专利名称：制备视黄酯的方法
制备视黄酯的方法 发明领域
本发明涉及通过化学酶方法，在酶存在下，由短链视黄酯与合适 的长链酸或酯制备视黄醇的长链酯。
背景技术：
很久以来，视黄醇(维生素A)和视黄酯已经被加到化妆品组合物中 以提供局部有益效果。视黄醇自身是不稳定的，并且在过量使用时具 有毒性。然而，长链视黄酯是优选的，因为它们更稳定。
长链视黄酯的传统化学制备包括将视黄醇与长链酸、酰氯或酯反 应，或者通过短链视黄酯与长链脂肪酸酯的酯基转移而制得。这些方 法使用苛刻的试剂或高温，由于视黄醇或视黄酯对这些类型的反应条 件是不稳定的，所以这可引起困难。
已经有几篇关于长链视黄酯的化学酶合成的报道。很多这些合成 使用昂贵并且不稳定的视黄醇作为原料(O'Connor等人，J. C/zem.
45, 641; Maugard,等人，丄Mo/. c加"/. j5.'五"^yma"c 2000， s, 275; Maugard et. al.,仏Wec/2冊/.2000, 76, 358; Maugard等人， Aofcc/mo/.尸rag. 2002, /S, 424.)。与视黄醇相比，视黄酯例如乙酸视 黄酯要稳定得多，并且价格也显著降低，有几篇报道已经使用这种材 料作为生物催化制备长链视黄酯的原料。未审查的日本专利申请(JP 62-248495, 1987)在有机溶剂中使用维生素A乙酸酯和脂肪酸，所述有 机溶剂含有用O-甲氧基聚乙二醇修饰的脂肪酶，以制备长链视黄酯。 虽然获得了所需产物的合理产率，但是为了成功，该方法需要对脂肪 酶进行单独修饰。不需要该修饰的方法将是更期望的。国际专利申请 WO 2004/044212 Al详细描述了由一见黄醇或碎见黄酯和动物或植物来源 的脂肪或油在不含溶剂的条件下生物催化合成长链视黄酯。遗憾的是， 该方法使用高温，并且生成所需产物的转化率仅为中等(17-44%),这使 得分离变复杂。因此，由易于获得的前体制备长链视黄酯的温和方法 是值得关注的。发明概述
本发明的第一个实施方案涉及制备视黄酯的方法。该方法包括将
式2的短链视黄酯
与长链酸或长链酯在有机溶剂和酶存在下反应，以形成视黄酯。114选
自氬、d-C4烷基和C2-C4烯基。
另一个实施方案涉及制备由通式1代表的长链视黄酯化合物的方
法
根据该实施方案的方法包括将短链视黄酯与长链酸或长链酯在有 机溶剂和酶存在下，并且任选在至少一种分子筛和/或至少一种离子交 换树脂存在下反应，以形成视黄酯。R选自以下基团中的至少一个
C4-C24坑>^、 C4-C24彿>^、 C5-C24 —歸>^、 。6-C24 二歸基、Cg-C24四彿 基、C3-Cs环烷基、CVC20碳环芳基、C4-C2G杂芳基及其混合物，其中
所述杂芳基包括硫、氮和氧中的至少一个。
本发明涉及制备由通式1代表的长链视黄酯化合物的方法:
发明详述其中
R选自取代和未取代的，支链和直链，饱和、不饱和和多不饱和的C4-C20
烷基，取代和未取代的C3-Q环烷基，取代和未取代的CVC20碳环芳基，
取代和未取代的C4-C2o杂芳基及其混合物，其中所述杂芳基包括硫、 氮和氧中的至少一个；
优选的化合物是由结构1代表的化合物，其中R选自取代和未取 代的、支链和直链饱和的CrC24烷基，取代和未取代的、支链和直链 CrC24烯基，取代和未取代的、支链和直链QrC24二烯基，取代和未取 代的、支链和直链C6-C24三烯基，和取代和未取代的、支链和直链C8-C24 四烯基或其混合物。
可由R代表的烷基、烯基、二烯基、三烯基和四烯基可以是直链 或支链的含有最高达约24个碳原子的脂族烃基，并且可以被取代，例 如被1-3个选自下列的基团取代d-C6-烷氧基、氰基、C2-CV烷氧基 羰基、C2-CV烷酰基氧基、羟基、芳基、杂芳基、巯基、硫醚、二硫化 物和卣素。术语"d-C6-烷氧基"、"C2-CV烷氧基羰基"和"C2-C64 酰基氧基"是用于指分别对应于结构-OR2、 -002112和-OCOI^的基团， 其中112是C!-CV烷基或取代的d-CV烷基。术语"C3-Cs-环烷基"是 用于指具有3-8个碳原子的饱和碳环烃基。
R可代表的芳基可包括苯基、萘基或蒽基，以及被l-3个选自下列 的取代基取代的苯基、萘基或蒽基d-(V烷基、取代的d-CV烷基、 CVCk)芳基、取代的C6-Ck)芳基、C-C6-烷氧基、卣素、羧基、氰基、 d-CV烷酰基氧基、d-CV烷硫基、d-C6-烷基磺酰基、三氟曱基、羟 基、C2-CV烷氧基羰基、C2-C6-烷酰基氨基和-0-R3、 S-R3、 -S02-R3、 -> 1302113和->^(^02113,其中R3是苯基、萘基，或者被l-3个选自下 列的取代基取代的苯基或萘基d-CV烷基、C6-C1()芳基、d.CV烷氧 基和卣素。杂芳基包括5-或6-元芳环，其含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原 子。这样的杂芳基的实例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡 唑基、噻唑基、异噻唑基、P恶唑基、异鹏唑基、三唑基、噻二唑基、P恶 二唑基、四唑基、吡咬基、嘧啶基、苯并Jt恶唑基、苯并p塞唑基、苯并 咪唑基、吲哚基等。杂芳基可以被取代，例如被最高达3个基团取代，
