测定生物杀灭活性的方法

专利名称：测定生物杀灭活性的方法
测定生物杀灭活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用基于酵母的测试来测定物质特别是液体物质 的生物杀灭活性的方法。
已知的测定生物杀灭活性的方法需要复杂而耗时的程序，经常需 要精细的实验程序和/或复杂而昂贵的设备。这样的复杂程序不适合于 野外使用。
例如，WO 01/20020公开了一种用于鉴定具有除草剂或生长调节 活性的化合物的方法。该方法包括向表达一种或多种植物周期控制基 因的酵母菌株培养物中添加待测化合物。这个方法特定用于检测除草、 杀虫、杀真菌或植物生长调节剂活性，并且需要制备特定酵母菌株。
Knight等人描述了基于酵母的用于环境检测的细胞毒性测试方法 (J. Environ. Monit., 2004， 6, 71-79)。该测试方法需要使用遗传修饰的 酵母细胞和用于测量荧光的仪器。
以上描述的方法都不适合于一般的生物杀灭剂活性测试，该测试 使用容易获得的材料而可在野外使用。本发明解决(address) 了这些 要求。
本说明书中对既往发表文献的罗列或讨论不应该被认为是承认该 文献是现有技术的一部分或者是公知常识。
已经知道酵母中的酶通过一个被称为发酵的过程将糖类(例如葡 萄糖、果糖)转化为醇和二氧化碳。发酵应用于烘焙中，二氧化碳的 释放使得生面团膨胀而醇使面包具有香味。
本发明人发现，发酵过程可通过加入生物杀灭剂来减缓。令人惊 奇的是，由发酵所引起的泡沬的体积可令人信赖地且精确地用作测定 物质的生物杀灭活性的手段。这导致了一种用于测定物质的生物杀灭 活性的容易操作的现场方法的发展。
本发明提供了一种用于测定物质的生物杀灭活性的方法。该方法 包含以下步骤
(0制备包含糖类和酵母的组合物；
6(ii)在第一容器中将组合物的至少一部分与待测物质混合； (Hi)温育容器及其内容物；和
(iv)将容器中的发酵量与对照相比较以提供物质的生物杀灭活性
的指征。
因此，本发明可用来筛选生物杀灭剂和/或包含生物杀灭剂的组合 物的活性。"生物杀灭剂"是对活有机体有毒性的物质。通常可被本发 明所述方法测定的生物杀灭剂是抗微生物试剂，其意指任何能够破坏 和/或防止微生物繁殖和或杀死微生物的化学物质。抗微生物试剂的例 子包括杀细菌剂、杀真菌剂、除海藻剂、杀酵母剂、杀霉菌剂、杀菌 剂、杀精子剂、抗生素、抗病毒剂、除草剂、杀昆虫剂和灭鼠剂，及 其混合物，特别是杀细菌剂、杀真菌剂、杀酵母剂、杀霉菌剂、杀菌 剂及其混合物。如本文所用，术语"生物杀灭活性"应相应地进行限 定。
待测"物质"可以是任何固体或液体。如果所测物质是液体，则 可以是例如潜在的或已知的生物杀灭剂或生物杀灭组合物的溶液或悬 浮液。使用液体物质或溶于测试中使用的其它成分的固体物质通常改 善其与测试中所用的其它成分的混合，因此与使用固体物质相比，可 提供更可信赖的结果。液体物质可以是潜在的生物杀灭剂(例如固体 的水溶液或生物杀灭剂液体物质)或含有一种或多种生物杀灭剂的组 合物的溶液。
本发明可用于测定野外发现的固体或液体样品的生物杀灭物质和/ 或活性。例如，待测"物质"可以是野外发现的土壤或水(例如，河 流、池塘、湖泊、溪流或海水)样品。因此，本发明在野外作业中特 别有用。
术语"糖类"包括任何单糖、二糖或多糖或其混合物。 术语"发酵量"包括温育步骤(iii)中酵母发酵糖类过程中产生的 醇和/或二氧化碳的数量。
优选地，歩骤(i)的组合物包含发泡剂，在步骤(iv)中，容器 中泡沫体积与对照相比较以提供物质的生物杀灭活性的指征。术语"发 泡剂"包括任何有发泡能力的物质。通常，这样的物质是具有足够的 表面张力以使气泡形成的液体，且不是生物杀灭剂并且实质上不会影响生物杀灭剂的生物杀灭活性。但是，这样的物质也可以是溶于组合 物中的其它成分中以形成具有这些特性的液体的固体。例如，发泡剂 可以是诸如表面活性剂的物质(例如椰子酰二乙醇胺)，其自身具有发 泡能力和/或当与水或另一种液体(例如可根据本发明使用的一种或多 种其它成分)混合时具有发泡能力。可用作发泡剂的物质的例子包括 脂肪酸酯，如脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、十二烷基磺酸钠、
