗传稳定的转化子，由此通过用载体转化将编码融合蛋白的DNA整合到宿主染色体中，该载体包藏有促进所述载体整合到染色体中的序列。已将编码内切葡聚糖酶融合蛋白的DNA稳定整合到其染色体中的细胞，可以通过例如导入同源或异源的标记物来进行筛选，该标记物可以选出在染色体中含有表达载体的宿主细胞，例如标记物可以提供杀生物剂抗性，例如对抗生素，或重金属例如铜的抗性，或者标记物与宿主染色体中的营养缺陷突变互补，等等。选择性标记物可以是例如与将被表达的DNA基因序列直接连接的选择基因，或是通过共转化导入到同样的细胞中的选择基因。也可以使用其它的选择系统。一旦制备了含有编码融合蛋白的DNA的表达载体，可以通过各种不同的适方法中的任何一种将其导入合适的宿主细胞，这包括在本
技术领域：
中所知的转化。在转化之后，受体细胞在合适的选择培养基中生长，该培养基选择转化细胞的生长。适合的表达和生产宿主系统是例如为真菌宿主建立的生产系统木霉(EP244234)，或曲霉(J^ergz'〃w)例如米曲霉(Aoo^zae)或黑曲霉(A&ger)(WO97/08325和WO95/33386，美国专利No.5,843,745，美国专利No.5,770,418)，或为镰孢菌例如尖镰孢菌(F.oxy印wwn)开发的生产系统(Malardier等，1989)。为细菌建立的适合的生产系统包括为芽孢杆菌例如枯草芽孢杆菌(Aw/^'fc)、地衣芽孢杆菌(及Z/c/2e,":/bm^)、淀粉液化芽孢杆菌(及flmy/o/~"e/ac/e"s)或为大肠杆菌、或为放线菌链霉菌(5V"^o附ycM)建立的生产系统。为酵母建立的适合的生产系统是为酵母菌属(Sacc/mromycM)、裂殖酵母属(^S7"'zoMcc/wra附3/cey)或巴斯德毕赤氏酵母(尸/c/n'a/7"Won;)建立的系统。在其它的微生物或哺乳动物细胞或植物中的生产系统也是可能的。克隆的基因序列的表达导致了所需蛋白的生产，或该蛋白的片段的生产。这种表达可以在转化细胞中以连续的方式发生，或以受控的方式发生。为了获得本发明的酶制剂，将具有所需性质的宿主(即能够经济表达适宜量的内切葡聚糖酶融合蛋白的宿主)在适当的条件下进行培养，所需的酶优选从宿主分泌到培养基中，并任选从所述培养基中通过本
技术领域：
已知的方法回收。用于该生产的宿主优选是丝状真菌，例如木霉或曲霉，特别是里氏木霉。本文中使用的"酶制剂"是指任何含有至少一种本发明的内切葡聚糖酶融合蛋白的酶产品。因此，这样的酶制剂可以是用过的培养基或滤液。用过的培养基是指含有产生的酶的宿主培养基。优选在生产之后将宿主细胞从所述培养基中分离出来。如果需要，这样的制剂可以被冷冻干燥，或以其它方式将酶活性浓縮和/或稳定化以便储存。如果需要，所需的酶可依照常规的方法进一步纯化，例如抽提、沉淀、层析、亲和层析、电泳等。但是，本发明的优势是带有或不带有宿主细胞的培养基可以不用进一步纯化直接用作酶制剂，因为内切葡聚糖酶融合蛋白可以分泌到培养基中，并且它们在用过的培养基的环境条件下显示出活性。酶制剂可以非常经济地提供和使用，因为不必要从培养基中分离具体的酶。除了内切葡聚糖酶融合蛋白之外，酶制剂还可以含有一种或多种其它的酶，它们可以是例如其它的纤维素酶、淀粉酶、脂酶、蛋白酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和/或氧化酶，例如漆酶和过氧化物酶。或者，在使用内切葡聚糖酶融合蛋白进行处理之前、之中或之后，可以进行另一种酶的处理。酶处理可以包括例如一种或多种淀粉酶处理(例如用于粗斜纹布的脱浆)、一种或多种纤维素酶处理和/或一种或多种过氧化物酶和/或漆酶处理。这取决于哪些其它酶被包含在酶制剂中或用于酶处理的应用。除了融合蛋白之外，酶制剂还可以含有添加剂，例如稳定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基成分。优选的添加剂是在使用酶制剂的应用中，为所述应用准备的该酶制剂中通常使用的添加剂。酶制剂可以被提供为液体或固体，例如为干粉或颗粒，特别是无粉尘颗粒，或稳定化的液体。可以设想酶制剂被进一步富集，或使特定的酶活性部分或完全缺失，以便满足在各种应用例如在纺织工业中特定应用的需求。在具体的工业应用例如生物精整和生物石洗中，宿主分泌的酶活性的混合物可能是有优势的。内切葡聚糖酶融合蛋白及其制剂可用于例如纺织、伺料、植物油、洗涤剂以及纸浆和造纸工业。它们可用于处理任何纤维素材料，例如紡织原料、用于动物饲料的的植物、用于提取油的植物材料、或源自木头的机械或化学纸浆或二次纤维。它们也可以添加到洗涤剂中，洗涤剂中通常含有辅助剂，例如表面活化剂、表面活性剂、漂白剂和/或增洁剂。在本文中，"纤维素材料"是指任何含有纤维素或其衍生物作为重要成分的材料。在适当条件例如合适的pH和温度下，将纤维素质材料与有效量的融合蛋白相接触，并允许反应持续足以使酶反应发生的时间。融合酶在纺织材料例如织物和衣物的处理中特别有用。纺织材料可以由含有天然纤维素的纤维或含有人造纤维素的纤维或其混合物、或合成纤维和含有纤维素的纤维的掺合物制成。优选含有纤维素的材料是棉布，特别是粗斜纹布。在本发明中，"粗斜纹布"是指粗斜纹布织物，通常是粗斜纹布衣物，特别是牛仔裤。有优势的是，粗斜纹布是靛蓝染色的粗斜纹布。粗斜纹布也可以用靛蓝的衍生物处理，或用靛蓝与一些其它染料一起处理，例如例如具有硫磺色底色的靛蓝染色的粗斜纹布。融合的内切葡聚糖酶在纺织品的生物石洗和生物精整中特别有用。石洗有三个步骤脱浆、磨损和后处理。第一个步骤，脱浆工艺，一般是牛仔裤的第一次湿法处理，是指除去通常加在经纱上用于在编织过程中防止损坏的淀粉或其它上浆剂。为了改进的和均匀的湿法处理，a-淀粉酶被用于除去基于淀粉的上桨剂。脱浆后牛仔裤一般用水漂洗或继续直接进行磨损步骤。第二个步骤，磨损，可以使用酶或浮石或二者进行。在所有情况下都需要机械作用来除去染料，处理通常在洗衣机例如滚筒式洗衣机中进行。术语"磨损的"是指粗斜纹布在被纤维素酶或石头或二者处理后的外观。同义的表述是"石洗外观"或"磨损外观"。由于染料被不均匀除去，在染色区域和染料已经被除去的区域之间具有反差。磨损后通常进行第三个步骤，后处理，包括清洗和漂洗步骤，在此期间可以使用洗涤剂、任选的增亮剂、漂白剂或柔顺剂。在酶法处理后，反应必须被终止，以便防止被处理的材料的损坏，可以通过例如温度和/或pH失活，后者包含彻底的漂洗和/或洗涤剂洗脱。