所述基团是例如d-C6-烷基、d-C6-烷氧基、取代的C广C6-烷基、卤素、 d-CV烷硫基、芳基、芳硫基、芳氧基、C2-Qs-烷氧基羰基和C2-C6-烷
酰基氨。杂芳基还可以被稠合环系例如苯并或萘并残基取代，所述稠
合环系可以是未取代的或者是被取代的，例如被最高达3个在前一句
子中提出的基团取代。术语"囟素"是用于指氟、氯、溴和碘。
优选的本发明化合物是式1化合物，其中R-CO是亚油酰基、硬脂 酰基、亚麻酰基、共轭的亚油酰基、椋榈酰基、油酰基、花生酰基、 肉豆蔻酰基、月桂酰基、棕榈油酰基、硫辛酰基、4-苯基丁酰基、环己 基乙酰基、苯基乙酰基、N-Boc 3-口引咮丁酰基和庚二酰基或其混合物。
本发明的第二个实施方案包括将短链视黄酯2:
与长链酸或长链酯在有机溶剂和酶存在下，并且任选在至少一种分子 筛和/或至少一种离子交换树脂存在下反应，以形成所需视黄酯1。
短链视黄酯的取代基R4选自氢、CrC4取代或未取代的烷基和 C2-C4烯基。d-C4烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正 丁基、异丁基、仲丁基等。C2-C4烯基的实例包括乙烯基、l-丙烯基、 l-异丙烯基、l-丁烯基等。优选的取代基R4包括曱基和乙基，曱基是 最优选的。短链视黄酯可以以纯净形式使用，或者在吸收剂例如植物 油存在下使用，其中稀释剂的百分比可以为0-90%。
该方法是在选自下列的惰性溶剂存在下进行环状或非环状醚溶 剂，例如乙醚、二异丙基醚、叔丁基曱基醚或四氬呋喃，芳烃例如苯、 曱苯或二甲苯，脂族或环脂族饱和或不饱和烃例如己烷、庚烷、环己烷或苧烯，卣代烃例如二氯甲烷、二氯乙烷、二溴乙烷、四氯乙烯或 氯苯，极性非质子溶剂例如乙腈、二甲基曱酰胺或二曱亚砜，或其混
合物。优选的溶剂是曱苯、芋烯和乙腈。该方法可以在约-100。C至溶 剂沸点的温度下，优选约0-60。C,最优选20-50°C的温度下进行。基 于2，长链酸或长链酯的量可以为0.85至20当量，并且优选为1至10 当量。用于本发明方法的酶选自蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶或酯酶。优 选的酶是脂肪酶。这些脂肪酶可以呈全细胞、分离的天然酶或固定在 载体上的形式。这些脂肪酶的实例包括但不限于Lipase PS (得自假单胞 菌属(尸化wJomo憩s w)物种)、Lipase PS-C (得自假单胞菌属物种，固定 在陶瓷上)、Lipase PS-D (得自假单胞菌属物种，固定在硅藻土上)、 Lipoprime 50T、 Lipozyme TL IM或Novozyme 435 (得自南极，i丝酵母 (CVmc//<ia awtorc/7ca), 固定在丙丈希酉臾杉于月旨上)。
本发明方法可以任选在选自分子筛或离子交换树脂的各种添加剂 存在下进行。特别优选的是弱碱性离子交换树脂，因为与没有离子交 换树脂的相同反应相比，这些材料意料不到地提高了 2转化成1的转 化率。这些树脂的实例是AmberliteR或AmberlystK弱碱性树脂，例如 Amberlite IRA-95、 Amberlite IRA-94和Amberlyst A-21,虽然似乎^壬^f可 弱碱性树脂都是可接受的。
本发明方法的产物可以使用本领域技术人员已知的方法例如萃 取、过滤或结晶来分离。如果需要的话，可以使用本领域技术人员已 知的方法例如萃取、色谱法、蒸馏或结晶来纯化产物1。
实施例
通过以下实施例来进 一 步举例说明本发明提供的新方法。 实施例1:
使用1当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸一见黄酯(33 mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中。加入亚油 酸(28mg; l.O当量)，然后力。入120 mg Novozyme 435。将该反应混合 物搅拌，并且在50。C加热1小时，然后取出样本，并且通过HPLC分 析，结果表明49.8%转化成亚油酸视黄酯，含有39.8%乙酸视黄酯和 10.4%视黄醇。HPLC (4.6 x 150 mm Zorbax SB-C8柱[Agilent]， 3.5p厚度，甲醇洗脱 剂，在3S0nm检测)tR 4."分钟(亚油酸视黄酯)；tR2.!32分钟(乙酸视 黄酯)；tR2.08分钟(视黄醇)。
实施例2:
在亲有机物质的分子筛存在下用1当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中，并且加到 100 mg亲有机物质的分子筛中。加入亚油酸(28 mg; l.O当量)，然后 加入120 mg of Novozyme 435。将该反应混合物搅拌并且在50°C加热 l小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明53.2%转化成 了亚油酸视黄酯，含有14.4%乙酸视黄酯和32.4%视黄醇。
