使用Bcl-X_L特异性siNA的癌症疗法的制作方法

专利名称：：使用Bcl-X_L特异性siNA的癌症疗法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对Bcl-XLmRNA特异的短核酸分子，该Bc1-XlmRNA可通过RNA干扰(RNAinterference)下调(down-regulate)Bcl-XL蛋白质的表达并且抑制肿瘤细胞的体内生长；并且还涉及它们在癌症治疗上的应用。
背景技术：
：程序性细胞死亡(Apoptosis，凋亡)在某种程度上受Bcl-2蛋白质家族调节，该家族包括预凋亡的Bax、Bcl-Xs、Bak、Bad、Bid、Bik、Bim、以及抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-l、al和Bcl-W。细胞对由各种刺激物比如细胞毒类药物、血清缺乏和辐射诱导的凋亡的易感性，呈现为至少部分地通过亚细胞的定位以及在预凋亡和抗凋亡的蛋白质之间的相对比率而确定，所述蛋白质可以杂二聚化(heterodimerize)并且滴定相互之间的功能(White,E.,GenesDev.,1996,10,1-15;Korsmeyer,S丄，CancerRes.,1999,59,1693s-1700s;Cory,S.andAdams,J.M.，Nat.Rev.Cancer,2002,2,647-656)。已经发现，在许多肿瘤中都存在大量Bcl-2家族中抗凋亡的成员，并且Bcl-2和Bcl-X^的上调表达(upregulation)已经被证明是恶性生长和抗药性中的关键因素(Reed,J.C.,Semin.Hematol.,1997,34，9-19;Konopleva"a/.，Br.J.Haematol.,2002,118,521-534;Lebedeva"a/.，CancerRes"2000,60，6052-6060;Liu"a/"Gynecol.Oncol"1998,70,398-403;Simonian"a/.,Blood,1997,90,1208-1206)。特别是Bcl-2和/或Bcl-X[^经常在卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌、神经胶质瘤、间皮瘤、以及黑素瘤中被过分表达(Hee/a/.,Chin.J.Cancer,2003,22，11-15;Min"a/.，Chin.J.Oncol"2004,26,14-16;Krishna"a/.,J.Neurosurg.,1995,83,1017-1022;Krajewskia/.,Am.J.Pathol"1997,150,805-814;Cao"a/.，Am.J.Respir.Cell.Biol"2001,25，562-568;Soini"a/.,Clin.CancerRes.,1999，5,3508-3515;KojimaWfl/"J.Biol.Chem.，1998，273，16647-16650;OlopadeWa/.,CancerJ.Sci.Am.,1997,3,230-237;Zapata"a/.,BreastCancerRes.Treat,1998,47,129-140;Simonian"a/.，Blood,1997,90,1208-1216;Leiter"a/.,Arch.Dermatol.Res"2000,292,225-232;Nicholson"a/.，Nature,2000,407,810-816;Krajewska"fl/.，CancerRes"1996,56,2422-2427;Ma丽"a/.,Dig.Dis.Sci"1998,43,2641-2648;Mercatante"a/.,J.Biol.Chem.,52002,277,49374-49382;Ferrandina"fl/"CancerLett,2000,155,19-27;Liu"a/.,Gynecol.Oncol"1998，70,498-503;Marone"a/.,Clin.CancerRes"1998,4,517-524;FrenchPatentApplicationFR0108864)。然而，通常认为，相比Bcl-2，Bcl-XL对抑制被细胞毒类药物和辐射诱导的凋亡更有效率(Simonian"a/.,precited;Gottschalketal.,RN.A.S.，1994，91,7350-7354)。因此Bcl-XL代表了用于癌症疗法、尤其用于对常规抗癌剂有抗力的癌症疗法的较好标靶。BCL2L1基因(BCX2类1、BCL2L、BCLX、Bcl-X、Bcl-X、或Bcl-X基因)的转录会产生可选地、拼接的可编码三种同工型的变体较长的抗凋亡同工型(Bc1-Xl)、较短的预凋亡同工型(Bcl-Xs)和Bcl-X(e同工型)。Bcl-XL是一种有233个氨基酸、由包含BCL2L1基因的外显子1、外显子2和外显子3的较长转录产物变体(转录产物变体1编码的蛋白质分别地对应于NCBI入藏登记号NP—612815(SEQIDNO:3)和NM—138578(SEQIDNO:2)的人类Bcl-XLmRNA和蛋白质。'Bcl-Xs是一种有170个氨基酸的蛋白质，具有Bcl-Xt蛋白质的N-末端序列(第1至125位)和C-末端序列(第189至233位)，只是缺少了Bc1-Xl蛋白腐从第126到188位之间63个氨基酸的序列。Bcl-Xs被包含外显子l、外显子的25'序列和外显子3的较短转录产物变体(转录产物变体2)编码。Bcl-XsmRNA缺少对Bcl-X!^转录产物有特异性的位于外显子2的3'末端的189个核苷酸的序列。而且，在Bcl-Xs上遗漏的、Bc1-Xl蛋白廣上相应的63个氨基酸的序列对Bcl-Xt蛋白质具有特异性。人类Bcl-XsmRNA和蛋白质分别对应于NCBI入藏登记号NP—001182和NM—001191。Bcl-X(0)是一种含227个氨基酸的蛋白质，具有Bcl-XL(Bc1-Xl蛋白廣的第1至188位，被BCL2基因的外显子1和外显子2编码)的N-末端序列、以及被BCL2基因的内含子2编码的39个氨基酸的C-末端序列。Bcl-Xd立于外侧的线粒体膜，并且显示出可以通过阻断来自线粒体膜的胱天蛋白酶活化剂和细胞色素C的释放来调节细胞死亡(DesagherS.andMartinou,J.C.,TrendsCell.Biol.，2000,10,369-377;Hengartner,M.O.,Nature,2000,407,770-776;Kroemer,G.,Nat.Med"1997，3,614-620;Kroemer"a/.,Immunol.Today,1997，18,44-51;Marchetti"a/.,J.Exp.Med.,1996，184,1155-1160;Minn"a/.,Nature,1997,385,353-357;Susine,a/.,J.Exp.Med"1996,184,1331-1341)。通过反义低聚核苷酸，Bcl-XL表达下调显示出可以诱导凋亡并且强化化学疗法在癌细胞上的细胞毒效果(美国专利申请US2003/0191300;美国专利5,776、905和6,143,291;PCT申请WO00/01393、WO00/66724;LebedevaWa/.,precited;Yange,a/.,TheJ.Biochem"2003,278，25872-25878;Sonnemann"a/.,CncerLetters,2004,209,177-185;Sonnemannetal,，Int.J.Oncol.,2004,25,1171-1181;OzvaranWMol.CancerTherapeutics,2004,3,545-550;Smythee/a/.,TheJ.ThoracicandCardiovascularSurgery,2002，123,1191-1198;Sim6es"a/.,Int.J.Cancer，2000,87,582-590,Hopkins-Donaldsone/a/.，Int.J.Cancer,2003，106,160-166;Heeres"o/.，Int.J.Cancer,2002，99,29-34;Taylor"a/.,Oncogene,1999,18，4495-4504;Wacheck"a/"BritishJournalofCancer,2003,89,1352-1357;Taylor"or/.,NatureBiotechnology,1999,17，1097-1100;Mercatanteetal.，precited;FrankelWa/"CancerResearch,2001,61,4837-4841;RoyWc7/.,Oncogene,2000,19，141-150)。