专利名称：：舌癌的判定方法
技术领域：
：本发明涉及判定舌癌的恶性度的舌癌的判定方法。
背景技术：
：舌癌在口腔癌中发病率最高，出现淋巴结转移的频率也高，还有报道称，舌癌的5年生存率在转移阴性病例中为50%左右，在包括迟发转移的阳性病例中为11%左右(非专利文献1)。此外，在临床病程中存在比以其它部位为原发部位的口腔鳞状上皮癌更早地发生转移的倾向。因此，不论肿瘤的大小，正确地判定舌癌的恶性度，决定基于该判定的治疗方针不仅从癌的控制的角度，从受到治疗后的摄食吞咽和发音障碍的影响的QOL的角度来看也是重要的。目前，作为舌癌的预后的推定因子，采用病理组织学上的分化度(非专利文献2)、浸润性(非专利文献2)、淋巴结转移(非专利文献2和3)、原发性病灶的大小(非专利文献2)、血清中的肿瘤标记(非专利文献4)等。非专利文献l:JanNyman等舌癌的局部控制和生存的预后因子(Prognoticfactorsforlocalcontrolandsurvivalofcanceroftheora1tongue).ActOncologia;1993:677-73非专利文献2:KurokawaH等舌鳞状细胞癌的深度浸润前沿的组织学分级的高予页后值(Thehighprognosticvalueofthehistologicgradeatthedeepinvasivefrontoftonguesquamouscellcarcinoma).JOralPatholMed2005:34:329-33非专利文献3:0kamotoM等1/1I期舌鳞状细胞癌患者的迟发性颈部转移的予页测(PredictionofdelayedneckmetastasisinpatientswithstageI/IIsquamouscellcarcinomaofthetongue).JOralPatholMed2002:15:227-2335非专利文献4:XinHuang等舌癌中的舌鳞状细胞癌抗原1的血清蛋白质组学石开究(Serumproteoraicsstudyofthesquamouscellcarcinomaantigenlintonguecancer).J.oraloncology.2006Jan;42(1):25-30发明的揭示然而，病理组织学的检査方法虽然可以通过癌组织的形态分析来了解口腔癌的存在，但缺乏关于其生物学性质的客观信息和可靠性，在实际的治疗法的决定上，并不是足以作为生物学性质(恶性度)涉及许多方面的口腔癌的独立信息源的检查方法。另外，采用肿瘤标记的检查方法虽然是客观的定量数据，但停留于检查时掌握病理状态，假阳性或假阴性的频率高，作为用于决定治疗法的信息的可靠性不足。于是，近年来期待可在分子水平上对肿瘤的特性进行特征化的生物标记的实用化，但具体的判定系统的构建尚未完成。目前，作为候选的口腔癌的分子生物学的生物标记，可以例举基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase)家族、钙粘着蛋白(cadherin)家族、整联蛋白(integrin)家族等。如上所述，舌癌的预后和转归在流行病学上与淋巴结转移的数量有密切关系，在预测肿瘤的恶性度方面是单纯且现实的指标。因此，通过使用前述的参与组织改造、细胞粘着、细胞运动或血管新生等的适当的分子作为生物标记，可以实现未发生转移的更早期的阶段的舌癌恶性度的精确判定。而且，若在早期精确掌握癌的生物学性质，则可以实现与之相应的最适的治疗，带来非常大的好处。但是，目前还没有采用基因表达水平的舌癌的恶性度判定的实用例。于是，本发明的目的在于提供通过使用整联蛋白家族基因作为生物标记，测定整联蛋白家族基因的mRNA量，从而可以更客观且正确地判定舌癌的恶性度的舌癌的判定方法。本发明人事先进行的口腔鳞状上皮癌的微阵列基因表达分析的结果中，整联蛋白a3和整联蛋白04显示出在转移阳性肿瘤中表达显著较高的倾向。整联蛋白(ITG)具有由a链和0链构成的跨膜型的异源二聚体的结构，是连结细胞质和细胞外基质的受体。细胞膜表面的ITG作为纤连蛋白、胶原或层粘连蛋白等细胞外基质蛋白的受体或者参与血小板或白细胞的连接的受体而形成超家族。目前，ITG在人类中克隆了18种a链、8种0链，作为a链和P链组合而成的受体确认了24种。各种受体的细胞外结构域(domain:与特定的细胞外基质形成特异性的结合。a链、3链都有90%为细胞外结构域，在剩下的较短的细胞内结构域上介以踝蛋白、桩蛋白、a-辅肌动蛋白等细胞内锚定蛋白结合有细胞骨架的肌动蛋白纤维。己知ITG在起到连结细胞外配体和细胞骨架的连接分子的作用的同时，对于来自细胞外基质的信号传递，通过引发酪氨酸磷酸化、细胞内钙浓度的变化、肌醇磷脂的合成、细胞周期蛋白的合成、早期基因的表达来参与细胞运动和细胞的增殖、分化、凋亡。除此之外，还报道了通过阻断ITG和配体间的反应而实现的细胞分化和凋亡的抑制。肿瘤组织中，已知ITG分子的分布为适应高浸润，转移能力而失去规律性。如果综合考虑这些方面，可以预想ITG介导的连接和信号传递的无序化以各种各样的形式参与到肿瘤细胞的产生、增殖、凋亡、运动性、浸润性等病理状态中。于是，本发明人基于事先的微阵列基因表达分析的结果，作为舌鳞状上皮癌的转移性和生存预后的生物标记候选分子，着眼于整联蛋白家族基因。对于至此为止被报道参与肿瘤细胞的连接、运动、分化的控制机制的ITGa-1、-2、-3、-5、-6、-v和ITGP-1、-3、-4、-5、-6，进行了采用实时PCR法的基因表达定量分析。另外，肿瘤组织具有包括肿瘤细胞和位于周围的癌间质(cancerstroma)中的成纤维细胞、炎症类细胞等多种细胞的细胞构成。所以，预想癌组织的细胞构成对所定量的基因的mRNA量的影响较大。因此，在生物标记的分析中重要的是利用适当的基因的m脂A量将ITG基因表达水平的标准化。作为候选的用于标准化的分子，不仅可以是所谓的持家基因，也同样可以对如下的基因进行定量编码上皮细胞骨架的KRT5，编码锚定蛋白的JUP、PLEC1、PXN，编码针对ITG的配体(Ligand)分子的LAMA3、LAMA4、LAMA5、Col1A1、VTN。