这确保了纤维的机械强度不被酶的继续存在所进一步损害。在本文中使用的表述织物或衣物的"生物石洗"是指使用酶代替浮石或与浮石一起用于处理织物或衣物，特别是粗斜纹布。如上所述，用纤维素酶处理可以完全取代用浮石处理(例如1kg商业化酶对100kg石头)。但是，当需要产生重度磨损的修饰的时候，纤维素酶处理也可以与浮石处理相结合。其中产生突出的细毛样表层的桃皮效果也通过用浮石结合中性纤维素酶清洗来达到。所述的融合蛋白特别适用于在生物石洗中有效提供磨损外观并使返染最小化。生物石洗一般在大约pH3.0-8.0下进行，优选在pH5.0-7.0下进行。反应的温度范围可以从大约30。C到80。C，优选在50-60。C之间。液体比例(单位重量织物的液体体积的比率)可以在3:1至l」20:l的范围内，优选为5:1到10:1。处理时间可以在15分钟到90分钟之间的范围内，优选为30到60分钟。应该强调的是酶剂量非常依赖织物、机器、加工条件(pH、温度、浴比、处理时间、粗斜纹布载量、加工规模)的类型以及酶制剂的类型等。如果需要，浮石可以与内切葡聚糖酶融合蛋白组合使用。这将显著地减少需要的酶剂量。本领域的专业技术人员能够确定适合的剂量和条件。本发明的内切葡聚糖酶融合蛋白提供了未曾预料到的优点，其中酶的性能高，返染低，产生了非常好的反差。此外，融合蛋白易于生产，它们而可以在相对宽的温度和pH范围内使用。此外，内切葡聚糖酶融合蛋白可用于织物和衣物的生物精整。"生物精整(biofmishing)"是指酶在纤维素纤维的受控水解中的应用，以便修饰织物或纱线表面，从而永久防止起球、改善织物的触感例如柔软度和光滑性、通过减少细毛来清理表面结构导致颜色的清晰、改善织物的悬垂性、改善吸水性并且这样可以改善可染性。酶法去起球可以在织物湿法加工过程中的任何阶段进行，优选在任选的脱浆和/或漂白后进行，可以使用与生物石洗中相似的条件。还具有|3-葡聚糖酶、半纤维素酶或木聚糖酶活性的内切葡聚糖酶融合蛋白还可以通过用酶处理植物材料用于改进动物饲料的质量。淀粉、蛋白和脂类容易被单胃动物例如家禽和猪的消化系统降解，但是大部分非淀粉类多糖(NSP)，包括例如大麦和燕麦的混合链^葡聚糖，由于在动物内缺乏这样的酶活性而保持完整。此外，其它成分、特别是基于动物的脂肪的可消化性，在NSP存在下降低。/3-葡聚糖酶在商业上已经被用于减轻由大麦和燕麦的混合链/3-葡聚糖引起的问题。已知/3-葡聚糖酶减少由可溶性/3-葡聚糖引起的肠粘度，并释放由富含/3-葡聚糖的细胞壁所包裹的养分。使用/3-葡聚糖酶改进动物的情况，这可以通过增重和饲料转化率的提高看出。此外，在家禽中通常降低了粘性便的发生率。蒸汽造粒是全世界的主要饲料加工技术。它超过碎饲料的优点包括更易操作，减少了有毒的物质和生物体，以及最重要的是提高了饲料的效率。本文描述的融合蛋白的耐热性和高性能使它们适合饲料应用。下面的非限制性的实施例对本发明进行了说明。但是应该理解的是，在上面的说明和下面的实施例中给出的实施方案仅用于说明目的，在本发明的范围内进行各种不同的改变和修饰是可能的。实施例1、在里氏木霉中生产金黄色嗜热子囊菌ALK04242EG28纤维素酶标准的分子生物学方法用于DNA(质粒、DNA片段)的分离和酶处理、用于大肠杆菌转化等。使用的基本方法描述在标准的分子生物学手册中，例如Sambrook等(1989)和Sambrook与Russell(2001)。编码EG28纤维素酶(SEQIDNO:2)的金黄色嗜热子囊菌ce/5A基因(SEQIDNO:1)通过PCR直接从金黄色嗜热子囊菌ALK04242基因组DNA扩增，该基因组DNA通过Raeder和Broda(1985)的方法分离。根据发表的金黄色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶序列(AF487830)设计正向(SEQIDNO:9)和反向(SEQIDNO:IO)引物。将扩增的含有精确的基因(从起始(START)到终止(STOP)密码子)的1.3kb产物作为SacII-/^I片段克隆到pBluescriptIIKS+载体中。对两个独立的克隆进行测序，选出1个克隆并命名为pALK1926。含有pALK1926的大肠杆菌菌株在德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHculturecollection)的保藏号为DSM17326。构建了表达质粒(pALK1930，图l)用于生产重组的金黄色嗜热子囊菌纤维素酶EG28/Cel5A(SEQIDNO:2)。通过PCR将包括自身信号序列的ce/5A基因与里氏木霉cM7(ce/7A)启动子准确地融合。如Paloheimo等(2003)所述，包含了启动子、cM/终止子和awt/S标记物基因。通过限制性酶消化从载体骨架上分离了线性基因表达盒(图1)，转化到里氏木霉A96中，使用乙酰胺作为唯一氮源筛选转化体。宿主菌株缺少四种主要的内源性纤维素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGl/Cel7B和EGII/Cel5A。转化按照Penttila等(1987)采用Karhunen等(1993)中描述的修改方法来进行。转化体在选择性平板上通过单一分生孢子进行纯化，然后将它们在PD上形成孢子。从摇瓶培养的培养上清液(50ml)分析转化体的纤维素酶生产。转化体在复合的纤维素诱导的培养基(Joutsjoki等，1993)中生长7天，该培养基用pH5.5的5。/。KH2P04缓冲。培养上清液中重组蛋白的酶活性测定基本上按照Bailey禾nNevalainen1981以及Haakana等2004的描述，测定为50。C下在pH4.8的50mM柠檬酸缓冲液中从羧甲基纤维素(2%CMC)释出的还原糖。通过按照Stalbrand等1993的描述，50。C下在pH4.8的50mM乙酸盐缓冲液中测量还原糖的释出，还测定了对大麦/3-葡聚糖(1%)的活性。还通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测了培养上清液中重组蛋白的生产。使用表达盒作为探针，通过Southern印迹分析了选出的转化体的基因型。