然而，反义低聚核苷酸技术面临许多问题，包括低吸收率、非专一性抑制效果、很大的有效剂量和毒性。用于抑制特定标靶表达的小干扰RNA(siRNA)技术的成功应用在很大程度上保证了癌症治疗上新方法的发展潜力。RNAi干扰是这样一种方法，将双链RNA导入细胞，以序列依赖的方式抑制基因表达(参见Shuey等在DrugDiscoveryToday,2002,7,1040-1046中的评述)。已经在许多生物比如哺乳动物、果蝇、线虫、真菌和植物中观察到RNAi，并且RNAi被认为涉及抗病毒的防御性、转座子活性的调节和基因表达的调节。RNAi通常被描述为转录后的基因沉默机制，其中dsRNA引发细胞质中同源信使RNA的降解。标靶识别是有高度序列特异性的，因为一种或两种碱基对在siRNA和标耙基因之间错配将大大地降低沉默效果。RNA干扰的介体是21个和23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)。在第二步，siRNA结合于被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核糖核酸酶复合物，该RISC将小dsRNA引导至其同源的mRNA标靶。因此，RISC大约在与反义diRNA配对的区域当中切割mRNA，此后mRNA进一步降解。将siRNA给药于小鼠显示出其可以有效地抑制位于各种器官(肝脏、脑、眼睛、肺、肾)中以及在异种移植中的标靶的表达(Braasch"a/.，Biochemistry,2003,42,7967-7975;Duxburye/Biochem.Biophys.，Res.Comm."2003，311,786-792;Giladi"a/.，Mol.Ther"2003，8,769-776;Lewis"a/.,Nat.Genet,2002，32,107-108;Makimura"a/.，BMCNeurosci.，2002,3,18-;Reichetal.,Mol.Vis"2003,9,210-216;Songetal.,Nat.Med.,2003,9,347-351;Zendereta"P.N.A.S.,2003,100,7797-7802)。和反义技术相比，RNAi是一种高效率的基因特异性技术，并且具有长期稳定性、可逆性、以及步骤简单的优点。7已经在体外使用靶向Bcl-Xt的RNAi，以研究Bcl-Xt在细胞存活率中的作用和其对化学疗法的抗性。被RNAi下调的Bcl-X^表达显示出可以诱导程序性细胞死亡，并且可以强化体外在癌细胞上化学疗法的细胞毒效果(Taniaietal.，CancerRes.,2004,64，3517-3524;Zhangetal.,Haematologica,2004,89，1199-1206;Zender"a/.,Hepatology,2005,41，280-288;Shimizu"NatureCellBiology,2004,6，1221-1228;Hon"a/"J.Immunol"2004,173，4425-4432;Dodier"a/.,GynecologicOncology,Epub,2005，Sep26;He"a/"ChineseJ.Cancer,2005，24,646-652;Liu"a/.，ActaPharmacol"Sin.，2005,26,228-234;Lei"a/.，ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2005，37,555-560;PizziWa/.，CellDeathandDifferenciation,2005,12,761-772;RorhbachWa/.,J.Mol.Cell.Cardio.，2005,38，485-493;Tran"a/.，TheJ.Biol.,Chem.,2005,280,3483-3492;Zhu"a/.，CancerBiologyandTherapy,2005,4,393-397;Zhu"a/.，MolecularCancerTherapeutics,2005,4，451-456;美国专利申请2005/0176025)。然而，很少RNAi对Bcl-XL是特异性的(Zender等;Hon等;Dodier等;He等，Liu等，Tran等，Zhu等，癌症生物学和疗法，参见前述)。另外，测试发现一些BcI-Xl特昇性的siRNAis仅与非特异性的siRNAis结合(Dodier等，参见前述)，并且没有一种Bcl-XL特异性的siRNAis被证明在体内具有抗肿瘤效果。
发明内容本发明人已设计出能有效地下调抗凋亡蛋白质Bcl-XL的表达的Bc1-Xl特昇性siRNA。将低剂量的BclO^特异性siRNA注射至植入有人类化学抗性肿瘤细胞的小鼠，极大地增加了小鼠存活率，并且诱导在肿瘤细胞植入后至少5个月内预形成的肿瘤的完全退化。该siRNA在癌症治疗中是有用的，特别是用于治疗对常规的抗癌剂有抗性的肿瘤。因此，本发明涉及一种对Bcl-X^转录产物有特异性的双链短千扰核酸(siNA)分子，其包含正义区域和反义区域，其中，正义区域包含核苷酸序列SEQIDNO:1或与所述序列具有至少70%—致性的序列、优选至少80%—致性的序列、更优选至少90%—致性的序列；而反义区域包含与正义区域互补的核苷酸序列。定义-"短核酸分子"指的是长度不超过100个核苷酸的核酸分子，优选长度不超过80个核苷酸，并且最优选长度不超过50个核苷酸。siNA长度通常在15至50个核苷酸之间、优选在15和40个核苷酸之间、更优选长度在15和30个核苷酸之间。-"干扰核酸分子"指的是能够调节RNA干扰的核酸分子。-"RNA干扰"(RNAi)指的是序列特异性的转录后基因沉默的步骤，其通过在细胞内导入双链的合成短核酸分子、比如双链的合成的21个核苷酸的RNA而被诱导，如同Elbashir等在Nature2001，411，494中和在PCT申请WO01/75164中第一次描述的那样。-"核苷酸"指的是标准核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，包括天然的碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)以及在糖、磷酸酯和/或碱基部分进行修饰的被修饰的核苷酸。-"一致性"指的是在两个核酸分子之间的序列一致性。一致性可以通过比较各个序列上的位置而确定，为了比较起见可以对所述序列进行排列。当比较序列上的位置被相同的碱基占据时，那么这些分子在该位置是一致的。核酸或氨基酸顺序之间的相似度或一致性是在核酸序列共用位置处相同核苷酸或者配对核苷酸的数量的函数。可以使用多种排列算法(alignmentalgorithms)和/或程序来计算两个序列之间的一致性，包括可作为GCG序列分析程序包的一部分而利用的FASTA或BLAST(威斯康星大学，Madison,威斯康星州)，并且可以与例如设置默认值一起使用。本发明中，通过计算与SEQIDNO:1的碱基相同的整个序列(具有N(15的N个碱基)的碱基的数量(n)来确定与SEQIDNO:1的序列一致性。百分比一致性(p)是100n/N。-"MM"指的是一个核酸分子与另一个核酸分子具有足够的一致性，从而得到RNAi活性，尤其是指具有至少70%的一致性，优选80%的一致性，更优选90%的一致性。-"，"指的是核酸或者通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或者通过其他非传统类型的碱基配对而形成氢键的能力。对于本发明的核酸分子，用于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸进行有关的功能例如RNAi活性。对于核酸分子的结合自由能的测定方法是本
技术领域：