另外，尝试了通过以功能性的或组织内局部存在的间接相关的基因的mRNA量将ITG基因的mRNA量标准化，从而避免因上述的临床样本的偏差而导致的问题。如上所述，鉴于上述课题而认真研究后发现，测定整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量，通过两者的比值将整联蛋白家族基因的mRNA量标准化，根据所得的数值可以客观且正确地判定舌癌的恶性度，从而想到了本发明。本发明提供舌癌的判定方法，其特征在于，测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量，根据整联蛋白家族基因的mRNA量/对照基因的m脂A量的比值来判定舌癌的恶性度。本发明的舌癌的判定方法中的所述整联蛋白家族基因可以是整联蛋白a3、整联蛋白P4、整联蛋白P5中的至少一种。本发明的舌癌的判定方法中的所述整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的测定可以通过实时PCR法进行。本发明的舌癌的判定方法中的所述整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的测定可以通过脂A印迹法或固相杂交法进行。本发明的舌癌的判定方法中的所述对照基因可以是持家基因、细胞骨架分子基因、锚定蛋白基因、细胞外基质基因中的至少一种。本发明的舌癌的判定方法中的所述对照基因可以是ACTB。本发明的舌癌的判定方法中的所述对照基因可以是KRT5。本发明的舌癌的判定方法中的所述对照基因可以是JUP和/或PXN。本发明的判定方法可以是舌鳞状上皮癌的判定方法。本发明提供舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，包括测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的步骤，以及将整联蛋白家族基因的m脂A量/对照基因的mRNA量的比值与临床数据进行关联的步骤。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述临床数据可以是选自T匪分期、Y-K分类、对化学疗法的反应、对放射线疗法的反应、预后的1种或2种以上的数据。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的测定可以通过实时PCR法进行。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的测定可以通过RNA印迹法或固相杂交法进行。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述整联蛋白家族基因可以是整联蛋白a3、整联蛋白P4、整联蛋白P5中的至少一种。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述对照基因可以是持家基因、细胞骨架分子基因、锚定蛋白基因、细胞外基质基因中的至少一种。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述对照基因可以是ACTB。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述对照基因可以是KRT5。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述对照基因可以是JUP和/或PXN。本发明的舌癌组织标本的分析方法中的所述舌癌可以是舌鳞状上皮癌。本发明提供舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于进行选自整联蛋白a3、整联蛋白04和整联蛋白35的1个或2个以上的整联蛋白家族基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的引物对，用于进行选自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l个或2个以上的对照基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的引物对，以及说明本发明的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。本发明提供舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于进行选自整联蛋白a3及KRT5、整联蛋白a3及JUP、整联蛋白34及JUP、整联蛋白P4及KRT、整联蛋白P5及ACTB、整联蛋白05及PXN的l组或2组以上的整联蛋白家族基因及对照基因的组合在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的引物对的组合，以及说明本发明的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。本发明提供舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于进行选自整联蛋白a3、整联蛋白P4和整联蛋白35的1个或2个以上的整联蛋白家族基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的探针，用于进行选自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l个或2个以上的对照基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的探针，以及说明本发明的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。