在pH范围为4.0到8.0的通用Mcllvaine缓冲液中，使用羧甲基纤维素作为底物测定了异源生产的TaEG28/Cel5A纤维素酶的最适pH。如图2A所示，EG28/Cel5A纤维素酶活性的最适pH是pH6.0。EG28/Cel5A纤维素酶酶活性的最适温度测定为75°C(图2B)。将选择的转化体(RF6188)在生物反应器中进行培养，获得用于应用试验(参见实施例4)的材料。实施例2、重组金黄色嗜热子囊菌ALK04242EG28+CtCBD融合蛋白的生产为了生产重组金黄色嗜热子囊菌EG28/CtCBD融合蛋白(SEQIDNO:4)，将嗜热毛壳菌ALK04265的CBHI/Cel7A纤维素酶的纤维素结合结构域(CBD)连接到EG28/Cel5A纤维素酶上。构建物包含的EG28的催化结构域(全长多肽的1-334位氨基酸)与嗜热毛壳菌CBHI/Cel7A的接头区和CBD连接CtCBD(SEQIDNO:15)。按照实施例1中的描述使用标准的分子生物学方法。首先，通过PCR在EG28/Cel5A序列的C-末端附近引入独特的S冊BI限制性位点。这使得可以在EG28/Cel5A多肽的氨基酸Y334之后直接融合任何平端的DNA。通过PCR，使用正向(SEQIDNO:11)和反向引物(SEQIDNO:12)，以嗜热毛壳菌ALK04265的基因组DNA作为模板，扩增了嗜热毛壳菌CBHI/Cel7A接头和CBD区的编码基因(Ce/7A，SEQIDNO:7)。将扩增到的1.6kb产物连接到ce/5A基因中(在Y334之后)，产生Tace/5A—Ctce/7A接头CBD(SEQIDNO:3)。得到的质粒被命名为pALK1946。含有pALK1946的大肠杆菌菌株在德国微生物菌种保藏中心的保藏号为DSM18159。按照实施例1中的描述构建了生产EG28+CtCBD纤维素酶的表达质粒(pALK1948，图1)。通过WwI限制性酶消化，从载体骨架上分离了线性的8.9kb表达盒(图1)，转化到里氏木霉A33中(该菌株已经缺失了编码四种主要的纤维素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A的基因)，按照实施例1中的描述筛选转化体。测定出融合蛋白的最适pH和温度与野生型EG28蛋白相同。将选出的转化体(RF6377)在生物反应器中进行培养，获得用于应用试验(参见实施例5到10)的材料。实施例3、重组嗜热枝顶孢菌ALK04245EG40+CtCBD融合蛋白的生产为了生产重组嗜热枝顶孢菌ALK04245EG40+CtCBD融合蛋白(SEQIDN0:6)，将EG40纤维素酶的纤维素结合结构域用嗜热毛壳菌ALK04265CBHI/Cel7A的纤维素结合结构域代替。构建物含有的EG40纤维素酶的催化结构域(全长多肽的1-234位氨基酸)与嗜热毛壳菌CBHI/Cel7A的接头区和CBD连接(CtCBD，SEQIDNO:15)。按照实施例1中的描述使用了标准分子生物学方法。使用引物(SEQSDNO:13)和(SEQSDNO:14)，通过PCR从嗜热枝顶孢菌ALK04245基因组DNA扩增了嗜热枝顶孢菌ce/45A基因(SEQIDNO:8)。将1.1kb的PCR片段作为片段克隆到pBIuescriptIIKS+载体中。然后通过PCR在EG40序列的C-末端附近引入独特的拾"I限制性位点。这使得可以在EG40多肽的氨基酸S234之后直接融合任何平末端的DNA。按照实施例2中的描述，通过PCR扩增嗜热毛壳菌的CBHI/Cel7A纤维素酶的接头加CBD区(Ce/7A)，并将其限制性片段连接到ce/45A基因中(在S234之后)，产生Atce/45A_Ctce/7A接头CBD(SEQIDNO:5)。构建了生产EG40+CtCBD纤维素酶的表达质粒，按照实施例1中的描述在木霉中生产重组蛋白(SEQIDNO:6)。实施例4、EG28纤维素酶在不同温度下的粗斜纹布精整中的性能测试了实施例1中描述的木霉(菌株RF6188)生产的金黄色嗜热子囊菌EG28纤维素酶在不同温度下的粗斜纹布生物石洗中产生磨损外观的能力与浮石提供的相似。使用了一种有效的粗斜纹布精整酶——在木霉中生产的商业化的富含EGII的酸性纤维素酶制剂(US.5,874,293)作为参比。用靛蓝染色的粗斜纹布制成的牛仔裤在用ECOSTONEA200a-淀粉酶脱浆后用作试验材料。纤维素酶处理使用伊莱克斯(Electrolux)的WascatorFOM71CLS洗涤脱水机在表1描述的条件下进行。使用的酶制剂的内切葡聚糖酶活性(ECU)按照以前的描述(Bailey和Nevalainen，1981)测定为从羟乙基纤维素释出的还原糖。富含EGII的酶浓縮液和EG28制剂的剂量分别为220ECU/g和大约380ECU/g。酶在它们的最适pH范围内进行测试，EGII制剂在pH5下，EG28制剂在pH6下。排水后，用氢氧化钠将pH升高到11以上使酶失活(在40。C进行IO分钟)。然后将牛仔裤用水漂洗三次，并在干衣机中干燥。通过用MinoltaCM2500分光光度计，使用L承a吓举色彩空间坐标(光源D65/2。)测量颜色的反射率值来评估生物石洗效果/磨损水平。在脱浆后(即纤维素酶处理之前)和纤维素酶处理之后，测量粗斜纹布的正面和反面以及口袋的颜色。正面、反面或口袋的每个测量值分别是大约40、20或12个测量值的平均值。每个试验中使用两条牛仔裤，最终的结果是其平均值。结果显示在表2和图3中。表l、在纤维素酶处理中使用的试验条件/加工参数加工参数粗斜纹布载量1.3公斤水19升pH控制(pH5-5.3)pH控制(pH6.1-6.3)35gNa2HP042H20+22g柠檬酸35.5gNa2HP042H20+15g柠檬酸时间45分钟温度40、50、60或70oC纤维素酶剂量220或大约380ECU/g织物表2、在不同温度下用EG28纤维素酶处理的粗斜纹布的颜色测量富含EGII的制剂进行的处理用作参比。！^表示亮度，-"是蓝色方向，+"是黄色方向。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表2和图3中的结果显示出使用EG28制剂(菌株RF6188)的最好磨损效果是在50到70°C的范围内获得的。使用剂量为380ECU/g织物的EG28制剂在70°C时与使用剂量为220ECU/g织物的富含EGII的制剂在60。C时相比，获得了相似的磨损水平(亮度L"。