众所周知的(参见，例如，Turnereta/.,1987,GS//办早历o/.,1987，LII，pp123-133，Friereta/"授AS.,1986,83，9373-9377;Turneratal.,JZ附.C&m.Soc.,1987,109,3783-3785)。互补性百分比显示了在核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的邻接残基的百分比(例如，在与具有10个核苷酸的第二核酸序列碱基配对的第一低聚核苷酸中，总共10个核苷酸之外的5、6、7、8、9、或10个核苷酸分别表示为50%、60%、70%、80%、90%和100%的互补性)。"完美的互补"是指核酸序列所有邻接的残基将通过氢键与第二核酸序列上相同数量的邻接残基结合。-"靶基因"指的是其表达待被下调的基因。-"靶序列"指的是与siNA分子反义区域互补的mRNA部分。9-"蜜庄"指的是能够通过连接而将另一种核酸转运其上的核酸分子。-"抗癌剂"、"抗癌疗法"指的是通过使用细胞毒试剂的化疗和放疗。根据本发明的短干扰核酸(siNA)分子对Bcl-X^转录产物有特异性(mRNA)，并且靶向对应于第849至867位的19个邻接的核苷酸，其为人类序列NCBI入藏登记号NM_138578(SEQIDNO:2在附后的序列表中)。根据本发明的siNA分子的标靶被包含于在BCL2L1基因上外显子2的3'末端的189个核苷酸的序列中(SEQIDNO:2的第742至930位)。该标靶在Bcl-Xs转录产物中缺失。另外，标靶位于Bcl-Xi转录产物的区域，其在与Bcl-2转录产物同源的区域外侧(SEQIDNO:2的第741至843位和第907至947位)。根据本发明的siNA分子特异性地抑制BcI-X^mRNA和蛋白质表达。该siNA对预凋亡的Bcl-Xs蛋白质或者其他的Bcl-2家族成员比如Bcl-2和Mcl-l的表达没有影响。可以通过任何RNA或者蛋白质分析技术(Northern-blot、Western-blot、定量RT-PCR)评价Bcl-XL表达的抑制，这是本
技术领域：
众所周知的。另外，本发明的siNA分子具有体内抗肿瘤活性，这可以在本领域技术人员所熟知的适当的动物模型中测定。本发明包含可以抑制来自任何生物的Bc1-XlmRNA和蛋白质表达的合成、半合成或者重组的siNA。SEQIDNO:1是人类靶序列，即，人类mRNA的部分，其与siNA分子反义区域互补。给定在人类mRNA序列中的目标位置，本领域的技术人员将很容易地在其他生物(真核生物比如哺乳动物)的同源序列中发现相应的位置，其可以在数据库比如NCBI数据库中得到((httD:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)。按照本
技术领域：
已知的方法，比如通过使用序列对比可以识别出这样的同源序列。另外，本发明的siNA分子可以抑制靶基因变体比如导致单体型多形性的多形态变体的表达。正如通过使用完全互补的序列或者通过合并可以提供附加的靶序列的非规范的碱基对，比如，错配和/或摆动碱基对、包括空翻错配、单一氢键错配、转移型错配、三碱基交互作用和四碱基交互作用，可以将siNA分子设计成靶向这些同源序列。例如，由于siNA分子所需要的高度特异性，可以将siNA分子设计成靶向一种序列，该序列对于特定标靶基因mRNA序列(单一等位基因或单一核苷酸多形性(SNP))而言是唯一的，从而介导RNA活性。作为另一种选择，当识别错配时，可以将非规范的碱基配对(比如错配和/或摆动碱基)用于产生耙向一种以上序列的siNA分子。在一个非限制性的实施例中，非规范的碱基配对比如uu和cc碱基对被用于产生能够靶向同源标靶mRNA序列的siNA分子。在这方法中，单一siNA可以被用于抑制一种以上mRNA的表达，而不是通过使用一种以上siNA分子以便耙向不同的mRNA。在一种实施方式中，本发明的特征在于一种siNA分子，其中各个链包含15至约30(例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30)个核苷酸或者由其组成，并且各个链包含至少15至约30个(例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸)与其他链的核苷酸互补的核苷酸。例如，本发明的siNA分子包括具有19至21个核苷酸的双链(19至21个碱基对)、或者由其组成。在本发明的另一个实施方式中，siNA分子包含核糖核苷酸(2'-OH核苷酸)、或者由其组成。在另一个实施方式中，本发明的特征在于一种siNA分子，其中正义区域包含序列SEQIDNO:l、或者由其组成，而反义区域包含序列SEQIDNO:4、或者由其组成。该siNA靶向人类基因(表I)。表I:靶向人类基因的siNA<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在本发明的另一个实施方式中，siNA分子包含在一端或两端悬垂的核苷酸，优选包含1至约3(例如约1、2、或3)个悬垂的核苷酸。优选在各个链的3'端的悬垂的核苷酸优选是2'-脱氧核苷酸，优选2'-脱氧嘧啶比如2'-脱氧胸腺嘧啶核苷。例如，本发明的siNA分子是具有21个核苷酸的双链，具有19个碱基对并且3'端是悬垂的tt。特别地，正义链是序列SEQIDNO:5而反义链是序列SEQIDNO:6;该siNA，注意是siXLl，对应于SEQIDNO:l(正义链)，而SEQIDNO:4(反义链)具有在3'端添加的tt悬垂物。在本发明的另一个实施方式中，siNA分子包含平端，其中两个末端是平端，或者可选地，其中两个末端之一是平端。比如，本发明的siNA分子是具有19至21个核苷酸的双链，具有19至21个碱基对以及平头末端。在本发明的另一个实施方式中，siNA分子由两个单独的低聚核苷酸片段或链组装而成，其中，一个片段(正义链)包含正义区域，而第二个片段(反义链)包含siNA分子的反义区域。在另一个实施方式中，本发明的特征在于一种SiNA分子，其中正义区域通过连接物分子比如核苷酸或非核苷酸连接物与反义区域连接。这种核苷酸连接物可以是长度至少为2个核苷酸比如长度约3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸的连接物。这样的siNA分子的例子包括小的发夹结构核酸(shNA)分子。非核苷酸连接物包含无碱基核苷酸(abasicnucleotide)、适配体(aptamer)、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂类、聚碳氢化合物(polyhydrocarbon)、或其他的聚合物。在本发明的另一个实施方式中，siNA分子包含错配、凸起、环或摆动碱基对，以调整siNA分子的活性从而介导RNA干扰。另外，siNA分子可以包括一种以上修饰，以提高对体内核酸酶降解的抗性和/或改善细胞的摄取。siNA可以包括下述核苷酸或核苷酸间的(internucleotidic)连接物在糖类、磷酸酯、和/或碱基部分修饰的核苷酸；以及/或者5'端或3'端修饰的核苷酸。在本发明的另一个实施方式中，siNA分子包含一种以上修正的嘧啶核苷酸和/或嘌呤核苷酸，优选在双链siNA的各个链上。更优选所述修饰的核苷酸选自下组2'-0-甲基核苷酸、2'-0-甲氧基核苷酸、脱氧核苷酸比如2'-脱氧核苷酸和2'-脱氧2'-氟代核苷酸、通用的碱基核苷酸、无环的核苷酸和5-C-甲基核苷酸。本发明的siNA分子通常可以包括约5%至约100%的修饰的核苷酸(例如，约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%修饰的核苷酸)。在得到的siNA分子上存在的修饰的核苷酸的实际百分比将取决于siNA分子中存在的核苷酸的总数。修饰百分比可以基于存在于正义链、反义链或两者的核苷酸总数。在另一个实施方式中，本发明的特征在于一种siNA分子，其中包含正义区域的链(正义链)包括在链的5'-端、3'-端、或5'-和3'-端的端帽(terminalcap)部分，优选脱氧的无碱基部分或甘油基部分。在另一个实施方式中，本发明的特征在于一种siNA分子，其中包含所述反义区域的链(反义链)包括在5'-端的磷酸基。在本发明的另一个实施方式中，siNA分子包含至少一种修饰的核苷酸间连接物，比如硫代磷酯连接物。可以通过采用众所周知的低聚核苷酸合成法经化学合成生产根据本发明的siNA分子，该合成法利用通常的核酸保护和偶联基团，比如在5'-端为二甲氧基三苯甲基而在3'-端为氨基磷酸酯。可以通过用抗核酸酶的基团比如2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟代、2'-0-甲基、122'-H修饰本发明的核酸分子以增强稳定性(对于综述，请参见Usman和Cedergren，1992,17,34和Usmanetal.,A^c/e/c爿c/cfc1994,31，163)。这样修饰的低聚核苷酸的例子包括，但不限于2'-F-CTP、2'-F-UTP、2'-NH2-CTP、2'-NH2-UTP、2'-N3-CTP、2-硫代CTP、2-硫代UTP、4-硫代UTP、5-碘代CTP、5-碘代UTP、5-溴代UTP、2-氯代ATP、腺苷5'-(l-硫代三磷酸酯)、胞啶5'-(1-硫代三磷酸酯)、鸟嘌呤核苷-5'-(l-硫代三磷酸酯)、尿嘧啶核苷-5'-(l-硫代三磷酸酯)、假UTP、5-(3-氨基烯丙基)-^1>和5-(3-氨基烯丙基)-dUTP。