聚氧乙烯-山梨醇-单月桂酸酯、聚二醇醚(polyalkylene glycoether)和
磷酸甘油酯。发泡剂可以是乳状液或胶体分散系。例如，优选的发泡 剂是乳。
或者或另外，容器中(通过发酵)产生的二氧化碳量可与对照相 比较以提供物质的生物杀灭活性的指征。容器中产生的二氧化碳量通 常由二氧化碳检测器来测定，例如红外二氧化碳传感器或二氧化碳敏 感性Digger管。本领域中已知的其它测定二氧化碳的方法和检测器也 可使用。
也考虑到容器中(通过发酵)产生的醇的数量可与对照相比较以 提供物质的生物杀灭活性的指征。因此本发明可使用己知的测定醇的 方法和检测器。
如上所述，本发明适合于野外作业。优选地，因此，本发明不包 含复杂的程序和/或设备(例如沉重、巨大、易碎的设备，或者是对野 外使用敏感的设备)。换句话说，本发明的方法和装置(见下)优选是 操作和使用简单的。例如，优选地，不通过潜在的复杂检测方法，如 比较容器中和对照中放出的二氧化碳的压力和/或体积，或比较容器中 和对照中内容物的pH进行发酵量的比较。同样优选的是在本发明的方 法中避免使用电子设备。例如，如果使用了发泡剂，发酵量(并因此 最终指征生物杀灭活性)可通过泡沬的高度进行可视的测定。
在上述步骤(iv)中提到的对照可包含重复本发明方法的步骤(i) 和(m)，即重复本发明的方法而不加待测物质。换句话说，对照优选 为包含以下步骤向实质上具有和第一容器相同尺寸的第二容器中加 入包含糖类和酵母的组合物的一部分，并温育第二容器及其内容物。 然后可将对照的发酵量与含有测量物质的第一容器中的发酵量相比较 以提供物质的生物杀灭活性的指征。优选地，对照是在和测试实质上相同的条件下进行。换句话说， 优选为使用大约相同数量的相同组合物(例如，使用相同数量和类型 的酵母和糖类和可选的发泡剂)且在大约相同的温度下温育容器大约 相同的时间。如果待测的测试物质包含实质体积的液体，则可向对照 中加入大约相同体积的合适溶剂(例如水或发泡剂)以模拟测试的条 件(例如，以使对照中所使用的液体的总体积与测试中所使用的液体 的体积大约相同)。
本发明的方法可用于测定和/或比较一种以上物质的生物杀灭活性 或测定材料例如土壤或水样品中生物杀灭剂物质的存在。或者，本方 法可用于比较不同浓度物质的生物杀灭活性或比较材料例如土壤或水 样品中生物杀灭剂物质的存在和/或数量。例如，所测物质可用水或另 一种溶剂稀释至不同程度。优选地，当然，测定物质的生物杀灭活性 的方法进行多次，即在相同的样品上重复一次或多次以确定结果。
换句话说，可使用一种或多种其它物质重复本发明的步骤(0至 (iii)，将每个容器中的发酵量与对照比较。
实质上本发明可使用任何容器。如果使用泡沫体积来指征发酵量， 则本发明可使用适合于将测试或每个测试中所产生的泡沫体积与对照 可信赖地相比较的容器。例如，测试和对照中所用的这样的容器可具 有实质上相同的尺寸，优选为相同的尺寸。词组"实质上相同的尺寸" 意指容器的尺寸足够相似以允许令人信赖地比较测试之间的泡沫体积 (例如简单地通过比较泡沫的高度)，从而比较生物杀灭活性的程度。
优选地，容器由刚性的材料例如塑料或玻璃制成。优选地，容器 在一端开口以允许测试中所使用的成分容易地加入到容器中。可选地， 这样的开口容器可具有盖子以使容器的内容物与空气隔绝。优选地， 但是，在温育步骤(iii)中容器敞开。
容器可以在一个方向上比另外两个方向长。当使用泡沫的体积来 指征发酵量时，这特别有用，因为这有利于对泡沫体积进行比较。优 选地，容器高度比宽度或长度要长。例如，容器优选具有大约0.1至大
约10 cm的直径和大约1至大约50 cm的高度。在这样的优选容器中， 容器中泡沫的高度可提供容器中所测物质的生物杀灭活性的指征。本 发明方法中可使用的合适容器的例子包括试管、烧杯和锥形瓶，优选为透明管例如透明试管。