本发明提供舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于进行选自整联蛋白a3及KRT5、整联蛋白a3及JUP、整联蛋白04及JUP、整联蛋白P4及KRT、整联蛋白P5及ACTB、整联蛋白05及PXN的1组或2组以上的整联蛋白家族基因及对照基因的组合在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的引物对，以及说明本发明的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。如果采用本发明的舌癌的判定方法，则测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因和对照基因的表达量、即mRNA量，根据两者的比值，可以客观且正确地判定舌癌、特别是舌鳞状上皮癌的恶性度。如果釆用舌癌组织标本的分析方法，则通过将舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因的mRNA量/对照基因的mRNA量的比值与临床数据进行关联，可以进行在客观且正确地判定舌癌、特别是舌鳞状上皮癌的恶性度方面有用的分析。本发明的舌癌组织标本的分析用试剂盒可以实现在客观且正确地判定舌癌、特别是舌鳞状上皮癌的恶性度方面有用的分析。藉此，对于根据数据被判定为预后不佳的病例，即使对于过去在临床上被判定为预后良好的病例，也可以通过采用缜密地实施更有力的术前术后的化学疗法和放射线疗法、手术中的切除范围的扩大、术前术后的病程观察中的各种检查的判定的集中治疗方针，从而改善癌控制率。此外，对于被判定为预后良好的病例，通过避免过多的治疗和检查，可以给各种患者提供最好的医疗服务。另外，通过附加基因水平上的研究来进行判定，可以进行高精度的判定，因此能够减轻医疗费和背离治疗原则的不安等患者的负担。因而，对于社会也可以带来通过进行适当的医疗而实现的医疗费的削减。附图的简单说明图1是本发明的实施例1中主成分分析的采用第1主成分和第2主成分的各变量的因子载荷散布图。10图2是表示本发明的实施例l中考克斯(Cox)比例风险模型的基于舌鳞状上皮癌组织内的ITGB4/JUP的高低的2组间的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)生存曲线的图。实施发明的最佳方式以下，对本发明进行详细说明。本发明的舌癌的判定方法的特征在于，测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因的表达量、即mRNA量，通过整联蛋白家族基因的mRNA量/对照基因的mRNA量的比值将整联蛋白家族基因的m脂A量标准化，根据所得的数值判定舌癌的恶性度。另外，所述整联蛋白家族基因可以是ITGA3、ITGB4、ITGB5中的至少一种。另外，所述整联蛋白家族基因的m脂A量的测定不限定特定的方法，更优选使用实时PCR法。本发明的mRNA量的测定也可以使用RNA印迹法或固相杂交法。固相杂交法包括使raRNA或来源于mRNA的标记核酸与二维地排列有针对不同基因的探针的阵列杂交的多阵列杂交法和使mRNA或来源于mRNA的标记核酸与固定化有针对不同基因的探针的微球(beads)杂交的微球杂交法，但不局限于这些方法。实施本发明的舌癌的判定方法时，从舌癌组织的一部分中提取RNA，合成cDNA。以该cDNA为模板通过采用TaqMan(注册商标)探针的定量实时PCR进行整联蛋白家族基因群的表达定量。接着，同时进行用作对照的各种基因的表达定量。接着，取各种对照基因的mRNA量为分母，将ITGA3、ITGB4、ITGB5基因的m西A量标准化，制成数值数据。接着，使用该经标准化的数值数据来判定舌癌的恶性度。如上所述，根据整联蛋白基因的mRNA量/对照基因的mRNA量的比值，可以正确地掌握、预测癌的生物学和临床的性质，能够用于舌癌的临床判定。另外，所述对照基因是持家基因、细胞骨架分子基因、锚定蛋白基因、细胞外基质基因中的至少一种。另外，所述对照基因可优选使用其中的ACTB。11另外，所述对照基因可优选使用其中的KRT5。另外，所述对照基因可优选使用其中的JUP和/或PXN。本发明中使用的用于通过实时PCR法进行整联蛋白家族基因和/或对照基因的mRNA量的测定的引物对可以基于从日本国立遗传学研究所的日本丽A数据库(DDBJ)及其它机构的主页得到的各种基因的cDNA的核苷酸序列通过本发明的
技术领域：
的普通技术人员所周知的方法进行设计。本发明中使用的用于通过RNA印迹法或固相杂交法进行整联蛋白家族基因和/或对照基因的mRNA量的测定的探针可以基于从日本国立遗传学研究所的日本DNA数据库(DDBJ)及其它机构的主页得到的各种基因的cDNA的核苷酸序列通过本发明的
技术领域：
的普通技术人员所周知的方法进行设计。如上所述，通过本发明的舌癌的判定方法，可以更客观且正确地判定舌癌、特别是舌鳞状上皮癌的恶性度。以下，通过本发明的实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受到这些实施例的任何限制。还有，以下的实施例l中的实验方法等如下。(作为对象的病例)用于基因表达分析的肿瘤标本是1999年2005年在新泻大学医学及牙科综合医院牙科口腔外科、长冈红十字医院牙科口腔外科、信州大学医学院牙科口腔外科实施治疗的66例舌癌病例的活组织检查或手术切除时釆集的标本。这些病例在组织学上被诊断为鳞状上皮癌，T醒分期、浸润方式(Y-K分类)及其它详细的数据示于表l。本发明中的研究的实施计划不仅得到新泻大学牙医学系伦理委员会的同意，而且在进行研究时遵守日本文部科学省公布的关于临床研究的伦理规定的内容。取得患者的研究协助时说明了研究的主旨，并在获得知情同意的基础上签订了同意书。