但是，与使用富含EGII的制剂相比，使用EG28制剂对粗斜纹布的反面和口袋的返染效应(靛蓝染料的再沉积)较低(亮度更高，蓝色更少)。在粗斜纹布正面上的反差也看起来更好。实施例5、在粗斜纹布精整中EG28+CtCBD融合蛋白与EG28纤维素酶的性能比较在pH6、60°C的粗斜纹布生物石洗中，对实施例2描述的在木霉(菌株RF6377)中生产的重组金黄色嗜热子囊菌EG28+CtCBD融合蛋白和来自菌株RF6188的EG28制剂进行比较。用于生物石洗的粗斜纹布和试验系统与实施例4中相同，只是粗斜纹布的量被提高到1430g，并带有额外的没有包含在测量中的不同粗斜纹布片。纤维素酶处理的效果按照实施例4评估。表3中的结果显示出在低剂量下EG28+CtCBD制剂的生物石洗效果非常好。与RF6188相比，使用低6.5倍剂量的菌株RF6377就获得了相似的磨损水平(亮度L"。将纤维素结合结构域(CBD)与EG28纤维素酶连接没有增加不想要的返染效果，而是极大地增加了所需的洗涤性能。表3、在60°C和pH6下用EG28和EG28+CtCBD纤维素酶处理的粗斜纹布的颜色测量L^表示亮度，-M是蓝色方向，+13*是黄色方向。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例6、在粗斜纹布精整中EG28+CtCBD纤维素酶与EGII纤维素酶的性能比较在粗斜纹布的生物石洗中，对木霉(菌株RF6377)中生产的重组金黄色嗜热子囊菌EG28+CtCBD融合蛋白和商业化的富含EGII的酸性纤维素酶制剂(US.5,874,293)进行了比较。生物石洗的试验系统与实施例4相同，只是使用了来自UkosSport(比利时)和Vicunha(巴西)的几种不同粗斜纹布类型的布片(裤腿)(总共1.2kg)。EG28+CtCBD和EGII处理的条件如表4所示。纤维素酶处理的效果按照实施例4评估。使用四种不同的粗斜纹布织物进行的实验结果显示在表4和5中。使用酶剂量为500ECU/g织物的EG28+CtCBD制剂，与使用剂量为1000ECU/g织物的富含EGII的制剂相比，获得了相似的亮度水平。EG28+CtCBD制剂的性能大约仅需要富含EGII的纤维素酶的一半ECU活性。在生物石洗中，重组宿主产生的EG28+CtCBD的培养基在体积上也大约是产生EGII的重组宿主的培养基效率的两倍。当使用EG28+CtCBD制剂时，在粗斜纹布的反面观察到的明显少的返染。EG28+CtCBD制剂在50。C的性能在pH6下比pH5下更好。表4、在pH5和6下用EG28+CtCBD纤维素酶处理的粗斜纹布正面的颜色测量。用富含EGII的制剂进行的处理用作比较。y表示亮度，-M是蓝色方向，+"是黄色方向。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表5、在pH5和6下用EG28+CtCBD纤维素酶处理的粗斜纹布反面的颜色测量。富含EGII的制剂进行的处理用作比较。！^表示亮度，-M是蓝色方向。酶制剂粗斜纹布ECU/条件纤维素酶处理之前纤维素酶处理之后AMg衣物L*b*b*Atlanta,Ukossport47.98-7.2540.18-14.63-7.80-7.38富含EGIIMathcw,Ukossport用乙酸调整pH55分钟50°C,pH538.41-7.1736.11-10.93-2.30-3.76Nostalgy，Ukossport100046.70-6.0641.87-11.73-4.83-5.67Vicunha,Savana35.65-9.2433.48-12.44-2.17-3.20平均42.19-7.4337.91-12.43-4.28-5.00Atl肌ta，Ukossport48.01-7.2941.82-13.25-6.19-5.96EG28+CtCBDMathew，Ukossport用乙酸调整pH55分钟50°C，pH537.60-7.2735.59-10.50-2.01-3.23Nostalgy,Ukossport50046.79-5.9944.75-9.37-2.04-3.38Vicunha，Savana35.08-9.4833.72-U.80-1.36-2.32平均41.87-7.5138.97-11.23-2力0-3.72Atlanta,Ukossport47.55-7.4342.41-13.30-5.14-5.87EG28+CtCBDUkossport用乙酸调整pH55分钟50°C,pH637.27-7.5836.01-10.27-1.26-2.69Nostalgy,Ukossport50047.02-6.0144.61-10.13-2.41-4.12Vicunha，34.84-9.3933.53-11.20-1.31-1.81平均41.67-7.6039.14-11.23-2.53-3.62实施例7、在50°C和60°CpH对EG28+CtGBD纤维素酶制剂的性能的影响在粗斜纹布的生物石洗中，测试了在50。C和60°C下木霉(菌株RF6377)中生产的重组金黄色嗜热子囊菌EG28+CtCBD融合蛋白在不同pH值下的性能。脱浆和切割成片的靛蓝染色的粗斜纹布(与前述实施例中的不同)用作试验材料。纤维素酶处理按照下面的描述在LP-2LaunderOmeter中进行。将大约7.2g粗斜纹布织物(每块大约12cmx12cm)、200mlMcllvaine柠檬酸磷酸盐缓冲液和90颗钢珠(直径0.6cm)装在1.2升容器中。LaunderOmeter在4到8的不同pH值下使用50°C和60°C的温度运行120分钟。在将布片从容器中取出后，将它们用水漂洗，在含有NaOH(PH>11)的水中一边搅和一边浸泡10分钟。然后将布片浸泡在含有液体洗涤剂(OMOColor)的温水中，并搅和10分钟，然后仔细地用温水漂洗几次。将布片在室温干燥。生物石洗效果按照实施例4中的描述通过测量颜色的反射率单位来进行评估。对粗斜纹布片的正面上的每个测量值是至少20个测量的平均。在表6和7以及图4和5中显示的结果表明，EG28+CtCBD纤维素酶在50°C下的最适pH范围是5.5到6.5，在60°C时是5到7。表6、在50°C时，EG28+CtCBD纤维素酶在不同pH值下处理的粗斜纹布正面的颜色测量。L^表示亮度，-"是蓝色方向。