本发明方法的歩骤(i)涉及制备用于测定物质的生物杀灭活性的 组合物。组合物包含酵母和糖类。组合物还可包含水。优选地，组合 物包含发泡剂。在这种情况下，组合物优选为通过将酵母加入到发泡 剂中的糖溶液中来制备。通过这样做，认为可以避免对酵母的渗透性 破坏。
可在周围环境温度或之下来制备组合物。除非另有指明，否则本 文所用的术语"周围环境温度"包括野外现场发现的任何温度。例如，
组合物可在大约0至大约35"C的温度下制备，例如大约1至大约30°C 的温度，或大约2至大约25'C的温度，例如大约3至大约2(TC的温度 或大约4至大约15〔的温度。为了在使用前阻止或防止组合物发酵， 可在使用前将其储存在周围环境温度以下的温度(例如冷冻)。优选地， 但是，组合物在制备之后立即使用。如果需要，组合物可制成悬浮液， 如果必要可加水进一步稀释。
在本发明方法的步骤(ii)中，在如上所述的容器中将组合物的一 部分与待测物质混合。在加入组合物的一部分之前，待测物质可能需 要在容器中进行稀释(例如用水)。优选地，因此，将组合物的一部分 加入到含有待测物质的容器中。优选地，组合物和待测物质的混合物 在使用前进行摇晃，例如通过超声或摇动以适当地混合容器的内容物。 例如，对于野外现场应用，混合物优选为通过摇动进行摇晃。
然后将混合物在适合于酵母对糖类进行发酵的温度下温育。通常， 混合物在15至5(TC的温度下温育。温度应该足够温暖以允许发酵发 生，但不要太温暖以至于杀死酵母细胞。优选地，混合物在大约20至 大约25。C的温度下温育，例如大约23至大约4(TC的温度，例如大约 25至大约35。C的温度(例如大约3(TC)。
温育混合物的时间不是重要的，可介于大约1至大约100分钟， 甚至更长。但是，对于物质的生物杀灭活性的对照和其它任何比较性 测试，温育时间应该相同。优选地，混合物温育大约5至大约30分钟， 如大约10至大约20分钟(例如在例如大约3(TC下温育大约15分钟)。 通常，在发酵由于营养物(例如糖类)的限制和/或氧气的限制停止之 前，发酵会进行确定的时间。例如，在大约3(TC下发酵可在大约15分钟内完成。
温育之后，将第一容器中的发酵量(例如泡沫体积)与对照比较， 可选地与任何其它进行的测试比较。发酵量代表物质的生物杀灭活性。
本发明还提供了进行本发明方法的部件装置(kitofparts)。因此，
本发明提供了部件装置，其包含酵母和糖类。优选地，部件装置还包 含发泡剂和/或二氧化碳检测器(例如以上描述的那些)。但是，装置优 选为不含有用于检测产生的二氧化碳体积和/或压力的传感器和/或用 于测定与二氧化碳产生相关的pH变化的传感器。优选地，装置不含有 电子设备。
本发明的装置还优选包含两个或多个实质上具有相同尺寸的容 器。装置还可包含用于一个或多个容器的支架。
装置还可包含检测工具(例如一个或多个尺子)以辅助比较本发 明优选方法(其中使用了发泡剂)中的泡沫的体积(例如高度)。或者， 支架和/或容器本身可包含这样的检测工具(例如容器和或支架可以划 上刻度)。
装置还可包含用于冷却装置中其它成分的冷冻器和/或进行本发明 方法步骤(iii)的温育器。
可选地，装置可包含用于精确添加待测液体物质和/或发泡剂和/ 或水的工具，如果在本发明方法中使用了它们。这样的工具可以是已 知容积的移液管、注射器或任何其它合适的能够输送己知和可测体积 液体的工具。
可选地，部件装置中所含有的酵母和糖类进入容器前可预先测定。
装置还可含有作为阳性对照的生物杀灭剂标准和作为阴性对照的 无菌水。生物杀灭剂标准的例子为椰子烷基二甲基苄基氯化铵，如果 需要，用水将其稀释至已知浓度。
本发明方法和装置中可用的酵母优选为面包酵母，虽然其他种类 的酵母例如啤酒酵母也可使用。优选地，使用新鲜酵母，例如新鲜面 包酵母。也可使用干燥的或即发的酵母。优选使用未经过任何方式的 遗传修饰的酵母。
本发明的方法和装置中可使用任何种类的乳。但是，优选使用新 鲜乳，更优选为新鲜全乳。具有天然脂肪的新鲜全乳比低脂肪乳更为优选，因为低脂肪乳可导致泡沫较少。优选为测试和对照使用相同的 乳。