可以通过使用一般方法的凝胶电泳纯化siNA构造物或者可以通过高压液相色谱法(HPLC)纯化，并且再悬浮于水中。根据本发明、以化学方法合成的siNA分子可以由两个不同的分别合成的低聚核苷酸组装而成。作为备选，通过使用可分裂的连接物例如基于丁二酰的连接物，可以一前一后地合成siNA分子的两个链。可选地，可以从已为本领域技术人员所熟知的、并且可在市场上买到的被插入DNA或RNA载体中的转录单元(体外或者体内)表达本发明的siNA分子。本发明还涉及转录单元，其包含转录起始区域、转录终止区域、以及编码至少一个根据本发明的siNA分子的核酸序列，其中所述核酸序列被有效地以允许表达和/或释放siNA分子的方式连接于所述起始区域。核酸序列可以编码siNA分子的一个或者两个链、或可自我杂交成siNA双链的单个自补的链。转录起始区域可以从用于真核生物RNA聚合酶I、II或者III(poll、II或III)的启动子开始。来自polll或polII启动子的转录产物在所有细胞中以高水平被表达。作为另一种选择，可以使用原核生物的RNA聚合酶启动子，只要原核生物的RNA聚合酶可以在适当的细胞中表达。来源于编码U6小核转移RNA和腺病毒VARNA的转录单元的基因对在细胞中产生高浓度的预期siNA是有用的。本发明还涉及包含编码至少一种本发明的siNA分子的核酸的表达载体。该表达载体可以编码siNA分子的一个或者两个链、或可自我杂交成siNA双链的单个自补的链。优选将编码本发明的siNA分子的核酸插入如上限定的转录单元。大量的适合于siNA分子表达的DNA或RNA载体已为本领域的技术人员所熟知并且可在市场上买到。重组载体可以是DNA质粒或者病毒载体。可以基于、但是不限于腺病毒相关病毒、反向病毒、腺病毒或甲病毒属来构建siNA表达病毒载体。能表达siNA分子的重组载体可以在体内释放，并且保持在靶细胞上。作为另一种选择，病毒载体可以用于提供siNA分子的瞬时表达。本发明还涉及被如上限定的载体修饰的真核细胞或者原核细胞。本发明还涉及药物组合物，其在可接受的载体比如稳定剂、缓冲剂等中至少包含如上限定的siNA分子或表达载体。药物组合物或剂型指的是适合于给药，例如系统给药或局部给药，进入细胞内或者包括例如人类在内的对象体内的形式。合适的形式部分地取决于使用或进入途径，例如口服、吸入、或注射。根据本
技术领域：
任何已知的方法制备这些组合物或剂型，以用于制造药物组合物。在一个实施方式中，本发明的特征在于一种组合物，这种组合物中siNA分子或载体被联接于化合物，该化合物允许siNA/载体释放入癌细胞和/或内皮细胞。该化合物可以是细胞膜肽、转运蛋白、脂类、阳离子聚合物、PEI。优选siNA和化合物配制成在微球体、纳米颗粒或者脂质体。另外，siNA分子或载体可以与化合物相联接，该化合物允许特异性地靶向肿瘤和/或内皮细胞，例如是细胞表面抗原或受体的配体比如肽、糖类、叶酸或用于所述抗原/受体特异性的抗体。在另一个实施方式中，本发明的特征在于一种组合物，其包含至少两种不同的siNA分子的组合。特别地，该组合物包含如上限定的siNA分子和具有抗肿瘤效果的其他siNA分子。具有抗肿瘤效果的siNA分子包括、但不限于靶向Mcl-l转录产物的siNA。这些siNA分别由序列SEQIDNO:7、19或20的正义链和序列SEQIDNO:8、21以及22的反义链组成，这些siNA是Mcl-l-特异性siRNA的实施例。在另一个实施方式中，本发明的特征在于一种组合物，其中siNA分子或载体与至少一种抗癌药物相联接。本发明还涉及如上限定的siNA分子或载体用作药物。本发明还涉及如上限定的siNA分子或载体在制造癌症治疗用药物方面的应用。本发明进一步涉及如上限定的对Bcl-XL转录产物有特异性的短干扰核酸分子(siNA或包含所述siNA的表达载体)与靶向Mcl-l转录产物的短干扰核酸分子的组合的应用，以用于癌症治疗用细胞毒药物的制造。癌症可以是任何类型的癌症。优选癌症是实体瘤、例如卵巢癌、鼻咽癌症、乳腺癌、前列腺癌或结肠癌、神经胶质瘤、间皮瘤或黑素瘤。在所述应用的一个实施方式中，将siNA分子或载体与抗癌的药物相联接。本发明还涉及至少一种含有如上限定的siNA分子或载体以及抗癌药物的产品，作为组合制剂同时地、单独地或者依序地在抗癌疗法中使用。与根据本发明的SiNA分子或载体组合使用的抗癌药物是通常在化疗中使用的那些抗癌药物，并且包括细胞毒试剂，比如垸基化剂、抗有丝分裂剂和代谢拮抗剂、抗血管生成因子、酪氨酸激酶抑制剂、以及BH3-结构域模拟物。BH3模拟物是具有类似于BakBH3肽的功能的化合物，并且结合于Bcl-2家族中抗凋亡蛋白质比如Bcl-2和Bc1-Xl的疏水袋。BH3I-2'-(3-碘-5-氯-N-[2-氯-5-((4-氯代苯基)磺酰)苯基]-2-羟基苯甲酰胺)、HA14-1-(乙基-2-氨基-6-溴-4-(l-氰-2-乙氧基-2-乙氧基-2-氧乙基)-很-苯并吡喃-3-羧酸酯)、YC137-(2-甲氧基羰基氨基-4-甲基磺胺基-丁酸、4-(4,9-二氧-4,9-二氢萘[2,3-d]噻唑-2-氨基)-苯基酯)和ABT737是BH3模拟物的实施例。优选的抗癌药物是顺铂(顺式二胺二氯代铂、CDDP或DDP)、卡铂、阿霉素、培美曲塞(AIimta)、紫杉醇(Taxol)和BH3模拟物。根据本发明的siNA分子通常被用作下述肿瘤切除外科手术的辅助剂疗法。另外，根据本发明的siNA分子可以与其他包括放疗和免疫疗法在内的常规抗癌疗法组合使用。药物有效剂量是防止、抑制发生或治疗疾病或状态(在某种程度上减轻症状、优选减轻所有症状)所需要的剂量。siNA的药物有效剂量取决于癌症的类型、使用的组合物、给药途径、被治疗的哺乳动物类型、在考虑之中的特定哺乳动物的生理特征、并行的给药方法、以及医疗领域的技术人员将会考虑的其他因素。一般来讲，给药量以活性成分体重/天计，一般在1ng/kg和100mg/kg，优选在5(ig/kg和100pg/kg之间。本发明的siNA可以通过单一或多个途径给药，所述途径选自肿瘤内(intratumoral)例如脑内(鞘内、心室内)、经皮、皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹内注射、脊柱内注射(intrarachian)、口服、舌下、或吸入。当siNA分子或载体是与化疗或者放疗组合使用时，优选在抗癌剂之前给药，更优选在抗癌剂之前至少48小时给药。除前述特征外，本发明还包括其他的特征，下面参照siNA分子实施例和根据本发明的应用、以及附后的附图，将对这些特征进行描述。-图1显示了在转染72h后siXLl对于Bcl-XLtnRNA和在SKOV3细胞中蛋白质表达15的影响。[A]:RT-PCR;[B]:定量RT-PCR和[C]:Westernblot。T:未处理的细胞。-图2显示了在转染72h后siXLl对Bcl-Xi^蛋白质表达的影响，通过在各种卵巢癌细胞系[A]中和在各种来源的肿瘤细胞[B]中的Westernblot进行研究。-图3显示了在转染72h后各种浓度的siXLl[A]或对照物siRNA[B]对在SK0V3细胞中的Bcl-XL蛋白质表达的影响。-图4显示了转染后在各时间点siXLl的25nM[A]或100nM[B]对在SKOV4细胞中的Bcl-Xi^蛋白质表达的影响。-图5显示了在转染72h后在SKOV3细胞内被siXLl诱导的凋亡。A.细胞的形态学观测(左侧画面)和在DAPI染色后的细胞核(右侧画面)。B.通过Westernblot研究的胱天蛋白酶3活化和PARP解离。T:未处理的细胞。-图6显示了在转染144h后，B卩，在顺铂辐照开始96h后siXLl或对照物siRNA与顺铂辐照组合对细胞形态和凋亡诱导的影响。未转染的细胞用作对照物。或者不处理(对照物A、D、G、J、M和P)或者用5ng/mL(B、E、H、K、N和R)或20pg/mL(C、F、I、L、O禾BR)顺钼处理用siXLl(M至R)、对照物siRNA(G至L)转染的细胞或者未转染的细胞(A至E)。细胞的形态学观测A、B、C、G、H、I、M、N、以及O。在DAPI染色后的细胞核形态学观测(D、E、F、J、K、L、P、Q和R)。-图7显示了在转染144h后，B卩，在顺铂辐照开始97h后siXLl或对照物siRNA与顺铂辐照组合对细胞成活力的影响。A.暴露于5pg/mL顺铀。C5:单暴露于独的5pg/mL顺铂。siRNA对照物/C5:暴露于对照物siRNA与5tag/mL顺铂的组合。siXLl/C5:暴露于siXLl与5)ag/mL顺铂的组合。B.暴露于20iag/mL顺铂。C20:暴露于单独的20吗/mL顺铂。siRNA对照物/C20:暴露于对照物siRNA与20|ng/mL顺铂的组合。siXL1/C20:暴露于siXLl与20pg/mL顺铂的组合。