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表7、在60°C时，EG28+CtCBD纤维素酶在不同pH值下处理的粗斜纹布正面的颜色测量。L+表示亮度，-M是蓝色方向。酶制剂ECU/g衣物条件纤维素酶处理之前纤维素酶处理之后L,增加b*b*EG28+CtCBD1000pH417.19-13.5820.48-15.773.29EG28+CtCBD1000pH517.10-13.2422.74-16.595.64EG28+CtCBD1000pH5.517.10-13.5422.66-16.615.56EG28+CtCBD1000pH617.10-13.6522.83-16.745.73EG28+CtCBD1000pH6.517.19-13.4722.65-11.725.46EG28+CtCBD1000pH716.99-13.7222.10-16.665.11EG28+CtCBD1000pH817.13-13.6819.35-15.152.22缓冲液对照0p恥17.36-13.618.95-14.281.59实施例8、EG28+CtCBD纤维素酶制剂在不同温度下的粗斜纹布精整中的性能在不同温度下粗斜纹布的生物石洗中，测试了实施例1中描述的在木霉(菌株RF6377)中生产的重组金黄色嗜热子囊菌EG28+CtCBD融合蛋白产生与浮石提供的相似的磨损外观的能力。使用了有效的粗斜纹布精整酶——商业化的富含EGII的酸性纤维素酶制剂(US.5,874,293)和中性纤维素酶制剂ECOSTONECl作为参比。用于生物石洗的试验系统与实施例4中相同，只是使用了不同的粗斜纹布，并且洗涤时间为55分钟。EG28+CtCBD的酶制剂和富含EGII的酶制剂的酶活性(内切葡聚糖酶单位，ECU)按照实施例4测量。中性纤维素酶制剂ECOSTONECl的活性(中性纤维素酶单位，NCU)按照以前的描述(Bailey和Nevalainen,1981;Haakana等，2004)测定为从羧甲基纤维素释放的还原糖。ECOSTONECl、EG28+CtCBD或富含EGII的制剂的剂量分别为250NCU/g、500ECU/g或1000ECU/g织物。按照实施例4评估纤维素酶处理的效果。EG28+CtCBD在温度40到70°C、pH6下的性能显示在表8和图6中。该酶的优选温度范围为50到70。C。如果需要较暗的外观，可以使用较低的温度像40。C以获得色彩不太鲜明(lesscolorpull)的磨损效果。结果也与实施例6中获得的结果一致，其中EG28+CtCBD在生物石洗中的性能显示出比商业化的富含EGII的酸性纤维素酶制剂的效率高大约2倍。酸性纤维素酶通常具有返染的倾向。中性纤维素酶，像ECOSTONECl，一般导致低返染，因而产生了好的反差。这里获得的结果显示出使用EG28+CtCBD纤维素酶获得了与使用中性纤维素酶相似的效果(表8)。表8、在不同温度下用EG28+CtCBD纤维素酶处理的粗斜纹布的颜色测量用富含EGII的酸性纤维素酶和ECOSTONECl中性纤维素酶制剂进行的处理被用作参比。1^*表示亮度，-M是蓝色方向，+13*是黄色方向。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例9、EG28和EG28+CtCBD纤维素酶在生物精整(去起球)中的性能测试了来自菌株RF6188的EG28纤维素酶和来自菌株RF6377的EG28+CtCBD制剂在棉针织品去起球中的性能。使用伊莱克斯的WascatorFOM71CLS洗涤脱水机在表9描述的条件下进行纤维素酶处理。两种具有绒毛表面的低质量圆高翻领运动衫，由100%棉制成的平针织物或由95%棉或5%莱卡制成的罗纹织物，它们的布片用作带有讳纱材料的试验材料。样品首先在60。C用1ml/1的表面活性剂/润湿剂(来自Sandos的SandocleanPCJ和来自Clariant的SmacolCN)预洗10分钟，并用水漂洗三次。然后用纤维素酶将棉织物在预洗中所使用的相同的纺织辅助剂存在下，在60。C处理60分钟。酶按照实施例4中的描述失活，只是温度不同，在碱性漂洗期间为60。C。将针织品片漂洗三次，然后滚筒(dumbler)干燥。表9、在生物精整处理中使用的试验条件/加工参数<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>使用裸眼和放大镜对纤维素酶处理的效果进行目测评估。没有用酶的预洗样品用作对照。结果显示，EG28+CtCBD制剂改进了去起球性质。与对照(没有用酶处理)相比，用EG28+CtCBD制剂处理后针织物的表面绒毛明显减少。EG28制剂也具有去起球效果。实施例10、饲料造粒稳定性试验在模拟工业化饲料生产过程的实验中，分别测试了两种纤维素酶制剂，EG28(菌株RF6188)禾卩EG28+CtCBD(菌株RF6377)。在测试前，将喷雾干燥的EG28或EG28+CtCBD制剂与小麦面粉一起碾磨，以在饲料水平上提高均匀性。与面粉预混的EG28或EG28/CtCBD酶分别以200g/t和500g/t饲料的剂量添加。过量的酶是用于便于在高温下造粒的样品的分析，因为在高温下活性可能显著降低了。作为半工业化饲料工厂的一部分，磨机和混合器被用于生产粗粉混合物，额定造粒能力为5t/h。磨机是装备有03.0mm的模具的Champion锤式磨机。磨碎的原料在2,500升卧式混合器中以27rpm混合，然后转移到小型饲料磨碎设备中。设备包含卧式混合器(体积700L，速度48rpm，混合批料300kg)、SkjoldTR螺旋配料器和Kahl阶式混合机(长度130cm，直径30cm，速度155rpm，装备有37个可调节的棘爪(pallets))。对于300kg/h来说，停留时间是大约30秒。固定在阶式混合机侧面的是多支管，带有排水器和将蒸汽导向粗粉的3个蒸汽阀。蒸汽由高压锅炉提供，最大供气量为每小时400kg蒸汽。测试在两个大气压的过压下进行，蒸汽通过减压阀导入，减压阀控制向阶式混合机中加入蒸汽。多支管上的三个阀被用于精细调节所需的粗粉温度。就在粗粉进入造粒模具之前，粗粉温度通过放置在阶式混合机出口中的数字温度计测量。压粒机是SimonHeesen人工型(单辊)，带有03mm*35mm的模具和7.5kW的马达。