66名舌鳞状上皮癌患者的特性特性患者数(％)年龄平均62.38(范围21-91)性别男性41(62%)女性25(38%)观察天数115-1821天(平均795)尺寸(mm)<2020(30%)204032(48%)》4014(21%)颈部淋巴结转移阴性31(47%)阳性35(53%)远端脏器转移阴性60(91%)阳性6(9%)局部复发阴性64(97%)阳性2(3%)化学疗法—43(65%)+23(35%)放射线疗法—39(59%)+27(39%)结果生存54(82%)死亡12(18%)(RNA的提取)肿瘤组织被浸渍保存于RNALater(安比雍公司(Arabion)，得克萨斯州，美国)。这些肿瘤组织未进行特别的解剖，由肿瘤实质细胞和成纤维细胞、血管内皮细胞、炎症细胞等多种间质构成细胞构成。总腦A提取如下进行在TRIzol试剂(英杰公司(一>tf卜口^工y株式会社)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州，美国)中匀浆后(Ultra-TurraxT8，IKA实验室技术公司(IKALabortechinik)，斯道芬(Staufen)，德国)，按照该试剂的流程附加2次苯酚沉淀处理(PCI西格玛奥德里奇公司(、乂夕"^7WKy:y千株式会社)，圣路易斯，美国)。以2wg总RNA为模板，通过反转录反应(S叩erScr叩tII，英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国按照标准流程)合成单链cDNA。(采用实时PCR的相对的基因表达定量)以由舌鳞状上皮癌组织合成的cDNA为模板，进行采用定量实时PCR(Smart循环仪(SmartCycler)，赛菲德公司(C印heid)，桑尼威尔(Sunnyvale)，加利福尼亚州，美国)的基因表达定量。实时监控使用TaqMan(注册商标)探针(TaqMan(注册商标)基因表达分析(GeneExpressionAssays),应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，加利福尼亚州，美国)以TaqMan(注册商标)通用PCR主混合物(UniversalPCRMasterMix)(应用生物系统公司)按照应用生物系统公司(ABI社)标准流程(95"C/600秒，95"C/15秒+6(TC/60秒X温度循环)进行。以作为标准的舌癌组织的cDNA为模板制成数级的稀释系列(1:10:100:1000:10000:100000)，对于各浓度的样品进行采用同样的流程的实时PCR，绘制各基因的标准曲线。基因的mRNA量根据循环阈值(thresholdcycle)(Ct值)基于各自的标准曲线定量。作为分析对象的基因选定如下的基因ll种ITG家族基因、3种所谓的持家基因(HKG)、7种包括ITG的配体的细胞外基质基因(ECM)、4种在ITG受体的细胞质侧发挥作用的包括所谓的锚定蛋白(ANK)和细胞骨架分子(CSK)的基因(表2)。[表2]所分析的基因功能上的类别基因编号探针*HsO1673837—mlHs00985382_glHs00233722—mlHs01547684_mlHs01041013—ml整联蛋白家族Hs00233790一mlHs00559595一mlHs00173978一mlHs01103172_glHs00174435一ml/r咖Hs00982346—mlHs99999903—ml持家基因04Hs99999905—mlHs99999901—si细胞骨架分子Hs00361185一mlHs00158408—ml锚定蛋白Hs0095420_glPA7VHs00236046一mlHs01125432_ml"崩4Hs00935293—mlHs00966637_ml细胞外基质7M7Hs00233648—ml/W/Hs015499-0_glHs01076775_gl1/77VHs00169863_ml*应用生物系统公司的TaqMan⑤基因表达分析中的分析ID(统计学分析)对于由临床数据和基因表达数据得到各变量算出作为基本统计量的平均值、标准差、偏斜度、峰度而评价分布型后，算出各变量间的相关系数矩阵。对于将所述的11种ITG家族(ITG)基因的表达水平以其它的14种HKG、ECM、ANK和CSK基因的表达水平标准化而得的数值数据，以曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验对其与作为临床恶性度的指标的颈部淋巴结转移的有无和死亡的转归的相关性进行单变量分析。介于该检验的结果，通过分步法进行多变量回归分析中的变量选择，将对于颈部淋巴结转移和转归显示高相关性(P《0.01)的ITG基因表达比用于后续的多变量分析。作为临床的参数，采用作为对象的病例的年龄、性别、与肿瘤的进展范围有关的肿瘤的大小、作为与转移有关的项目的颈部淋巴结转移的有无和数量及远端脏器转移、作为与治疗有关的信息的化学疗法的有无和放射线治疗的有无、作为临床病程的死亡的转归的信息。作为多变量分析，进行采用所有变量的主成分分析，研究变量间的相关性。接着，进行基于以颈部淋巴结转移为目标变量的多元逻辑回归分析的相关因子检测以及关于颈部转移的预测模型的评价。然后，进行基于将是否死亡的转归作为终点的考克斯(COX)比例风险模型的分析。(组织学观察)对于与基因表达分析中使用的标本相同的肿瘤标本，观察石蜡切片所得的HE组织染色的结果。标本用10%福尔马林固定后，用常规方法制成。对于统计学上与临床恶性度显示出显著的相关性的多个标记，结合临床的病程，研究基于其高低的形态学观察结果。实施例l(统计学分析)1.单变量分析各变量间的相关系数矩阵的观察结果中，在背景因素间，颈部淋巴结转移与放射线照射(r=0.54)、远端脏器转移与死亡的转归之间(r=0.67)发现较高的相关性。