-图8显示了siXLl或对照物siRNA与顺铂辐照的组合对SKOV3细胞周期的影响。未转染的细胞用作对照物。或者不处理(对照物)或者用5)ag/mL或20)ig/mL顺铂(CDDP)处理用siXLl(150nM)、对照物siRNA(150nM)转染的细胞或者未转染的细胞。对在顺铂辐照开始24h(A)或96h(B)后的细胞周期加以分析。-图9显示了siXLl或对照物siRNA与顺铂辐照的组合对Bxl-xL表达和胱天蛋白酶3活化或PARP解离的影响。未转染的细胞用作对照物。或者不处理(0)或者用5Kig/mL(5)或20ng/mL顺钼(20)处理用siXLl(150nM)、对照物siRNA(150nM)转染的细胞或者未转染的细胞。在顺铂辐照开始24h(A)或96h(B)后分析BxL-xL表达和胱天蛋白酶3活化或PARP解离情况。-图10显示了在与顺铂辐照组合或者不进行顺铂辐照的情况下在siXLl转染后SKOV3细胞的生长。在siXLl转染48h后，细胞用5吗/ml的CDDP(C5)处理2h或者不处理，并且在处理后不同的时间点通过台盼蓝排除测试(trypanblueexclusiontest)法评价细胞成活力。未转染的细胞用作对照物。结果表示为在25cn^烧瓶中活细胞的数量并且代表两次单独计数的平均值。△:未转染并且未处理的细胞。〇单独用5pg/ml的CDDP处理的未转染细胞。用siXLl转染的细胞并且未处理的细胞。X:用siXLl转染并且用5吗/mlCDDP处理的细胞。-图11显示了与对照物siRNA(siGFP)相比较，在转染72h后siRNA-Mci-K或siMc-1)对Mcl-lmRNA和在SKOV3细胞内蛋白质表达的影响。[A]:RT-PCR;[B]:Westernblot。Unt.:未处理的细胞。-图12显示了siXLl与导向抗Mcl-lmRNA的siRNA的组合的细胞毒效果。细胞用单独的siXLl(100nM)、单独的siRNA-Mcl-l(100nM)、或siXLl(50nM)与siRNA-Mcl-l(50nM)的组合转染。未转染的细胞用作对照物。细胞的形态学观测(左侧画面)。在DAPI染色后细胞核的形态学观测(右侧画面)。-图13显示了siXLl与导向抗Mcl-lmRNA的siRNA的组合的细胞毒效果。细胞用siXLl、siRNA-Mcl-l或siRNA对照物单独(150nM)转染，或者用各个上述物质(75nM)与另外两种siRNA之一(75nM)的组合转染。未转染的细胞用作对照物。通过细胞的形态学观测(左侧画面)和核的形态学观测(中间画面)以及DNA含量(右侧画面)的FACS分析，分析了在细胞转染72h后细胞的响应。-图14显示了分别耙向Bcl-XL和Mcl-lmRNA的siRNA的组合对于SKOV3细胞成活力的影响。用siXLl、耙向Mcl-lmRNA的siRNA(siMcl-l)和靶向Bcl-XL的siRNA(siXLl)单独(150nM)转染SKOV3，或者用各个上述物质(75nM)与另外两种siRNA之一(75nM)的组合转染。通过台盼蓝排除测定法分析细胞的成活力。-图15显示了承受腹内注射SKOV3肿瘤的小鼠在用siXLl或对照物siRNA与顺铂组合、或者不与顺铂组合进行治疗后的存活率。A.用siXLl治疗小鼠或者未治疗(左、右侧画面)、用CDDP单独(4mg/kg)治疗(左右侧画面)、用siXLl单独(左右侧画面)治疗；或者用siXLl和CDDP(右侧画面)的组合治疗，并且在治疗后190天的期间内确定残存小鼠的百分比。B.用对照物siRNA治疗小鼠或者未治疗(左、右侧画面)、用CDDP17单独(4mg/kg)治疗(左、右侧画面)、用对照物siRNA单独(左、右侧画面)治疗；或者用对照物siRNA和CDDP(右侧画面)的组合治疗，并且在治疗后190天的期间内确定残存小鼠的百分比。-图16显示了无保护的(naked)siXLl或通过l-PEI释放的siXLl对肿瘤生长的影响。将20"06个SK0V3人类卵巢癌细胞皮下植入裸鼠，并且允许肿瘤生长直至它们达到大约10x10mm的尺寸(在8天后)。将复合的siXLl(▲)或者未与l-PEI复合的siXLl(■)每周腹膜内注射入承受SKOV3肿瘤的小鼠，并且在肿瘤植入后不同的时间点测量肿瘤体积。具体实施例方式下述实施例用于解释本发明而并非限制本发明。实施例l:SiXLl对肿瘤细胞的影响1)材料和方法a)细胞系由ECACC或ATCC购得SKOV3、OAW42、OAW42-R10、IGROV1和IGROV1-R10人类卵巢腺癌细胞系、GL15恶性胶质瘤细胞系、以及NCI-H28间皮瘤细胞系。在补充有10%胎牛血清(GIBCO-BRL公司)、2mMGlutamax(GIBCO-BRL公司)、1mM丙酮酸钠(GIBCO-BRL公司)、20UI/L人类重组胰岛素(LILLY公司)、33mM碳酸氢钠和20mMHEPES的DMEM培养基(GIBCO-BRL公司)中培养OAW42、OAW42-R10细胞。所有其它的细胞系在补充有10%胎牛血清(GIBCO-BRL)、2mMGlutamax(GIBCO-BRL)、33mM碳酸氢钠和20mMHEPES的RPMI1640培养基(GIBCO-BRL)培养。在5%C02的湿润环境中于37°C下培养细胞，并且通过胰酶消化每周裂解两次。b)化合物从默克公司购得顺铂(CDDP，顺式二氨基二氯代铂11)。从INVITROGEN公司购得Oligofectamine试剂。以液体形式供应，并且在4。C下储存。从POLYPLUS-TRANSFECTION公司购得线性聚乙烯亚胺(Linearpolyethylenimine，L-PEI)，呈无内毒素的100mM水溶液形式，并且在使用之前在-80。C下储存。c)体外暴露于顺铂在无血清培养基中，于37。C下将处于指数生长期中的细胞暴露于CDDP2小时。在暴露于药物后，清洗细胞层，并且在完全生长培养基中孵育。d)siRNA设计和转染与标靶mRNA同源、具特异性双链的19个核苷酸的RNA序列被用于沉默Bcl-xl和Mcl-l表达。标注为siXLl、用于阻断Bcl-xl表达的双链RNA序列是正义5'-auuggugagucggaucgcatt-3，(SEQIDNO:5)*反义5'-ugcgauccgacucaccaautt-3，(SEQIDNO:6)Mcl-l特异性的siRNA的序列是正义5'-gugccuuuguggcuaaacatt-3'(SEQIDNO:7)*反义5'-uguuuagccacaaaggcacct-3'(SEQIDNO:8)对照物siRNA的序列是正义5'隱gacgugggacugaaggggutt-3'(SEQIDNO:9)*反义.'5'-accccuucagucccacguctt-3'(SEQIDNO:10)对照物siRNA不具有任何与有关人类基因的同源性(Duxbury等、2003，参见前述)。选择性地siXLl靶向Bcl-XLmRNA，但是不靶向Bcl-XsmRNA。该siRNAMcl-l选择性地靶向长的Mcl-lmRNA同工型。siRNAs由Eurogentec公司合成、HPLC纯化和退火。通过使用Oligofectamine试剂和Opti-MEM(INVITROGENLIFETECHNOLOGIES公司)，按照推荐的步骤进行siRNA双链的转染。在具有不同浓度的siXU、siRNAMcl-l或者siRNA对照物25cn^烧瓶内转染30-40。/。融合的细胞，并且于37。C、5%<:02下孵育4小时。接着，添加20%胎牛血清，直至在25!12烧瓶中达到10%胎牛血清的终浓度。e)RT-PCR在厂商推荐的第一次链反应条件下，使用200单位的Omniscript逆转录酶(QIAGEN)，将通过RNAeasy试剂盒(QIAGEN公司)提取的1mg的总RNA进行逆转录。通过使用下述引物对Bc1-Xl/S正向5'-ttggacaatggactggttga-3'(SEQIDNO:11)和Bc1-Xl/S反向5'-gtagagtggatggtcagtg-3'(SEQIDNO:12;Bargoue/a/"Int.J.Cancer,1995,16，854-859)，扩增标靶cDNA。并且在下述的循环条件下扩增在MastercycleurGradient(EPPENDORF公司)内，94。C预保温5min;然后94。C下40秒、58°C下60秒并且72°C下40秒，30个循环；72°C下后保温3min。这些引物的使用允许Bcl-Xs和Bcl-X^的PCR产物作为两个不同的带子迁移，分别为576bp和765bp。f)实时RT-PCR在厂商推荐的第一次链反应条件下，使用200单位的Omniscript逆转录酶(QIAGEN公司)，将通过RNAeasy试剂盒(QIAGEN公司)提取的1mg的总RNA进行逆转录。