实施例3:
在AmberlitelRA-95存在下使用1当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中，并且加到 50mg干燥的AmberliteIRA-95中。加入亚油酸(28mg; l.O当量)，然 后加入120 mg of Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌2小时， 然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明72.3%转化成了亚油酸 视黄酯，含有16.3。/。乙酸视黄酯和11.3°/。视黄醇。再搅拌2天，没有获 得任何进一步的改变。
实施例4:
使用1当量亚油酸制备亚油酸j见黄酯in the presence of AmberlystA-21 将乙酸视黄酯(33 mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中，并且加到 50 mg干燥的AmberlystA-21中。加入亚油酸(28mg; l.O当量)，然后 加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌2小时，然后 取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明71.7%转化成了亚油酸视黄 酯，含有17.7%乙酸视黄酯和10.6%视黄醇。再搅拌2天，没有获得任 何进一步的改变。
实施例5:
使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄酯将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中。加入亚油 酸(56mg; 2.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合 物在室温搅拌2小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表 明63.4%转化成了亚油酸视黄酯，含有30.5%乙酸视黄酯和4.8%视黄醇。
实施例6:
在AmberlvstA-21存在下使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯，并且加到50 mg 干燥的Amberlyst A-21.亚油酸(56 mg; 2.0当量)然后加入120 mg Novozyme 435. 将该反应混合物在室温搅拌2小时，然后取出样本， 并且通过HPLC分析，结果表明79.0%转化成了亚油酸一见黄酯，含有 14.1%乙酸视黄酯和6.9%视黄醇。搅拌过夜没有获得任何进一步改变。
实施例7:
在植物油中使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(52%在植物油中的混合物，63mg; 0.10mmol)溶解 在5 mL甲苯中。加入亚油酸(56 mg; 2.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物搅拌并且在50。C加热1小时，然后取 出样本，并且通过HPLC分析，结果表明71.7%转化成了亚油酸视黄酯， 含有18.0%乙酸视黄酯和10.2%视黄醇。
实施例8:
使用5当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中。加入亚油 酸(140mg; 2.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合 物在室温搅拌2小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表 明78.7%转化成了亚油酸视黄酯，含有17.6%乙酸一见黄酯和3.7%一见黄 醇。
实施例9:
在AmberlvstA-21存在下^f吏用5当量亚油酸制备亚油酸—见黄酯
将乙酸—见黄酯(33 mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中，并且加到50 mg干燥的Amberlyst A-21中。加入亚油酸(140 mg; 5.0当量)，然 后加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌2小时，然 后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明87.4%转化成了亚油酸视 黄酯，含有9.2%乙酸视黄酯和3.4%视黄醇。搅拌过夜没有获得任何进 一步改变。
实施例10:
在植物油中使用5当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(52%在植物油中的混合物，63mg; 0.10mmol)溶解 在5 mL曱苯中。加入亚油酸(140 mg; 5.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物搅拌，并且在50°C加热1小时，然后 取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明83.0%转化成了亚油酸视黄 酯，含有10.9%乙酸视黄酯和6.2%视黄醇。
实施例11:
在乙腈中使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
在超声下将乙酸视黄酯(500 mg; 1.52 mmol)溶解在3.5 mL乙腈中。 加入亚油酸(850 mg; 3.04 mmol; 2.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌19小时，然后取出样本，并且通过 HPLC分析，结果表明28.7%转化成了亚油酸视黄酯，含有70.8%乙酸 一见黄酯和0.5%纟见黄醇。
实施例12:
在Amberlvst A-21存在下在乙腈中使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄
在超声下将乙酸视黄酯(500 mg; 1.52 mmol)溶解在3.5 mL乙腈中。 加入干燥的Amberlyst A-21 (0.25 g)。加入亚油酸(850 mg; 3.04 mmol; 2.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅 拌19小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明58.5%转. 化成了亚油酸视黄酯，含有40.0%乙酸视黄酯和1.6%视黄醇。
实施例13:在g烯中使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(500 mg; 1.52 mmol)和亚油酸(850 mg; 3.04 mmol; 2.0当量)溶解在3.5 mL苧烯中,加入Novozyme 435 (120 mg),并且将 该反应混合物在室温搅拌23小时，然后取出样本，并且通过HPLC分 析，结果表明65.8%转化成了亚油酸视黄酯，含有32.3%乙酸视黄酯和 1.9%视黄醇。
实施例14:
在Amberlvst A-21存在下在，烯中使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄
将乙酸视黄酯(500 mg; 1.52 mmol)和亚油酸(850 mg; 3.04 mmol; 2.0当量)溶解在3.5 mL苧烯中。加入干燥的Amberlyst A-21 (0.25 g)和 Novozyme 435 (120 mg),并且将该反应混合物在室温搅拌23小时，然 后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明90.3%转化成了亚油酸视 黄酯，含有8.5%乙酸视黄酯和1.2%视黄醇。
实施例15:
使用2当量亚油酸制备亚油酸视黄酯并且分离产物
将乙酸视黄酯(4.11 g; 12.5 mmol)和亚油酸(7.01 g; 25.0 mmol; 2.0 当量)溶解在35 mL甲苯中。加入Novozyme 435 (1.0 g)和干燥的 AmberlystA-21 (2.1 g)，并且将该反应混合物抽空并且将该反应混合物 抽空，并且用氮气填充10次。将该反应混合物在黑暗中于室温搅拌5.5 小时，这时HPLC分析表明90.3%转化成了亚油酸视黄酯(9.1%乙酸视 黄酯和0.6%一见黄醇)。将该反应混合物过滤并浓缩，然后与庚烷浓缩两 次(每次10mL)。将残余物溶解在庚烷(50mL)中，并且用2 x 80 mL的 10%碳酸钾水溶液和甲醇的1:1混合物洗涤。将有机层进一步用饱和碳 酸氢钠(10mL)、水(30mL)和曱醇(40mL)的混合物洗涤，干燥(硫酸钠) 并浓缩，获得了 5.14 g(75。/())黄色油状物。将一部分该材料(4.00 g)溶解 在40mL庚烷中，并且用20 mL甲醇洗涤。将庚烷层浓缩，获得了 3.77 g (71%总产率)亚油酸纟见黄酯。分析该产物表明90.9%亚油酸纟见黄酯 (HPLC面积百分比)，0.26 wtM亚油酸和0.06 wt。/。视黄醇。将初始含水 萃取液(使用10%碳酸钟水溶液和甲醇的1:1混合物)用25 mL 3 M HC1酸化至pHl。将所得混合物用20mL庚烷萃取。将有机溶液用硫酸钠 干燥并浓缩，获得了 3.91 g(56。/。初始装料)回收的亚油酸，其适用于再 使用。
实施例16:
使用1当量亚油酸甲酯制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中。加入亚油 酸曱酯(30mg; 1.0当量)，然后力口入120 mg Novozyme 435。将该反应 混合物在室温搅拌过夜，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果 表明49.3%转化成了亚油酸视黄酯，含有36.9%乙酸视黄酯和13.8%视 黄醇。
实施例17:
采用Lipase PS用1当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中。加入亚油 酸(28 mg; 1.0当量)，然后加入120 mg Lipase PS (Amano)。将该反应 混合物在室温搅拌45小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结 果表明1.4%转化成了亚油酸视黄酯，含有97.5%乙酸视黄酯和1.1%视 黄醇。
实施例18:
采用Lipase PS在AmberlystA-21存在下用1当量亚油酸制备亚油酸牙见 黄酯
将乙酸视黄酯(33 mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中，并且加到 50 mg干燥的AmberlystA-21中。加入亚油酸(28mg; l.O当量)，然后 加入120 mg Lipase PS (Amano)。将该反应混合物在室温搅拌45小时， 然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明10.0%转化成了亚油酸 视黄酯，含有87.3%乙酸视黄酯和2.7%视黄醇。
实施例19:
采用Lipase PS-C用1当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中。加入亚油酸(28 mg; l.O当量)，然后加入120 mg Lipase PS國C (Amano)。将该反 应混合物在室温搅拌45小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析， 结果表明46.1 %转化成了亚油酸视黄酯，含有48.7%乙酸视黄酯和5.2%
视黄醇。
实施例20:
采用Lipase PS-C在Amberlvst A-21存在下使用1当量亚油酸制备亚油 酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中，并且加到 50mg干燥的AmberlystA-21中。加入亚油酸(28mg; l.O当量)，然后 加入120 mg Lipase PS-C (Amano)。将该反应混合物在室温搅拌45小 时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明68.8%转化成了亚 油酸视黄酯，含有23.6%乙酸视黄酯和7.6%视黄醇。
实施例21:
采用Lipase PS-D用1当量亚油酸制备亚油酸一见黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中。加入亚油 酸(28mg; 1.0当量)，然后加入120 mg Lipase PS-D (Amano)。将该反 应混合物在室温搅拌45小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析， 结果表明35.4%转化成了亚油酸视黄酯，含有63.4。/。乙酸视黄酯和1.2% 一见黄醇。
实施例22:
采用Lipase PS在Amberlvst A-2存在下使用1当量亚油酸制备亚油酸 视黄酉旨
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中，并且加到 50mg干燥的AmberlystA-21中。加入亚油酸(28mg; l.O当量)，然后 加入120 mg Lipase PS-D (Amano)。将该反应混合物在室温搅拌45小 时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明69.2%转化成了亚 油酸视黄酯，含有25.8%乙酸视黄酯和5.0%视黄醇。
实施例23:采用Lipozyme TIIM使用1当量亚油酸制备亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL曱苯中。加入亚油 酸(28 mg; 1.0当量)，然后加入120 mg Lipozyme TI IM (Novozyme)。 将该反应混合物在室温搅拌45小时，然后取出样本，并且通过HPLC 分析，结果表明2.0%转化成了亚油酸视黄酯，含有94.9%乙酸视黄酯 和3.2%视黄醇。
实施例24:
采用Lipozvme TI IM在Amberlyst A-21存在下使用1当量亚油酸制备 亚油酸视黄酯