模具的内径173mm，压制辊的高度50mm，压制辊直径140mm，运行速度500rpm，额定处理量300kg/h。在压粒后取样，将样品在底上有孔的分区冷却盒中冷却，通风机1500mS空气/h。36生产了300kg批料的基于小麦的粉料。从10kg该粗粉和200g(或500g)测试的酶在70升的强制式混合机中生产预混物。混合机速度45rpm。混合时间IO分钟。将该预混物与290kg饲料一起加入到小型饲料磨碎设备的卧式混合机中，搅拌IO分钟。对粉料取样后，将词料通过压粒机(模具03mm)造粒。通过调整通入阶式混合机的蒸汽，将粗粉加热到靶温度(65到90。C)。对于每个温度，在达到靶造粒温度(在造粒前即刻在粗粉中测量)后10分钟取第一个样品。在1分钟内取出相当于5.0kg造粒饲料的样品。将样品取成大约500克的分样，在颗粒离开压粒机后放置在冷却盒中10-15秒。所有的样品在环境温度下通风冷却15分钟。在样品分样器中将样品均匀地分成分样，并装到塑料袋中。样品分析如下将2.5g充分磨碎的样品与20ml乙酸盐缓冲液(0.05M，pH5.0)在室温搅拌30分钟，离心(10min，4000rpm)并稀释。将三份1.0ml的澄清样品在40。C水浴中平衡5分钟。不搅拌加入/3-Glucazyme片(Megazyme，Ireland)起始反应。在准确的30分钟后，通过力口入5.0ml的TrizmaBase1%(w/v)(Sigma-Aldrich)、在涡旋混合器上剧烈搅拌来终止反应。将试管在室温放置大约5分钟；再次搅拌浆料，并通过Whatman1号滤纸进行过滤。在590nm处测量滤液的吸光度。结果使用标准曲线进行分析。在造粒之前和之后酶活性的回收率显示在表10中。造粒温度对/5-葡聚糖酶活性的回收率的影响已经显示在图7和8中。EG28和EG28+CtCBD纤维素酶在高达80°C时仍然稳定。在90°C的造粒温度下，EG28+CtCBD纤维素酶倾向于比EG28更稳定。37表10、在65到90。C的温度范围下，造粒之前(来自卧式混合机的粗粉)和之后的酶活性回收率造粒温度;8-葡聚糖酶活性(FBU/kg饲料)(EG28)(EG28+CtCBD)来自卧式混合机的粗粉239000±9000(100%)1148000±48000(100%)颗粒(65°C)227000±16000(95%)1007000±67000(88%)颗粒(70°C)217000±5000(91%)1012000±54000(88%)颗粒(75°C)227000±14000(95%)993000±49000(86%)颗粒(80°C)215000±6000(90%)1030000±87000(90%)颗粒(85°C)188000士7000(79%)904000±56000(79%)颗粒(90°C)149000±8200(62%)861000±32000(75%)保藏生物列表菌株包含的质粒保藏单位保藏曰期保藏号嗜热枝顶孢菌dr價函'謹Aerwop/H7wm)ALK04245CBS(1)2004年9月20日CBS116240金黄色嗜热子囊菌ALK04242-CBS(1)2004年9月20日CBS116239嗜热毛壳菌(C7/""腦〖画/力ermop力z/wm)ALK04265-CBS(2)1995年11月8日CBS730.95大月ll杆菌—(五sc/zen'c/z/aco//)pALK1946DSMZ(3)2006年4月7日DSM18159大肠杆菌(&cAen.c/n.aco//)pALK1926DSMZ2005年5月13日DSM17326(1)荷兰微生物菌种保藏中心(theCentralbureauVoorSchimmelcultures)，Uppsalalaan8,3584CT，Utrecht,荷兰。(2)荷兰微生物菌种保藏中心(theCentralbureauVoorSchimmelcultures)，Oosterstraat1，3742SKBAARN,荷兰。(3)德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ))，MascheroderWeg1b,D-38124Braunschweig,德国。38参考文献AltschulSF，WGish，WMiller,EWMyers和DJLipman.1990.Basiclocalalignmentsearchtool.(基本的本地比对搜索工具)J.Mol.Biol.215:403-410.BaileyMJ禾口KMHNevalainen1981.Induction,isolationandtestingofstable7Wc/wi/erm<2reew/mutantswithimprovedproductionofsolubilizingcellulase.(可溶性纤维素酶生产改善的里氏木霉突变株的诱导、分离和测试)EnzMicrobiolTechnol.3:153-157.BendtsenJD,NielsenH,vonHeijneG禾口BrunakS.(2004)Improvedpredictionofsignalpeptides:SignalP3.0.(改进信号肽的预测SignalP3.0)J.Mol.Biol.340:783-795.Gasteiger,E，AGattiker，CHoogland,IIvanyi，RDAppel禾口ABairoch.2003.ExPASy:theproteiomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis.(ExPASy:深入了解和分析蛋白的蛋白质组学服务器)NucleicAcidsRes.31:3784-3788.HaakanaH,AMiettinen-Oinonen，VJoutsjoki,AMantyla,PSuominen,禾口JVehmaanpera.2004.CloningofcellulasegenesfromjWe/朋ocar戶sa/6omycesandtheirefficientexpressioninJWc/zodwmareew/.(从Me/a"0cfl/7"sa/6om_ycM克隆纤维素酶基因以及它们在里氏木霉中的高效表达)EnzMicrobiolTechnol.34:159-167.HenrissatB.