在ITG基因比之间，ITGA3/JUP与ITGA3/KRT5(1^0.75)、ITGB5/LAMA3与ITGB5/TNC(f0.52)、ITGB4/JUP与ITGA3/GAPD(r二0.57)、ITGB4/JUP与ITGB4/KRT5(r二0.91)、ITGB5/ACTB与ITGB5/TNC(r=0.64)、ITGB5/ACTB与ITGB5/LAMA3(r=0.69)、ITGB5/ACTB与ITGB5/LAMA5(r=0.59)、ITGB5/L認A4与ITGB5/FNl(r-0.60)之间分别显示出高相关性。此外，在背景因素与基因之间，转归与ITGB4/JUP(r^.53)分别发现较高的相关性。对于通过以14种相关基因分别将11种ITG基因表达水平标准化而算出的151项基因表达比与颈部淋巴结转移的有无及死亡的转归的关系进行的曼-惠特尼检验的结果示于表3和表4。显示颈部淋巴结转移的显著性的基因表达比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ns:无显著性，数值表示在曼-惠特尼U检验中显示显著性的P值*负相关|显示p^0.001的基因表达比<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>对于颈部淋巴结转移，ITGA3和ITGB5中确认有多个显示显著性的基因比。用于标准化的基因种类中，采用KRT5和JUP的情况下，有多个显示显著性的基因比项目。ITG家族基因与ECM基因群、锚定蛋白PXN的基因表达水平确认有大致上伴随淋巴结转移和转归变差而上升的倾向。仅ITGB5存在表达水平伴随临床病程的恶化而下降的倾向，因而推测ITGB5显示在转录量随观察结果变差而上升的ECM分子和锚定蛋白基因中一致的显著性。对于死亡的转归，显示显著性的基因比集中于ITGB4和ITGB5。该结果中，将对于颈部淋巴结转移或死亡的转归显示1X以下的显著性水平的ITGA3/GAPD、ITGA3/KRT5、ITGA3/JUP、ITGB4/KRT5、ITGB4/JUP、ITGB5/ACTB、ITGB5/FN1、ITGB5/TNC、ITGB5/LAMA3、ITGB5/LAMA4、ITGB5/LAMA5、ITGB5/PXN用于多变量统计分析。2.多变量分析主成分分析在以临床数据和基因表达数据为变量的主成分分析的结果中，特征值在1以上的主成分为第1主成分第7主成分，累计贡献率为72.9%。包括2个以上各主成分和变量的因子载荷呈0.5以上的变量的主成分为第1主成分第3主成分，特征值都在2以上(表5)。[表5]主成分分析的临床参数与12类基因表达比<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*下划线表示主成分的各枢轴中最显著的数值第1主成分(Z-l)中，与ITGB35相关的各种基因比以及死亡转归的因子载荷显示了较高的绝对值。在ITGB4/JUP、ITGB4/KRT5、ITGA3/GAPD的基因表达信息中检出较大的正值，在ITGB5/ACTB、ITGB5/L旭A5的基因表达信息中检出负值。第2主成分(Z-2)中，ITGB的基因比以及与颈部淋巴结转移的有无相关的因素的因子载荷显示了较高的值。与反映死亡转归的第l主成分形成对照，在ITG基因表达比中，ITGA3/JUP和ITGA3/KRT5孤立地显示了较高的正的因子载荷值，同时肿瘤长径(尺寸)、化学疗法显示了较高的因子载荷值。第3主成分(Z-3)中，远端脏器转移和死亡转归显示了大的因子载荷值，而在ITG基因表达比中没有显示高值的项目，这被理解为该成分表示临床参数间的关联。该第3主成分中，化学疗法的因子显示了较大的负的因子载荷值。在第1主成分和第2主成分的因子载荷散布图中，如前所述，横轴Z-1的第l主成分被解释为与"死亡的转归"相关的基因的因素轴，纵轴Z-2的第2主成分被解释为与"颈部淋巴结转移"相关的基因的因素轴(图l)。转归的因素轴(横轴Z-1)中，在ITGB4和ITGA3的基因比群中确认表示相关的正的因子载荷，表示负相关的负的因子载荷由ITGB5的基因比构成，分别分布于图的右半球和左半球。另一方面，颈部淋巴结转移的因素轴(纵轴Z-2)中，ITG基因比大多分布于O的周围，其中仅ITGA3/JUP和ITGA3/KRT5分布于与颈部淋巴结转移同样水平的因子载荷区域。另外，肿瘤的长径(尺寸)虽然在第2主成分(纵轴)中与颈部淋巴结转移的因素接近，但在第l主成分(横轴)中位于绝对值较小的因子载荷区域。与颈部淋巴结转移相关的多元逻辑回归分析以单变量分析以及主成分分析的结果为基础，进行了以颈部淋巴结转移的有无为目标变量的多元逻辑回归分析。其结果是，作为显著影响颈部淋巴结转移的因素，检出了ITGA3/JUP和ITGB5/PXN(表6)。以颈部淋巴结转移的有无为目标变量的多元逻辑回归分析B标准差显著水平比值比4,0131.7330.02155.287-2.0951.0230.0410.123常数0.2270.5820.6971,255其中，对于颈部淋巴结转移，前一基因在正的方向上产生影响，后一基因在负的方向上产生影响。其中，ITGA3/JUP的偏回归系数以及比值比显示了最大的值。在与颈部淋巴结转移的有无相关的预测精度的评价中，基于本模型的真阳性率为74.3%，真阴性率为71.0%，准确度为72.7%(表7)。[表7]颈部淋巴结转移模型的预測精度预测值(颈部LN转移"0神1***观測值颈部LN转移0221992671.074.372.7*颈部淋巴结转移，**0无，氺**1肖关于生死的转归的考克斯(Cox)比例风险模型进行了基于以转归、即21生死作为终点的考克斯(COX)比例风险模型的回归分析，结果作为显著影响死亡转归的因素检出ITGB4/JUP(表8)。[表8]使用R0C曲线求出ITGB4/JUP的最适临界值并二值化，通过卡普兰迈耶法绘制出各组的生存曲线(图2)。2组间的生存函数的对数秩检验和威尔科克森(Wilcoxon)检验中，ITGB4/JUP不足0.15的组显示了比0.15以上的组高的生存率，显著水平都不足O.1%，确认显著差异。