将乙酸视黄酯(33mg; 0.10 mmol)溶解在5 mL甲苯中，并且加到 50 mg干燥的Amberlyst A-21中。加入亚油酸(28mg; l.O当量)，然后 加入120 mg Lipozyme TI IM (Novozyme)。将该反应混合物在室温搅拌 45小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明14.6%转化 成了亚油酸视黄酯，含有84.7%乙酸视黄酯和0.7%视黄醇。
实施例25:
半分批制备亚油酸视黄酯
在500 mL烧瓶内，将乙酸视黄酯(22.0 g; 80%在油中的混合物； 53.6 mmol)和亚油酸(Pamolyn 200; 15.0 g; 53.6 mmol; l.O当量)溶解 在160 mL曱苯中。经由蠕动泵将烧瓶中的浸管连接到含有6.0 g Novozyme 435的柱上，所述柱按顺序连接在含有6.0 g干燥的Amberlyst A-21的第二个柱上。从第二个柱伸出的管返回最初的烧瓶内。泵开始 (流速6mL/分钟)经由这两个柱递送反应混合物到反应器内。6小时后， 转化已经达到了71%,停止该泵，并且通过以下操作来再生Amberlyst 树脂移去柱，并且将内含物用100mL10o/。三乙胺在甲苯中的混合物 (用100 mL曱苯雕镂)洗涤。装配装置，并且再开始启动泵。又过了 3 小时后，转化已经达到了75%,并且停止该泵。将反应器(80mL)的大 约50%内含物取出，并且将11.0 g 80%乙酸碎见黄酯和7.5 g亚油酸在80 mL甲苯中的混合物加到反应器中以用作第一反应物补充。如上所述将 Amberlyst树脂再生，再装配装置，并且开始启动泵。9小时后，已经 达到了73.6%转化率，并且停止泵。将反应器(80 mL)的大约50。/。内含物取出，并且将11.0g80。/。乙酸视黄酯和7.5g亚油酸在80mL曱苯中 的混合物加到反应器中以用作第二次补充。如上所述将Amberlyst树脂 再生，再装配装置，并且开始启动泵。12小时后，已经达到了 75.0% 转化率，并且停止反应。
实施例26:
亚油酸g旨(视黄基-CLA)
将乙酸视黄酯(l.OO g; 3.04 mmol)溶解在8.5 mL曱苯中，并且加 入Pamolyn 380共轭亚油酸(1.71 g; 6.09 mmol; 2.0当量)，然后加入 120 mg Novozyme 435和0.5g干燥的Amberlyst A-21 。 4寻该反应混合物 在室温搅拌15小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明 87.20/o转化成了视黄基-CLA,含有10.9%乙酸视黄酯和2.0%视黄醇。 将该反应混合物过滤并浓缩，然后与庚烷浓缩两次(每次10mL)。将残 余物溶解在庚烷(15mL)中，并且用2x20 mL的10%碳酸钾水溶液和曱 醇的1:1混合物洗涤。将有机层用饱和碳酸氢钠(2.5 mL)、水(7.5 mL) 和曱醇(10mL)的混合物进一步洗涤，干燥(硫酸钠)并浓缩，获得了 1.34 g(80。/。)黄色油状物。分析该产物表明90.5。/o视黄基-CLA(HPLC面积百 分比)、0.4 wt。/o共辄亚油酸和0.13%视黄醇。
HPLC (4.6x150 mm Zorbax SB-C8柱[Agilent], 3.5 p厚度，曱醇洗脱剂， 在350 nm检测》tR4.39、 4.88、 5.65、 6.06分钟(视黄基-CLA异构体)； tR2.32分钟(乙酸视黄酯)；tR2.08分钟(视黄醇)。
实施例27:
在Amberlyst A-21存在下用Tonalin FFA共轭亚油酸制备视黄醇的共轭 亚油酸酯(视黄基-CLA)
将乙酸视黄酯(l.OO g; 3.04 mmol)溶解在8.5 mL甲苯中，并且加 入Tonalin FFA共辄亚油酸(l.71 g; 6.09 mmol; 2.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435和0.5g干燥的Amberlyst A-21 。将该反应混合物在室 温搅拌15小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明88.6% 转化成了视黄基-CLA,含有9.7%乙酸视黄酯和1.7%视黄醇。将该反 应混合物过滤并浓缩，然后与庚烷浓缩两次(每次10mL)。将残余物溶解在庚烷(15mL)中，并且用2x20 mL的10%碳酸钾水溶液和曱醇的1:1 混合物洗涤。将有机层用饱和碳酸氬钠(2.5 mL)、水(7.5 mL)和曱醇(10 mL)的混合物进一步洗涤，干燥(硫酸钠)并浓缩，获得了 1.29 g (77%) 黄色油状物。分析该产物表明92.8。/。视黄基-CLA(HPLC面积百分比)， 0.8 wt。/。共辄亚油酸和0.1%一见黄醇。
实施例28:
在Amberlvst A-21存在下制备棕榈酸视黄酯