将19甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)用于归一化Bcl-Xi表达。借助于通过使用引物表达应用-基础引物设计软件(PERKINELMERAPPLYBIOSYSTEM)筛选的引物和Taqman-MGB探针，扩增Bcl-XL和GAPDHcDNA。对于Bc1-Xl，与下述序列5'-FAM-agatgcaggtattggtg-TAMRA-3'(SEQIDNO:15)所表示的Taqman-MGB探针一起，使用具有下述序列的引物5'-tgcgtggaaagcgtagacaa-3'(SEQIDNO:13)禾B5'陽aggtaagtggccatccaagct陽3'(SEQIDNO:14)。对于GAPDH，与下述序列5'-VIC-catcaatggaaatccca-TAMRA-3'(SEQIDNO:18)所表示的Taqman-MGB探针一起，使用具有下述序列的引物5'-gcaccgtcaaggctgagaac-3'(SEQIDNO:16)和5'-tctcgctcctggaagatggt-3'(SEQIDNO:17)。生物技术信息国家中心(NCBI)数据库的基础局部排列检索工具(BLAST)搜索显示，引物和探针序列与任何其他已知的人类基因没有同源性。相对被选为标准的未处理的对照样品来表示数据。使用TaqMan技术(ABIPRISM7000，PEAPPLYBIOSYSTEM)，通过定量RT-PCR独立地测量Bcl-XLmRNA和GAPDHmRNA表达。对于各PCR，用含有dNTP、HotGoldstarDNA聚合酶、5mMMgCl2、UNG禾BROX的2x反应缓冲液(qPCRMastermix，EUROGENTEC公司)制备母液混合物(MasterMix)。对于Bcl-Xt用400nM的各个引物和100nM适当的探针进行PCR;对于GAPDH用800nM的各个引物和100nM适当的探针进行PCR。将5nL各个稀释的cDNA添加至20的PCRMasterMix。热循环条件包括初始的50。C下UNG保温2min、在95°C下HotGoldstarDNA聚合酶活化10min、50个循环的95°C下变性15秒、以及在60°C下退火/扩增1min。对于GAPDH和Bcl-XL，每一轮运行包括标准曲线的五个点，所有标准样品、实验样品、以及非模板对照物皆为一式三份。对Bcl-xl和用五倍递减稀释的Jurkat细胞cDNA表达Bcl-XL的GAPDHcDNA绘制标准曲线。将阈值循环(CT)用于碗定BcI-Xl和GAPDHmRNA的量(Q)。依下式Bcl-XL表达=(QBcI-Xl/QGAPDH)样品/(QBc1-Xl/QGAPDH)标准，计算出Bcl-xl相对表达式。用购自APPLYBIOSYSTEM的SDS2.0软件分析结果。g)Westernblotting细胞用冰冷的PBS清洗，并且在冰上，在150mMNaCl、50mMTRIS-HC1pH8、1%Tritonx100、4mMPMSF、2mM抑肽酶、5mMEDTA、10mMNaF、10mMNaPPi、1mMNa3V04中裂解30min。通过在4°C下10,000g离心10min澄清裂解液，并且通过使用Bradford测定法(Bio-Rad公司)确定蛋白质浓度。将等量的总细胞蛋白质(20pg)溶解于Bis-tris-HCL缓冲液(pH6.4)中，4-12%聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGENovex4-12%Bis-tris凝胶，INVITROGEN公司)在200V下电泳35min，并且在30V下75min电转印至PVDF膜(MILLIPORE公司)上。在室温下，将膜在补充有5%脱脂奶粉的T-TBS(132mMNaCl，20mMTRIS-HC1pH7.6，0.05%吐温20)中封闭1小时。在室温下，将薄膜在T-TBS-乳中用下述初级抗体孵育1小时抗Bc1-Xl/S(1:500，S18SANTA-CRUZBIOTECHNOLOGY公司)、抗PARP":1000，CELL-SIGNALINGTECHNOLOGY公司)、抗胱天蛋白酶-3(1:1000，BDBIOSCIENCESPHARMINGEN公司)、抗裂解胱天蛋白酶-3(1:1000，CELL-SIGNALINGTECHNOLOGY公司)、抗a-微管蛋白(1:3000，SIGMA公司)和抗Mcl-l(1:750，S19SANTA-CRUZBIOTECHNOLOGY公司)。在用T-TBS洗涤三次后，在室温下，将薄膜在具有足够过氧化物酶结合的二次抗体(抗兔IgG，CELL-SIGNALINGTECHNOLOGY公司；以及抗小鼠IgG、AMERSHAM公司)的T-TBS-乳中孵育1h。在用T-TBS洗涤3次并且用TBS洗涤一次后，通过增强化学发光(ECL试剂盒，AMERSHAM公司)检测免疫反应性。h)用二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)通过核染色的凋亡细胞的形态学表征在处理后，独立地收集分离的细胞，并且通过胰蛋白酶/EDTA分离粘附细胞。然后汇聚粘附细胞和分离细胞，并且在70%乙醇固定之前于1500xg下离心5min。然后在1ng/ml的DAPI水溶液(勃林格殷格瀚)中室温孵育30min之前，通过细胞离心(cytocentrifugation)在有聚赖氨酸涂层的玻璃载玻片上收集细胞。此后在蒸馏水中大范围地洗涤载玻片，并且安放在Mowiol(上CALBIO-CHEM公司)。i)DNA细胞含量的流式细胞分析潘扁劍备在处理后，分别收集分离细胞。然后通过胰蛋白酶/EDTA分解收集粘附的细胞。然后汇聚粘附细胞和分离细胞成，并且在70。/。乙醇固定之前将其在PBS中洗涤，并且在-20。C下储存直至分析。在流式细胞分析之前，将细胞在PBS中洗涤，并且于室温下在PBS中孵育30min，以便允许低分子量(m.w.)DNA的释放、凋亡细胞的表征。在4000g离心10min后，将细胞团再悬浮，并且通过使用DNAPrepCoulterReagent试剂盒(贝克曼考尔特公司)用碘化丙啶(PI)以1()s个细胞/mL的终浓度染色。汉器没定通过使用配备有氩激光器的EPICSXL流动血细胞计数器(贝克曼考尔特公司)，在15mW下对样品进行分析。通过使用488nM激惹(excitation),分析了PI染色的细胞。将620nM带通滤波器放在PI的红色荧光上。将计算机化门控(gating)施加在侧面和前向散射上以排除非常小的碎片，并且施加在脉冲宽度和红色荧光积分峰值上以消除聚集。以低于每秒100次发生概率、并且具有30psi壳压力的低流速分析了所有样品。教薪分析-'运行EXP032Acquisition软件(贝克曼考尔特公司)，用于获得数据。2)结果a)siXLl对Bcl-Xt表达、细胞生长速率和凋亡诱导的影响。在各种肿瘤细胞系中对可选择性地耙向Bc1-XlmRNA、但是不靶向Bcl-XsmRNA的siXLl的效果进行测试。如同RT-PCR分析显示的那样(图1A)，用siXLl处理的SKOV3细胞大大地降低了Bcl-XLmRNA水平。定量RT-PCR分析显示Bcl-XLmRNA水平下降了60%至70%(图1B)。在siXLl转染24小时后，BcL-XL蛋白质表达被降低了，并且在72小时后全部消失(图1C)。在测试的下述各种肿瘤细胞系中观察到Bcl-XL蛋白质表达的消失卵巢癌细胞、恶性胶质瘤细胞或间皮瘤细胞(图2A&B)。由siXU造成的Bcl-XL蛋白质表达的消失是依赖剂量的(图3A)。在用对照物siRNA处理的细胞中没有检测到对Bcl-X^表达的影响(图3B)。Bcl-Xt蛋白质表达消失的动力学显示，在用100nM的siXLl处理72小时后有最大的减小(图4)，并且从144小时以后Bcl-XL蛋白质表达会再次出现。在用较低剂量siXLl(25nM)处理的细胞中，该效果被大大地降低并且延迟(图4)。siXLl在SKOV3细胞内诱导了适度的凋亡，如细胞形态学和核形态学(图5A)、以及通过Westernblotting检测的胱天蛋白酶3裂解情况(图5B)所示。该裂解增加得和Bcl-XL蛋白质表达下降得一样多。b)siXLl/顺铂组合体外对SKOV3细胞的影响。在暴露于顺铂和siXLl的组合数天以后，细胞死亡率大大增高。在单独暴露于顺铂的情况下，在细胞周期进展中仅诱导了瞬时的捕获(5和20ng/mL)。在24小时后可检测到轻度影响，反之在暴露于siXLl与顺铂的组合4天后观察到大量的细胞死亡；活细胞显示与未处理的细胞相比小于10%(图6、图7和图8)。基因表达分析(图9)显示，顺铂在使用的浓度(5和20ng/mL)下对Bcl-Xi蛋白质表达没有影响，反之在暴露于顺铂和siXLl的组合24小时后(在siRNA转染72小时后)，Bcl-XL表达差不多完全消失。