(基于基因表达分析结果的组织学观察结果的研究)暨卜I翻班赵区墜qlss您根据基因表达分析的结果，基于ITGB4/JUP和ITGA3/JUP的值选择病例。ITGB4/JUP显示了高值的肿瘤大多经历颈部淋巴结多发转移后，发生远端脏器转移，结果死亡的病程。生存病例中，也观察到原发肿瘤切除后发生颈部二次转移等显出临床上的术后恶性的病程。组织观察结果中并未都显出一定的组织观察结果，但单一细胞从小细胞瘤巢扩散性地浸润的观察结果是仅在ITGB4/JUP为高值的肿瘤中观察到的组织学特征。细胞的分化水平整体被判断为低分化的肿瘤实质形成的组织中，包括混杂有高分化区域和低分化区域的组织。在炎症类细胞的浸润强等情况下难以判别肿瘤浸润影像，但全部在浸润前端部得到了高浸润观察结果方面是一致的，在组织学上显示了高恶性。ITGA3/JUP显示高值的肿瘤主要观察到小细胞瘤巢水平的浸润观察结果。除了同时具有ITGB4/JUP高值的情况以外，没有发现远端脏器转移。细胞的分化度从低分化至高分化混杂，但可以说分化度总体上高于ITGB4/JUP为高值的肿瘤。如果与具有作为上皮细胞的未分化且较均质的肿瘤细胞的ITGB4/JUP为高值的肿瘤组织相比，虽然肿瘤细胞的异形性各种各样，但观察到小肿瘤细胞瘤巢单位的浸润方式有基本上一定的组织学倾向。ITGB4/JUP、ITGA3/JUP都为低值的组织影像中未发现浸润观察结果，维持了基底膜结构和细胞间连接等上皮的基本观察结果。(考察)以舌癌组织中的基因的表达水平为基础，以恶性度精密判定系统的确立为目的，对编码ITG受体的a和p亚单位的11种ITG基因进行了生物标记候选基因的研究。根据基因表达数据的统计学处理，ITGA3、ITGB4和ITGB5这3种基因的表达数据显示出与舌癌的临床病程良好地对应的可能性。统计学上，任一ITG基因的表达水平都确认与淋巴结转移的形成相关，与组织学的恶性观察结果也显示出一定程度的相关性。本发明的研究结果中应当关注的方面在于，伴随舌癌的病程所出现的淋巴结转移中同时存在临床上可控制在颈部淋巴结转移的水平的淋巴结转移和将来通过远端脏器转移而与死亡的转归密切相关的淋巴结转移，前者显示出通过ITGA3的基因表达水平所定义的可能性，后者显示出通过ITGB4和ITGB5的基因表达水平所定义的可能性。本发明人进行的基因表达定量不进行细胞成分的分离，以活体检査时或手术时所切除的所有肿瘤组织为对象。因此，难以在最初的阶段将基因标本调整为一定的条件。以所采集的基因标本中包括各种各样的浓度和分解水平、组织构成的不同、采集部位的偏差为前提。为了在这样的条件下采集临床上有效的基因表达信息而作的精心设计被认为是实际使用上无法避免的课题。作为高效地比较条件不同的基因表达定量结果的方法，一直以来采用相对于组织一般表达的所谓持家基因(HKG)表达水平的比值化、即标准化。但是，近年来，随着定量实时PCR的普及，这些HKG的表达水平被指出在组织间或组织内采集部位上存在较大的偏差，并不适合作为用于标准化的基因。在这样的背景下，为了选定可高效地抽提在构成鳞状上皮癌(SCC)的上皮和肿瘤细胞、成纤维细胞、炎症性浸润细胞等中表现出特征性的局部存在的各种ITG家族基因群的表达水平变化的组合，尝试了基于多种基因的表达的标准化。除了服G之外，以与ITG分子之间的共同局部存在性和功能上的关联为基础，研究了基于构成细胞间基质的各种间质(ECM)分子、细胞骨架分子(CSK)和锚定蛋白基因(ANK)的标准化。其结果是，在关于颈部淋巴结转移和死亡转归的采用曼-惠特尼检验的单变量分析中，ITGA3、ITGB4和ITGB5在基于KRT5、JUP和PXN的标准化数据中检出高显著性。ITGA3和ITGB4是在口腔粘膜中主要局部存在于上皮内的分子，其标准化中，上皮类细胞的CSK、细胞膜上的ITG和钙粘着蛋白等连接分子与作为连接细胞内纤维的ANK的KRT5和JUP显示出作为比较病例间的基因表达数据时的标准化分子有用的可能性。今后依然需要通过详细地研究这些分子间的局部存在性，总结所显示的显著性的功能上的证据。基于主成分分析的分析在从多种角度纵览因子间的联系方面是有用的。对应于死亡转归的第l主成分中，以ITGB4/JUP和ITGB5/ACTB为代表的ITG基因表达比与远端脏器转移和颈部淋巴结多发转移一起显示了较大的因子载荷绝对值。这意味着这些ITG基因表达水平与死亡的转归存在正相关或负相关。另一方面，对应于颈部淋巴结转移的第2主成分中，ITGA3/KRT5和ITGA3/JUP孤立地显示了较高的因子载荷，这暗示它们作为独立的因子与颈部淋巴结转移的形成相关。这些因子间的相互关系由第1主成分和第2主成分的因子载荷散布图得到较好的表现。肿瘤的长径(图1中的尺寸D)在第2主成分轴(纵轴)附近位于较大的因子载荷区域，这表示虽然肿瘤的大小与死亡的转归没有直接联系，但在一定程度上影响颈部淋巴结转移的形成。通过与之邻近并同样位于第2主成分轴的周围的ITGA3/KRT5(K)和ITGA3/JUP(L)所表现的值与肿瘤的大小相关，与以第l主成分轴(横轴)表示的死亡的转归无关。可以认为它们反映出在进行颈部肃清等适当的治疗时可以控制的颈部淋巴结转移能力。与之相反，在第l主成分轴上，以ITGB4和ITGB5的表达比水平所定义的淋巴结转移能力同样与颈部淋巴结转移、特别是颈部淋巴结多发转移(F)相关，但同时与远端脏器转移和局部复发密切相关，因此最终被解释为与死亡转归相关。第3主成分与第1主成分同样表示转归和远端脏器转移的因素轴，但化学疗法的实施显示了较大的负的因子载荷，这意味着化学疗法的实施与远端脏器转移和转归呈负相关，换言之，意味着化学疗法的实施抑制远端转移和死亡转归的可能性。通过多元逻辑回归分析，作为显著影响颈部淋巴结转移的因素，检出有ITGA3/JUP和ITGB5/PXN。ITGA3/JUP是在前述的主成分分析的结果中与远端转移和死亡转归无关的表示淋巴结转移的倾向的因子之一，而ITGB5/PXN是反映与远端脏器转移或死亡转归相关的因素轴的因子。