将乙酸一见黄酯(l.OO g; 3.04 mmol)溶解在8.5 mL曱苯中，并且加 入棕榈酸(1.56 g; 6.09 mmol; 2.0当量)，然后加入120 mg Novozyme 435 和0.5g干燥的AmberlystA-21。将该反应混合物在室温搅拌15小时， 然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明89.2%转化成了棕榈酸 视黄酯，含有9.1%乙酸视黄酯和1.7%视黄醇。将该反应混合物过滤并 浓缩，然后与庚烷浓缩两次(每次10mL)。将残余物溶解在庚烷(15 mL) 中，并且用2x20 mL的10%石友酸钾水溶液和曱醇的1:1混合物洗涤。 将有机层用饱和碳酸氢钠(2.5 mL)、水(7.5 mL)和曱醇(10 mL)的混合物 进一步洗涂，干燥(硫酸钠)并浓缩，获得了 1.25 g (78%)黄色油状物。 分析该产物表明91.2。/。棕榈酸视黄酯(HPLC面积百分比)、0.4 wt。/。棕榈 酸和0.2%视黄醇。
HPLC (4.6x150 mmZorbax SB-C8柱[Agilent], 3.5 p厚度，甲醇洗脱剂, 在350 nm检测)tR 5.52分钟(棕榈酸视黄酯);tR 2.32分钟(乙酸视黄酯); tR2.08分钟(视黄醇)。
实施例29:
在Amberlvst A-21存在下制备油酸岸见黄酯
将乙酸视黄酯(l.OO g; 3.04 mmol)和千燥的Amberlyst A-21 (0.5 g) 与8.5mL曱苯合并。加入油酸(1.72g; 6.09 mmol; 2.0当量)，然后加 入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌15小时，然后 取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明89.2%转化成了油酸视黄酯， 含有9.0%乙酸视黄酯和1.9%视黄醇。将该反应混合物过滤并浓缩，然 后与庚烷浓缩两次(每次10mL)。将残余物溶解在庚烷(15mL)中，并且 用2x20 mL的10%碳酸钾水溶液和曱醇的1:1混合物洗涤。将有机层用饱和碳酸氢钠(2.5 mL)、水(7.5 mL)和甲醇(10 mL)的混合物进一步洗 涤，干燥(硫酸钠)并浓缩，获得了 1.16g(69。/。)黄色油状物。 HPLC (4.6x150 mmZorbax SB-C8柱[Agilent], 3.5 p厚度，甲醇洗脱剂， 在350 nm检测)tR 5.65分钟(油酸视黄酉旨);tR 2.32分钟(乙酸视黄酉旨); tR2.08分钟(视黄醇)。
实施例30:
在Amberlvst A-21存在下制备硫辛酸视黄酯
将乙酸视黄酯(1.00g; 3.04mmol)和硫辛酸(1.26 g; 6.09 mmol; 2.0 当量)与干燥的Amberlyst A-21 (0.5 g)合并。加入曱苯(3.5mL),将该混 合物超声，并且加入120 mgNovozyme 435。将该反应混合物在室温搅 拌21小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明85.3°/。转 化成了硫辛酸视黄酯，含有12.8%乙酸视黄酯和1.9%视黄醇。将该反 应混合物过滤并浓缩，把残余物溶解在1:1乙酸乙S旨:庚烷(20 mL)中。 将该溶液用10 mL 10%>暖酸钾水溶液洗涤，然后用10 mL^:包和^友酸氢 钠(5 mL)和水(5 mL)的混合物洗涤。将有纟几溶液干燥(^克酸钠)并浓缩， 获得了 1.06 g(71。/。)黄色油状物。
HPLC (4.6x150 mm ZorbaxSB画C8柱[Agilent]， 3.5 ji厚度，曱醇洗脱剂， 在350 nm检测》tR 2.68分钟(硫辛酸视黄酯)；tR 2.32分钟(乙酸视黄酯)； tR2.08分钟(视黄醇)。
实施例31:
在Amberlvst A-21存在下制备4-苯基丁酸4见黄酯
将乙酸一见黄酯(250 mg; 0.76 mmol)和4-苯基丁酸(125 mg; 0.76 mmol; 1.0当量)与干燥的Amberlyst A-21 (125 mg)合并。加入曱苯(2.5 mL),并且加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌21 小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明67.8%转化成了 4-苯基丁酸视黄酯，含有24.3%乙酸视黄酯和7.8%视黄醇。
不采用AmberlystA-21的相应反应获得了 50.4%的转化。 HPLC (4.6x150 mm Zorbax SB-C8柱[Agilent], 3.5 p厚度，曱醇洗脱剂， 在350 nm检测)tR 2.56分钟(4-苯基丁酸视黄酯)；tR2.32分钟(乙酸视 黄酯)；tR2.08分钟(视黄醇)。实施例32:
在AmberlvstA-21存在下制备环己基乙酸视黄酯