(1991)Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacids叫uencesimilarities.(基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类)Biochem.J,280:309-316.HenrissatB.禾口BairochA.(1993)Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.(基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类中的新家族)Biochem.J.293:781-788.HenrissatB.禾口BairochA.(1996).Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.(基于序列的糖基水解酶分类的更新)Biochem.J.316:695-696HongJ.，H.Tamaki,K.Yamamoto禾口H.Kumagai.2003.Cloningofageneencodingathermo陽stabileendo陽/3-l，4-glucanasefromTTzermoascws(Wraw"acw51anditsexpressioninyeast.(金黄色嗜热子囊菌的热禾急定性内切-^-l，4-葡聚糖酶的编码基因的克隆及其在酵母中的表达)Biotech.Letters25:657-661.IUPAC(国际理论和应用化学联合会，InternationalUnionofPureandAppliedChemistry)(1987).Measurementofcellulaseactivities.(纤维素酶活性的测量)PureandAppl.Chem.59:257-268.Joutsjoki,VV，TKTorkkeli禾卩KMHNevalainen.1993.TransformationofTWcAodermflreese/withthe//o環oc(9"^ms/aeglucoamylaseP(gamP)gene:productionofaheterologousglucoamylaseby7Wc/ocferm(3reesd.(使用7for腳ccw、ms/wfle葡糖淀粉酉每P(gamP)基因转化里氏木霉通过里氏木霉生产异源的葡糖淀粉酶)Curr.Genet.24:223-228.KarhunenT,AMiintyla，KMHNevalai腿禾口PLSuominen.1993.Highfrequencyone-stepgenereplacementinrr/c/zocfe環(3reese/.I.EndoglucanaseIoverproduction.(里氏木霉中的高频率一步基因置换I:内切葡聚糖酶I的过表达)Mol.Gen.Genet.241:515-522.MalardierL,DaboussiMJ,JulienJ,RousselF,ScazzocchioC禾口BrygooY.1989.Cloningofthenitratereductasegene(niaD)ofJspergf/Zi^m.c/w/awsanditsusefortransformationofFtwan'w附cajAs^orwm.(克隆构巢曲霉的硝基还原酶基因(niaD)及将其用于转化尖孢镰刀菌)Gene15:147-156.NeedlemanS.禾卩WunschC.(1970)Ageneralmethodapplicabletothesearchforsimilaritiesintheaminoacidsequenceoftwoproteins.(可用于搜索两个蛋白的氨基酸序列相似性的通用方法)JournalofMolecularBiology48,443-453.NielsenH.，EngelbrechtJ.,BrunakS.，禾口vonHeijneG..1997.Identificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites.(原核和真核信号肽的鉴定及它们切割位点的预40湖!))Prot.Engineering10:1-6.PaloheimoM,AMantyla，JKallio，禾卩PSuomi羅.2003.High-yieldproductionofabacterialxylanaseinthefilamentousfungusJWcAoi/er應re&ye/requiresacarrierpolypeptidewithanintactdomainstructure.(在丝状真菌里氏木霉中高产量生产细菌的木聚糖酶需要具有完整结构域结构的载体肽)Appl.Env.Microbiol.69:7073-7082.PenttilaM,HNevalainen，MRatt6，ESalminen禾口JKnowles.1987.AversatiletransformationsystemforthecellulolyticfilamentousfungusTWc/^^rmaree^/.(用于水解纤维素的丝状真菌里氏木霉的通用转化系统)Gene61:155-164.RaederU禾口PBroda.1985.RapidpreparationofDNAfromfilamentousfungi.(从丝状真菌中快速制备DNA)Lett.Appl.Microbiol.1:17-20.RiceP，LongdenI禾口BleasbyA.(2000).EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite.(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套装)TrendsinGenetics16:276-277.SambrookJ，EFFritsch禾口TManiatis.1989.Molecularcloning,alaboratorymanual.《分子克隆，实验室手册》ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,US.SambrookJ禾口DWRussell.2001.Molecularcloning,alaboratorymanual.