其中，ITGA3/JUP的偏回归系数和比值比显示了最大的值，表示通常对淋巴结转移具有较大的影响。该观察结果被认为与淋巴结转移大多在颈部淋巴结水平得到抑制、而不是几乎都因远端转移和局部复发而陷入难以控制的局面的情况匹配。如上所述，淋巴结转移是作为基于两个独立的转移性的效果的总和所表现出的现象，这是也在多元逻辑回归分析中显示出的结果。采用基于这两个因素所算出的颈部淋巴结转移回归模型的颈部淋巴结转移的预测精度虽然显示真阳性率74.3%、真阴性率71.0%、准确度72.7°%，但很难说达到临床应用所需的水平。然而，对于由多种细胞成分构成的作为极复杂的生物学作用的结果的淋巴结转移，作为仅基于与ITG分子相关的2个因素的判定，认为这是超乎预想的高准确度。今后的课题是通过在将来使其发展成加入了涉及其它生物学现象的多种分子群的预测模型，将准确性提升至实用的范围。25作为针对与死亡转归相关的因素的分析而进行的考克斯(Cox)比例风险模型中，虽然是多变量分析，但仅检出唯一的ITGB4/JUP。该结果与主成分分析的因子载荷散布图中ITGB4和ITGB5的基因表达比的项目邻近第1主成分(Z-1)、对应于死亡转归的因素轴分布的结果匹配，表示ITGB4和ITGB5的项目虽然负相关，但被判定为说明死亡转归或远端脏器转移的近似的因素。作为代表它们的主因子，ITGB4/JUP显示风险比为1055671，显著水平p<0.0001，同样在基于卡普兰迈耶法的累计生存率曲线和对数轴检验中也明确该因子具有较强的说明力。ITG家族分子一直以来在对肿瘤的性质产生影响的功能方面有较多的报道。ITGA3与ITGPl亚单位成对，在组织内起到针对间质分子纤连蛋白(FN)、以LAMA3为构成成分的层粘连蛋白-5(层粘连蛋白a1Y1)、以LAMA5为构成成分的层粘连蛋白-10(层粘连蛋白a501Yl)和层粘连蛋白-11(层粘连蛋白a502Y1)的受体的作用。ITGA3表达主要以上皮基底细胞为代表在肺、子宫、食道、肾小球等中发现广泛的分布，其功能被认为在正常状态下与细胞的连接、运动、凋亡有关。有报道称，子宫癌和结肠癌中，具有ITGA3作为亚单位的整联蛋白a30l的表达状态影响癌细胞的转移和病理组织学的分级。另一方面，ITGB4也被发现在上皮细胞和间质中的施旺细胞、血管内皮细胞等中有表达，整联蛋白a6P4受体起到针对层粘连蛋白-5的受体的作用。除了细胞连接之外，在创伤治愈和神经伸长时、胎儿期也发现表达，所以被认为广泛地与细胞的生成、分化、增殖相关。ITGB5也在上皮基底细胞中被发现，形成整联蛋白avP5的亚单位，起到FN、玻连蛋白的受体的作用。被认为在正常细胞中与细胞的连接、增殖、运动、血管形成的功能相关，已知在浸润性高的胃癌中有高表达。在肿瘤的增殖和转移的形成中，向肿瘤组织内的血管新生被例举为重要的现象。目前为止的研究中，ITGB4在血管内皮细胞中表达，被视作负责其细胞游动和浸润的因子。敲除ITGB4的小鼠中显示与肿瘤组织邻接的血管新生显著地得到抑制。相反地，对于ITGB5，敲除ITGB5的小鼠中向肿瘤细胞周围的血管新生得到增强，所以对于肿瘤组织的血管新生显示抑制作用。本发明的研究中显示ITGB4表达比的上升和ITGB5表达比的下降与远端脏器转移和死亡转归相关，想到这些整联蛋白表达信息可反映因血管新生的活化而产生的肿瘤向血管内的转移和肿瘤增殖活化的现象。今后，对于它们的机制需要深入研究。以往，远端转移性的预想和生命预后的预测方面，仅通过组织学的判定，基准并不明确。虽然通过组织学的观察结果也可以以一定程度的比例预想肿瘤具有的高恶性，但如本发明所示，在基于ITGB4/JUP和ITGA3/JUP的高低的分类中组织影像呈多样的形态，即仅通过组织影像常常难以对于远端转移的可能性和转归进行具有再现性的预后判定。如本发明所示，暗示至少有与远端转移不太有关联的和有密切关联的这2种因子与颈部淋巴结转移相关。基因表达数据譬如可以期待给口腔癌的治疗时最伤脑筋的这些问题带来至今为止没有过的客观的信息。舌癌占口腔癌的约一半，具有在较早期发生转移的性质，因此认为即便是T1-T2病例，预测潜在的淋巴结转移和远端转移的方法的实用化也可产生巨大的利益。以往的研究和本发明的研究中都显示化学疗法可以产生远端转移的抑制效果，在正确地把握了肿瘤的性质的基础上制订的治疗计划在控制率提高方面具有非常重要的意义。针对颈部淋巴结转移、远端脏器转移的危险性和肿瘤的浸润性的信息提供系统的构建所产生的总体上的利益以及生存率和QOL的改善、医疗费的合理化等所带来的利益被认为非常巨大。权利要求1.舌癌的判定方法，其特征在于，测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量，根据整联蛋白家族基因的mRNA量/对照基因的mRNA量的比值来判定舌癌的恶性度。2.如权利要求l所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述整联蛋白家族基因是整联蛋白a3、整联蛋白P4、整联蛋白P5中的至少一种。3.如权利要求1或2所述的舌癌的判定方法，其特征在于，通过实时PCR法进行所述整联蛋白家族基因的mRNA量的测定。4.如权利要求1或2所述的舌癌的判定方法，其特征在于，通过RNA印迹法或固相杂交法进行所述整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的测定。5.如权利要求14中的任一项所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述对照基因是持家基因、细胞骨架分子基因、锚定蛋白基因、细胞外基质基因中的至少一种。6.如权利要求5所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述对照基因是ACTB。7.如权利要求5所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述对照基因是KRT5。8.