该表达的改进是瞬时的，因为在顺铂辐照96小时后(在转染144小时后)，Bcl-Xi表达会再现。尽管如此，表达被siXLl与较高剂量顺铂(20^g/mL)的组合大大地抑制了，不能检测到Bcl-XL蛋白质表达，即使在最长的时间后。如同胱天蛋白酶3活化和PARP裂解检测情况显示的那样，凋亡诱导被siXLl与顺铂的组合大大地放大了。在单独暴露于顺铂24h后，无论使用什么样的浓度，都未检测到凋亡迹象。通过对比，在暴露于siXLl的细胞中，可检测到胱天蛋白酶3和PARP裂解，该裂解在用20|ag/mL顺铂和siXLl共同处理的细胞中被放大了。在暴露于顺铂96h后，可清楚地检测到该差异，当顺铂与siXLl结合时，胱天蛋白酶3活化和PARP裂解达到它们的最大量。这些结果证实了形态学的观测(图6和7)和细胞周期的FACS分析(图8)，表明单独的顺铂诱导出低水平的细胞死亡或者没有细胞死亡，无论其使用什么样的浓度(仅观察到抑制细胞效应，归因于在S和G2阶段的瞬时捕获)；反之单独的siXLl通过程序性细胞死亡可诱导适度的细胞死亡。然而，取决于时间，siXLl与顺铂的组合诱导出大量的细胞死亡，并且对于顺铂剂量而言诱导至较少的程度。siXLl/顺铂组合的细胞毒效果非常强，甚至在最低的顺铂剂量(5(ag/mL)下，并且对于20pg/mL的顺铂剂量，在治疗开始一周后肿瘤群体的破坏差不多是完全的。该效果是特异性的，因为对照物siRNA没有诱导出顺铂影响的变化。另外，图10显示，siXLl与低剂量顺铂(5ng/mL)的结合可在SKOV3细胞内诱导高死亡率和体外强烈延迟的肿瘤复发。这些结果显示，所选择的siRNA序列siXLl可非常有效地抑制Bc1-Xl^mRNA和蛋白质表达，并且在极富攻击性的、并对顺铂有高度抗性的卵巢肿瘤细胞系内强烈地增加顺铂的细胞毒活性。该siXLl效果是特异性的，持续96小时，并且siXLl的最佳浓度是150nM。c)siMcl-l体外对SKOV3细胞内Mcl-l表达的影响。用siMcl-l处理SKOV3细胞可几乎完全地降低Mcl-lmRNA表达，如同RT-PCR分析显示的那样(图11A)。在72小时后，BcL-l蛋白质表达全部消失(图11B)。由siXLl造成的Mcl-l蛋白质表达的消失是取决于剂量的(图UB)。在用siGFP对照物siRNA处理的细胞中没有检测到对Mcl-l表达的影响(图IIA和IIB)。d)siXLl/siRNAMcl-l组合体外对SKOV3细胞的影响。暴露于siXLl与被导向抗Mcl-lmRNA的siRNA的组合可在各个siRNA不产生细胞毒效果(50nM;图12)或仅产生轻微细胞毒效果(图13和图14)的浓度下，在SKOV3细胞上产生细胞毒效果(缺少顺铂辐昭)。细胞形态学和核的形态学的观察、以及细胞周期分析(图13)显示，在未转染的SKOV3细胞和用siMcl-l或对照物siRNA单独地(各150nM)或组合地(各75nM)转染的SKOV3细胞之间没有差别。观察到生长速率的轻微下降(20%至40%)。23在相同的条件下，用siXLl单独地(各150nM)或与对照物siRNA结合地(各75nM)转染的SK0V3细胞可显示适度的凋亡，正如通过核的分裂和凝聚、以及细胞成活力的下降(图13和图14)显示的那样。通过比较，siXLl与siMcl-l(各75nM)的组合可诱导大量的细胞脱离和细胞死亡，如同细胞形态学、由凋亡引起的细胞死亡及重要的前G1pic(图13和图14)的许多核特征的存在所显示的那样。实施例2:siXL2对卵巢肿瘤的影响1)材料和方法a)腿从CHARLES-RIVERLABORATORIES购得4周大的雌性Swiss/裸鼠，并且在无病原体的环境中供养。用标准实验室饵料和随意的自来水喂养该小鼠，并且保持环境为23±1。C，12h光照/黑暗循环。本研究中的动物试验遵照欧盟实验动物科学委员会的方针进行。b)PEI/siRNA复合物形成和给药在5。/。葡萄糖溶液中制备PEI/siRNA复合物，L-PEI氮对siRNA磷酸酯的比率为5:l。不同量的siRNA(125、625或2500ng)和L-PEI被独立地稀释，然后将PEI添加至siRNA。溶液被迅速地均质化，并且在室温下静置15min。将其作为0.5mL的5y。葡萄糖溶液腹膜内注射入小鼠体内。c)肿瘤细胞腹内注射植入小鼠体内并且注射siRNA将含2x1(^个卵巢腺癌SKOV3的细胞腹膜内植入6-8周大的小鼠体内。如前所述，这些模型可反映晚期卵巢癌的腹腔注射(i.p)生长模式(Louis"a/.,CancerGeneTher叩y,2006,13,367-374)。cl)小鼠存活率分析在肿瘤植入21天后，将小鼠分配入总结于表II的八个治疗组(每组10只小鼠)之一:-第1组包括未治疗的动物。-第2组接受了在1mL0.9%NaCl溶液中4|ag/kg顺铂的腹膜内注射。-第3组接受了在lmL0.9%NaCl溶液中25pg/kg对照物siRNA的腹膜内注射。-第4组接受了在lmL0.9%NaCl溶液中25吗/kgBcl-XLsiRNA的腹膜内注射。-第5组接受了在lmL0.9%NaCl溶液中25pg/kg对照物siRNA的腹膜内注射，并且第二天接受了在lmL0.9%NaCl溶液中4ng/kg顺铂的腹膜内注射。-第6组接受了在lmL0.9%NaCl溶液中4ng/kg顺铂的腹膜内注射，并且第二天接受了在lmL0.9%NaCl溶液中25|iig/kg对照物siRNA的腹膜内注射。-第7组接受了在lmL0.9%NaCl溶液中25pg/kgBcl-XLsiRNA的腹膜内注射，并且第二天接受了在lmL0.9n/。NaCl溶液中4pg/kg顺铂的腹膜内注射。-第8组接受了在lmL0.9%NaCl溶液中4|ag/kg顺铂的腹膜内注射，并且第二天接受了在lmL0.9%NaCl溶液中25ng/kgBcl-XLsiRNA的腹膜内注射。一个月后重复相同的治疗。当认为垂死时，杀死小鼠并解剖尸体。将器官和肿瘤进行福尔马林固定和石蜡包埋，用于组织学检査。在实验结束时，杀死所有的残存动物，并且进行组织学检査以便检测残留的肿瘤节。表II:治疗方案组治疗1未经治疗24吗/kg顺铂25pg/kg对照物siRNA425|ng/kgBcl-XLsiRNA25pg/kg对照物siRNA+4pg/kg顺铂64吗/kg顺铂+25吗/kg对照物siRNA725pg/kgBcl-XLsiRNA+4吗/kg顺铂84(ag/kg顺钼+25|ng/kgBcl-XLsiRNAcl)在SK0V3肿瘤节中siRNA释放对Bcl-X^表达的影响在腹膜的癌扩散发展后，用5、25或100|ag/kgsiXLl无保护地或者与PEI复合地对动物进行腹膜注射内。在转染3天后杀死小鼠，并且用盐水溶液洗涤各个器官(肾、肝脏、脾、胰腺、卵巢、腹膜、横隔膜、肺、心脏和骨骼肌)。各个器官部分或者在液氮中冷冻并在-80°C下储存以用于RT-PCR和Westernblot分析，或者进行福尔马林固定和石蜡包埋以用于组织学检查和免疫组织化学分析。d)肿瘤细胞皮下注射植入小鼠体内并且注射siRNA将SKOV3细胞(2xl(^个/500nL)皮下接种入裸鼠右侧侧腹，并且确定产生了明显的肿瘤。按公式v:丄x尸x兀/6计算出体积肿瘤，其中L和1显示了用数字式卡钳经每周两次测量的较大和较小的肿瘤直径。当肿瘤达到平均体积约100mm3(第10天)时，对三个实验组(每组三个小鼠)测试如下(a)未经治疗，(b)无保护的siXLl(25|ag/kg)、以25及(c)siXLl-PEI(25吗/kg)。在0.5mL0.9%NaCl溶液(无保护的siRNA)中或者在0.5mL的5。/。葡萄糖溶液(siRNA-PEI)中稀释样本，并且进行腹膜内注射。该步骤每周重复一词。e)免疫组织化学对石蜡包埋的材料进行免疫组织化学染色。为进行免疫染色，将4jam厚的部分脱蜡、再水化，并且通过在0.1MpH6柠檬酸盐缓冲液中高温加热抗原恢复技术(high-temperature-heatingantigenretrievaltechnique)处理30分钟，以暴露表位。将这些部分在室温下与从SantaCruz(TEBU-BIO公司)购得的多克隆抗体抗BcI-Xl/S(S18)—起孵育1小时，并且以1:50的比例稀释。在洗涤后，根据厂商说明书将载玻片用RabbitIgGVectastainABC试剂盒(VECTOR,ABCYS)保温。用DAB色原体系(DAKO公司)显示染色，并且这些部分用苏木精进行对比染色。2)结果在人类卵巢癌的小鼠模型上测试siXLl的体内效果。在这些模型中，通过将SKOV3人类卵巢肿瘤细胞腹膜内注射入裸鼠，诱导腹膜人类卵巢腺癌。