本发明的方法和装置中可使用任何类型的糖类。合适的糖类包括 单糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖，以及二糖，如蔗糖、麦芽糖 和乳糖，优选为葡萄糖。优选地，所用的糖类是粉末，因为这有助于 糖类在乳中的溶解。任何商售的糖类均可使用，例如白砂糖、细白砂 糖或冰糖。
本发明将参考以下非限制性实施例来描述。 实施例
在锥形瓶中，将3 g粉末糖溶于50 ml冷牛奶(大约8"C)中。向 糖溶液中加入15 g新鲜的面包酵母并搅拌以乳化酵母直至得到均一颜 色的悬浮液。在使用前将悬浮液储存于8"C下大约24小时。
向5个单个的玻璃试管(高10 cm，直径0.5 cm)中加入0.5 ml 待测生物杀灭剂样品。测定的生物杀灭剂是Byotrol A1616F4L，其成 分如下所示。
A1616产品(F4L，即用型)
CAS-No. 化合物 活性浓度
6824-85-1 节基《12-16-烷基二甲基氯 0.07%
7173-51-7 二-正癸基二甲基氯化铵 0.07%
52-51-7 布罗波尔(bronopol) (INN) 0.05%
27083-27-8 盐酸多聚二胍 0.03 %
64-17-5 乙醇 0.13 %
990001-58-01 polydol 0.015%
水 99.64 %
5种生物杀灭剂样品的浓度为原液至蒸馏水1: 79稀释。向5个试 管的每个试管中加入lml酵母/糖悬浮液。向另外两个试管(对照)中 加入0.5 ml酵母/糖悬浮液和0.5 ml稀释的酵母悬浮液(用水1:2稀释)。
轻轻摇动7个试管并在37。C下温育大约15分钟。测定每个试管中 泡沫上升的高度，结果显示于

图1。对照中泡沫上升了大约8 cm (对
12于通过稀释降低酵母浓度的管为7cm)， 5个测定的样品中泡沬的高度
从生物杀灭剂原液至1: 79稀释生物杀灭剂大约呈线性上升。
权利要求
1、一种用于测定物质的生物杀灭活性的方法，其包含以下步骤(i)制备包含糖类和酵母的组合物；(ii)在第一容器中将组合物的至少一部分与待测物质混合；(iii)温育容器及其内容物；和(iv)将容器中的发酵量与对照相比较以提供物质的生物杀灭活性的指征。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的组合物包含发泡 剂，在歩骤(iv)中，将容器中泡沫的体积与对照相比较以提供物质的 生物杀灭活性的指征。
3、 根据权利要求2所述的方法，其中容器中泡沫的高度提供物质 或每种物质的生物杀灭活性的指征。
4、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中， 容器中产生的二氧化碳的量与对照相比较以提供物质的生物杀灭活性 的指征。
5、 根据权利要求4所述的方法，其中产生的二氧化碳的量通过二 氧化碳检测器来测定。
6、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中对照包含在实质上 具有和第一容器相同尺寸的第二容器中温育组合物的至少一部分的步 骤。
7、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中组合物在大约0至 大约35r的温度下制备。
8、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中温育在大约15至 大约45i:的温度下进行。
9、 根据前述权利要求任一项所述的方法，包括以下步骤在另外 一个或多个实质上均具有和容器或每个容器相同尺寸的容器中将组合 物的另外一部分或多个部分分别与另外一种或多种待测物质混合。
10、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中物质是液体。
11、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中容器是刚性的。