《分子克隆，实验室手册》ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,US.SrisodsukM,ReinikainenT，Pen幽M禾卩TeeriT.(1993)Roleoftheinterdomainlinkerpeptideof7Wc/o<iermareesez'cellobiohydrolaseIinitsinteractionwithcrystallinecellulose.(里氏木霉纤维二糖水解酶I的结构域间接头肽在其与结晶纤维素的相互作用中的功能)J.Biol.Chem.Oct5;268(28):20756-61.StMbrandH,Siika-ahoM,TenkanenM禾卩LViikari.1993.J.Biotechnol.29:229-242.WardM，ShanW，DaubermanJ,WeissG,LarenasE，BowerB,Rey41M，ClarksonK禾口BottR.(1993)Cloning,sequenceandpreliminarystructuralanalysisofasmall,highpiendoglucanase(EGIII)fromJWdoJerma(来自里氏木霉的高等电点小内切葡聚糖酶(EGIII)的克隆、序列及初步结构分析)P.Suominen和T.Reinikainen主编，ProceedingsofthesecondTRICELsymposiumonTRICHODERMAREESEICELLULASESANDOTHERHYDROLASES,《关于里氏木霉纤维素酶和其它水解酶的第二届TRICEL研讨会会议录》Espoo，芬兰，1993。FoundationforBiotechnicalandIndustrialFermentationResearch8(1993):153-158.权利要求1.纤维素酶融合蛋白，其包含第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列，所述第一个氨基酸序列是内切葡聚糖酶核心，所述第二个氨基酸序列包含与SEQIDNO15具有至少75％同一性的接头和纤维素结合结构域(CBD)，或其具有纤维素结合活性的变异体或片段。2.权利要求l的融合蛋白，其中内切葡聚糖酶属于糖基水解酶家族5。3.权利要求1或2的融合蛋白，其中内切葡聚糖酶核心源自金黄色嗜热子囊菌(T7ze環0(xsc"51fl"/-a""<3".")或嗜热枝顶孢菌dre脂,"'謂Awmop/n7ww)，特别是源自金黄色嗜热子囊菌CBS116239或嗜热枝顶孢菌CBS116240。4.权利要求1的融合蛋白，其中内切葡聚糖酶核心与SEQIDNO:2具有至少75%的同一性，或为其具有纤维素酶活性的变异体或片段。5.权利要求4的融合蛋白，其中内切葡聚糖酶核心包含SEQIDNO:2的19到334位氨基酸。6.权利要求1的融合蛋白，其中内切葡聚糖酶核心与SEQIDNO:8中包含的序列编码的内切葡聚糖酶核心具有至少75%的同一性，或为其具有纤维素酶活性的变异体或片段。7.权利要求1的融合蛋白，其中所述接头和CBD源自嗜热毛壳菌(C7^e,om/"w//^厂附o;;n7ww)、特别是嗜热毛壳菌CBS730.95的纤维二糖水解酶。8.权利要求1的融合蛋白，其中内切葡聚糖酶核心包含序列SEQIDNO:2，并且接头和CBD包含序列SEQSDNO:15。9.权利要求1的融合蛋白，其包含氨基酸序列SEQIDNO:4或6，或其具有纤维素酶和纤维素结合活性的变异体或片段。10.权利要求1的融合蛋白，其中内切葡聚糖酶核心的编码基因等价于大肠杆菌DSM17326中包含的基因。11.权利要求1的融合蛋白，其由融合基因编码，所述融合基因等价于大肠杆菌DSM18159中包含的融合基因。12.分离的多核苷酸，选自-a)SEQIDNO:3或5的核苷酸序列，或权利要求1的纤维素酶融合蛋白的编码序列，b)a)的互补链，以及c)由于遗传密码的原因而与序列a)或b)的任何一个简并的序列。13.权利要求12的多核苷酸，其包含的融合基因等价于大肠杆菌菌株DSM18159中包含的融合基因。14.表达载体，其包含权利要求12的核苷酸序列。15.宿主细胞，其包含权利要求14的表达载体。16.权利要求15的宿主细胞，其是真菌，优选为木霉属17.生产权利要求1-11任一项的融合蛋白的方法，包括如下步骤用编码所述融合蛋白的表达载体转化宿主细胞和在能够表达所述融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞，以及任选回收和纯化产生的融合蛋白。18.酶制剂，其包含权利要求1-11任一项的融合蛋白。19.处理纤维素材料的方法，其中所述方法包括将纤维素材料与权利要求1-11任一项的融合蛋白或权利要求18的酶制剂相接触。20.权利要求19的方法，其中所述纤维素材料是纺织材料、用于动物饲料的植物、或源自木头的纸浆或二次纤维。21.权利要求19的方法，其中油从植物材料中提取。22.进行生物石洗的方法，该方法包括将权利要求1到11任一项的纤维素酶融合蛋白或权利要求18的酶制剂与粗斜纹布织物或衣物相接触的步骤。23.进行生物精整的方法，其包括将权利要求1到11任一项的纤维素酶融合蛋白或权利要求18的酶制剂与纺织材料例如织物或衣物或纱线相接触的步骤。24.洗涤剂组合物，其包含权利要求1-11任一项的融合蛋白和洗涤辅助剂。25.动物饲料，其包含权利要求1-11任一项的融合蛋白。26.登记号为DSM18159的大肠杆菌菌株。全文摘要本发明描述了含有内切葡聚糖酶核心区域和异源的纤维素结合结构域的纤维素酶融合蛋白。所述融合蛋白可以通过重组技术使用合适的多核苷酸、表达载体和宿主细胞来生产。融合蛋白及其酶制剂可用于处理纤维素材料例如纺织材料，并且它们在粗斜纹布的生物石洗或织物和衣物的生物精整中特别有用。此外，融合蛋白可用于纸浆和造纸工业，从植物中提取油、洗涤剂组合物、或用于改进动物饲料的质量。文档编号C12N9/42GK101460617SQ200780020308公开日2009年6月17日申请日期2007年4月12日优先权日2006年4月13日发明者亚尔诺·卡利奥,亚里·韦赫曼佩雷,彭蒂·奥亚帕洛,玛丽卡·阿拉普拉内恩,莱纳·瓦尔塔卡里申请人:生化酶股份有限公司