a)无保护的siRNA注射结果表明，siXLl极大地增加了小鼠存活率(在siXLl治疗组中，130天时的存活率为60%，相对照地，未经治疗的小鼠存活率为10%)，反之，顺铂治疗不会提高存活率(图15)。然而，与体外观察的结果相反，siXLl与顺铂的组合产生了类似于单独使用siXLl的体内效果；与单独的siXLl相比，siXLl与顺铂的组合不会提高小鼠存活率。值得注意的是，siRNA剂量和注射的次数(间隔28天注射)与在其他研究中的情况(每天大剂量siRNA或者每周若干次)相比非常低。该效果是特异性的，因为对照物siRNA不会提高小鼠存活率。在用siXLl治疗的组中，小鼠或者如同对照小鼠(小鼠的50%)那样在相同的间隔处死去，或者被治愈，正如在150天后小鼠尸检显示的那样，50%的小鼠体内没有残留的肿瘤。曲线的第一个一半在不同组中是相同的，表明siRNA效果可以被限制于极小的肿瘤根瘤，这或许归因于siXLl在血管内皮细胞上的直接效应。通过对比，在注射siXLl时具有较大肿瘤的小鼠在这些条件下(无保护的siRNA给药)对siXLl治疗的敏感度较低，并且它们的存活率类似于未经治疗的组的情况。小鼠之间的肿瘤发展不均匀性在该模型中可以如此解释这些结果，因为在未治疗组中在第一次死亡小鼠和最后的小鼠之间有一个月的延迟。通过在SKOV3腹膜肿瘤节中的Bcl-Xt蛋白质的免疫组织化学分析，显示了siRNA在其标耙上的分子效应。未治疗的小鼠肿瘤有较高的Bcl-Xt表达，尽管有相对的内部和内部个体变化性。用不同量的无保护的siXLl(5、25或100ng/mL)治疗的小鼠显示了具有一些节的相对的内部和内部个体变化性，这些节显示出较高的BcK^表达水平，而其他节显示出降低的Bcl-X^表达水平。尽管如此，当siXLl剂量增加时，标记强度降低，表明了siRNA的剂量影响。b)siRNA/PEI复合物注射在用siXLl无保护地或与L-PEI复合治疗的小鼠体内，SKOV3腹膜肿瘤节内的Bcl-X^蛋白质的免疫组织化学分析显示，在用siXLl/L-PEI复合物治疗的小鼠体内，忌体Bc1-Xl蛋白质表达水平与用无保护的siXLl治疗的小鼠相比是较低的。这些结果表明，siXLl通过载体(L-PEI:线性聚乙烯亚胺)的释药可以提高其体内活性。上述结论通过皮下注射肿瘤生长分析得到证实，表明用PEI释放并且腹膜内注射的siXU可以抑制肿瘤生长至少45天；反之，注射的无保护的siXLl在相同条件下差不多没有影响，因为肿瘤生长差不多类似于未经治疗的小鼠(图16)。权利要求1.一种对Bcl-XL转录产物有特异性的双链短干扰核酸分子，其包含正义区域和反义区域，其中，所述正义区域包含核苷酸序列SEQIDNO1或与所述序列具有至少70％一致性、优选至少80％一致性、更优选至少90％一致性的序列，所述反义区域包含与所述正义区域互补的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，各个链包含15至约30个核苷酸，并且各个链包含至少15至约30个与所述其他链的核苷酸互补的核苷酸。3.如权利要求2所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其包括具有19至21个核苷酸的双链。4.如权利要求1至3中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其包含核糖核苷酸。5.如权利要求1至4中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，所述正义区域包含核苷酸序列SEQIDNQ:1，所述反义区域包含核苷酸序列SEQIDNO:4。6.如权利要求1至5中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其在各个链的3'端包含1至约3个悬垂的核苷酸。7.如权利要求6所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其由序列SEQIDNO:5的正义链和序列SEQIDNO:6的反义链组成。8.如权利要求1至5中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其包含平端。9.如权利要求1至8中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其由两个单独的低聚核苷酸片段组装而成，其中，一个片段包含所述正义区域，而第二个片段包含所述短干扰核酸分子的反义区域。10.如权利要求1至8中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，所述正义区域通过连接物分子与所述反义区域相连接。11.如权利要求1至10中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其包含一种以上修饰的嘧啶核苷酸和/或嘌呤核苷酸。12.如权利要求1至11中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，所述包含正义区域的链包括在5'端/或3'-端的端帽部分。13.如权利要求1至12中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，包含所述反义区域的链包括在5'-端的磷酸基。14.如权利要求1至13中任一项所述的双链短干扰核酸分子，其特征在于，其包含至少一种经修饰的核苷酸间连接物。15.—种转录单元，其包含转录起始区域、转录终止区域、以及编码至少一个如权利要求1至10中任一项所述的短干扰核酸分子的核酸序列，其中所述核酸序列被以允许表达和/或释放所述短干扰核酸分子的方式而可操作地连接于所述起始区域。16.—种包含如权利要求15所述的转录单元的表达载体。17.—种被如权利要求16所述的载体修饰的细胞。18.—种药物组合物，其在可接受的载体中至少包含如权利要求1至14中任一项所述的短干扰核酸分子或者如权利要求16所述的表达载体。19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，其包括至少两种不同的短干扰核酸分子的组合。20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，其包括靶向所述Mcl-l转录产物的短干扰核酸分子。21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，靶向所述Mcl-l转录产物的所述短干扰核酸分子分别由序列SEQIDNO:7、19、21的正义链和序列SEQIDNO:8、20、22的反义链组成。22.如权利要求18至21中任一项所述的组合物，其特征在于，所述短干扰核酸分子或者载体与至少一种抗癌药物相联接。23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述抗癌药物选自下面构成的组细胞毒试剂、抗血管生成因子、酪氨酸激酶抑制剂以及BH3模拟物。24.如权利要求1至14中任一项所述的短干扰核酸分子或者如权利要求16所述的载体用作药物。25.如权利要求1至14中任一项所述的短干扰核酸分子或如权利要求16所述的载体在癌症治疗用药物的制造上的应用。26.如权利要求1至14中任一项所述的短干扰核酸分子或者如权利要求16所述的载体与如权利要求20或21所述的短干扰核酸分子在癌症治疗用细胞毒药物的制造上的组合的应用。27.如权利要求25或26所述的应用，其特征在于，所述癌症选自下述构成的组卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌、神经胶质瘤、间皮瘤以及黑素瘤。28.—种至少含有如权利要求1至14中任一项所述的短干扰核酸分子或如权利要求16所述的载体的产品以及抗癌药物，其作为组合制剂同时地、单独地或者依序地在抗癌疗法中使用。29.如权利要求28所述的产物，其特征在于，在使用所述抗癌药物之前使用所述短干扰核酸分子。全文摘要本发明涉及一种对Bcl-X_L转录产物有特异性的双链短干扰核酸(siNA)分子，其包含正义区域和反义区域，其中，正义区域包含核苷酸序列SEQIDNO1或与所述序列具有至少70％一致性的序列、优选至少80％一致性的序列、更优选至少90％一致性的序列；而反义区域包含与正义区域互补的核苷酸序列。本发明还涉及其用于治疗癌症的应用。文档编号C12N15/11GK101522898SQ200780030484公开日2009年9月2日申请日期2007年6月22日优先权日2006年6月26日发明者埃斯泰·赛松·贝毛拉斯,埃米莉·布罗坦,帕斯卡尔·戈迪雄,洛朗·普兰申请人:弗朗索瓦-巴克拉斯抗癌中心