12、 根据权利要求11所述的方法，其中容器具有大约0.1至大约10 cm的直径和大约1至大约50 cm的高度。
13、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中容器在温育前进 行摇晃。
14、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中组合物在使用前 在大约0至大约15'C的温度下储存。
15、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中酵母是新鲜的面 包酵母。
16、 根据权利要求2至15任一项所述的方法，其中发泡剂是乳。
17、 根据权利要求16所述的方法，其中乳是新鲜全乳。
18、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中糖类是粉末状的。
19、 根据权利要求2至18任一项所述的方法，其中通过将酵母加 入到发泡剂中的糖溶液中来制备组合物。
20、 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中第一容器还包含 用于稀释的水。
21、 一种用于测定物质的生物杀灭活性的部件装置，其包含酵母 和糖类。
22、 根据权利要求21所述的部件装置，其包含发泡剂。
23、 根据权利要求22所述的部件装置，其中发泡剂是乳。
24、 根据权利要求21至23任一项所述的部件装置，其还包含二 氧化碳检测器。
25、 根据权利要求21至24任一项所述的部件装置，其包含两个 或多个实质上具有相同尺寸的容器。
26、 根据权利要求25所述的部件装置，其包含容器支架。
27、 根据权利要求21至26任一项所述的部件装置，其包含生物 杀灭剂标准和/或无菌水。
28、 根据权利要求21至27任一项所述的部件装置，其包含温育器。
29、 根据权利要求21至28任一项所述的部件装置，其包含冷冻器。
30、 根据权利要求21至29任一项所述的部件装置，其包含能够 输送已知和可测体积的液体的工具。
31、 根据权利要求21至30任一项所述的部件装置，其包含测定 泡沬体积的工具。
32、 根据权利要求25至31任一项所述的部件装置，其中容器是 实质上具有相同直径的管。
33、 根据权利要求32所述的部件装置，其中管具有大约0.1至大 约10 cm的直径和大约1至大约50 cm的高度。
34、 根据权利要求21至33任一项所述的部件装置，其中酵母是 新鲜的面包酵母。
35、 根据权利要求23至34任一项所述的部件装置，其中乳是新 鲜全乳。
36、 根据权利要求21至35任一项所述的部件装置，其中糖类是 粉末状的。
37、 一种根据权利要求21至36任一项所述的部件装置用于测定 物质的生物杀灭活性的用途。
38、 一种包含酵母和糖类的组合物用于测定物质的生物杀灭活性 的用途。
39、 根据权利要求38所述的用途，其中组合物包含发泡剂。
40、 一种基本上如本文所述并参照实施例的测定物质的生物杀灭 活性的方法。
41、 一种基本上如本文所述的用于测定物质的生物杀灭活性的部 件装置。
42、 一种基本上如本文所述的用于测定物质的生物杀灭活性的部 件装置的用途。
43、 一种基本上如本文所述并参照实施例的测定物质的生物杀灭 活性的部件装置的用途。
全文摘要
本发明涉及用于测定物质的生物杀灭活性的方法和部件装置。该方法包含以下步骤(i)制备包含糖类和酵母的组合物；(ii)在第一容器中将组合物的至少一部分与待测物质混合；(iii)温育容器及其内容物；和(iv)将容器中的发酵量与对照相比较以提供物质的生物杀灭活性的指征。
文档编号C12Q1/02GK101553575SQ200780037137
公开日2009年10月7日 申请日期2007年10月5日 优先权日2006年10月6日
发明者U·W·施瓦茨 申请人:拜奥特罗尔有限公司;U·W·施瓦茨