如权利要求5所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述对照基因是JUP和/或PXN。9.如权利要求18的任一项所述的舌癌的判定方法，其特征在于，所述舌癌是舌鳞状上皮癌。10.舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，包括测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的步骤，以及将整联蛋白家族基因的mRNA量/对照基因的m認A量的比值与临床数据进行关联的步骤。11.如权利要求10所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述临床数据是选自TOM分期、Y-K分类、对化学疗法的反应、对放射线疗法的反应、预后的1种或2种以上的数据。12.如权利要求10或11所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的测定通过实时PCR法进行。13.如权利要求10或11所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的测定通过RNA印迹法或固相杂交法进行。14.如权利要求913中的任一项所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述整联蛋白家族基因是整联蛋白a3、整联蛋白P4、整联蛋白P5中的至少一种。15.如权利要求914中的任一项所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述对照基因是持家基因、细胞骨架分子基因、锚定蛋白基因、细胞外基质基因中的至少一种。16.如权利要求15所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述对照基因是ACTB。17.如权利要求15所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述对照基因是KRT5。18.如权利要求15所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述对照基因是JUP和/或PXN。19.如权利要求918中的任一项所述的舌癌组织标本的分析方法，其特征在于，所述舌癌是舌鳞状上皮癌。20.舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于进行选自整联蛋白a3、整联蛋白e4和整联蛋白05的1个或2个以上的整联蛋白家族基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的引物对，用于进行选自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l个或2个以上的对照基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的引物对，以及说明权利要求1012中的任一项所述的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。21.舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于进行选自整联蛋白a3及KRT5、整联蛋白a3及JUP、整联蛋白P4及JUP、整联蛋白04及KRT、整联蛋白05及ACTB、整联蛋白P5及PXN的l组或2组以上的整联蛋白家族基因及对照基因的组合在舌癌组织标本中的raRNA量的测定的引物对的组合，以及说明权利要求1012中的任一项所述的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。22.舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于进行选自整联蛋白a3、整联蛋白e4和整联蛋白35的1个或2个以上的整联蛋白家族基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的探针，用于进行选自ACTB、KRT5、JUP和PXN的l个或2个以上的对照基因在舌癌组织标本中的mRNA量的测定的探针，以及说明权利要求IO、11或13所述的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。23.舌癌组织标本的分析用试剂盒，其特征在于，包括用于通过RNA印迹法或固相杂交法进行选自整联蛋白a3及KRT5、整联蛋白a3及JUP、整联蛋白e4及JUP、整联蛋白P4及KRT、整联蛋白e5及ACTB、整联蛋白P5及PXN的1组或2组以上的整联蛋白家族基因及对照基因的组合在舌癌组织标本中的raRNA量的测定的探针的组合，以及说明权利要求IO、11或13所述的舌癌组织标本的分析方法的使用说明书。全文摘要本发明提供可以客观且正确地判定舌癌的恶性度的舌癌的判定方法、舌癌组织标本的分析方法以及舌癌组织标本的分析用试剂盒。所提供的舌癌的判定方法的特征在于，测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量，根据整联蛋白家族基因的mRNA量/对照基因的mRNA量的比值来判定舌癌的恶性度；所提供的舌癌组织标本的分析方法的特征在于，包括测定舌癌组织标本中的整联蛋白家族基因和对照基因的mRNA量的步骤，以及将整联蛋白家族基因的mRNA量/对照基因的mRNA量的比值与临床数据进行关联的步骤；还提供舌癌组织标本的分析用试剂盒。文档编号C12Q1/68GK101522912SQ20078003389公开日2009年9月2日申请日期2007年9月28日优先权日2006年10月12日发明者永田昌毅,黑川亮申请人:国立大学法人新泻大学