将乙酸视黄酯(500 mg; 1.52 mmol)和环己基乙酸(216 mg; 1.52 mmol; 1.0当量)与干燥的Amberlyst A-21 (0.25 g)合并。加入曱苯(3.5 mL),并且加入120mgNovozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌18 小时，然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明64.6%转化成了 环己基乙酸视黄酯，含有33.5%乙酸视黄酯和1.8%视黄醇。
不采用AmberlystA-21的相应反应获得了 44.2%的转化。 HPLC (4.6x150 mm ZorbaxSB-C8柱[Agilent]， 3.5p厚度，用80:20曱 醇:水(0.P/qTFA)洗脱15分钟，经由10分钟梯度变至100%曱醇，在100% 曱醇保持5分钟，在3S0nm检测)tR 26.1分钟(环己基乙酸视黄酯)； tR21.1分钟(乙酸视黄酉旨);tR 11.8分钟(视黄醇)。
实施例33:
在AmberlvstA-21存在下制备苯基乙酸^L黄酯
将乙酸视黄酯(500 mg; 1.52 mmol)和苯基乙酸(207 mg; 1.52 mmol; 1.0当量)与干燥的Amberlyst A-21 (0.25 g)合并。加入甲苯(3.5 mL),并 且加入120 mg Novozyme 435。将该反应混合物在室温搅拌19小时， 然后取出样本，并且通过HPLC分析，结果表明58.5%转化成了苯基乙 酸视黄酯，含有40.0%乙酸视黄酯和1.6%视黄醇。
不采用AmberlystA-21的相应反应获得了 28.7%的转化。 HPLC (4.6x150 mm Zorbax SB画C8柱[Agilent], 3.5 p厚度，曱醇洗脱剂， 在350 nm检测)tR4.67分钟(苯基乙酸视黄酯)；tR2.32分钟(乙酸视黄 酯)；tR2.08分钟(视黄醇)。
实施例34:
制备W-Boc 3-口引咮丁酸一见黄酯
将乙酸一见黄酯(33 mg; 0.10 mmol)和N-Boc吲咮國3-丁酸(31 mg; 0.10 mmol; 1.0当量)合并。力口入曱苯(3.5 mL),并力o入120 mg Novozyme 435。 将该反应混合物在50。C搅拌4天，然后取出样本，并且通过HPLC分 析，结果表明50.6%转化成了 W-Boc 3-吲哚丁酸视黄酯，含有44.8%乙酸牙见黄酯和4.6%一见黄醇。
HPLC (4.6x150 mm ZorbaxSB曙C8柱[Agilent]， 3.5p厚度，用80:20曱 醇:水(0.1。/。TFA)洗脱15分钟，经由IO分钟梯度变至100%甲醇，在100% 甲醇保持5分钟，在350 nm检测)tR 26.7分钟(iV-Boc 3-吲哚丁酸视黄 酯)；tR21.1分钟(乙酸视黄酯)；tR 11.8分钟(视黄醇)。
实施例35: 制备庚二酸视黄酯
将乙酸视黄酯(500 mg; 1.52 mmol)和庚二酸(488 mg; 3.04 mmol; 2.0当量)合并。加入曱苯(5.0 mL),并且加入120 mg Novozyme 435。 将该反应混合物在室温搅拌2天，然后取出样本，并且通过HPLC分 析，结果表明36.5%转化成了庚二酸视黄酯和二-庚二酸视黄酯的混合 物，含有61.8%乙酸视黄酯和1.8%视黄醇。
HPLC (4.6x150 mm ZorbaxSB-C8柱[Agilent]， 3.5^厚度，用80:20曱 醇:水(0."/。TFA)洗脱15分钟，经由IO分钟梯度变至100%甲醇，在100% 甲醇保持5分钟，在350 nm检测)tR 20.3, 29.0分钟(庚二酸视黄酯 和二庚二酸视黄酯)；tR21.1分钟(乙酸视黄酯);tR 11.8分钟(视黄醇)。
已经用其优选的实施方案详细描述了本发明，但是应当理解，可 以在本发明实质和范围内进行各种变型和修饰。
权利要求
1.制备长链视黄酯的方法，所述方法包括将式2的短链视黄酯与长链酸或长链酯在有机溶剂和酶存在下反应，以形成长链视黄酯，其中R4选自氢、C1-C4烷基和C2-C4烯基。
2. 权利要求l的方法，其中所述d-C4烷基包括以下基团中的至 少一个曱基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和仲丁基。
3. 权利要求1的方法，其中所述。2-。4烯基包括以下基团中的至 少一个乙烯基、l-丙烯基、1-异丙烯基和l-丁烯基。
4. 权利要求l的方法，其中R是曱基或乙基。
5. 权利要求l的方法，其中所述R是曱基。
6. 权利要求1的方法，其中所述短链视黄酯是纯净形式或者在稀 释剂中。
7. 权利要求6的方法，其中所述稀释剂是植物油，并且以0至 90%的量存在。
8. 权利要求l的方法，其中所述方法是在选自下列的惰性溶剂中 进行醚溶剂、烃溶剂、极性非质子溶剂及其混合物。
9. 权利要求8的方法，其中所述醚溶剂选自乙醚、二异丙基醚、 叔丁基甲基醚、四氢呋喃及其混合物。
10. 权利要求8的方法，其中所述烃溶剂选自苯、曱苯、二曱苯、 己烷、庚烷、环己烷、苧烯、二氯曱烷、二氯乙烷、二溴乙烷、四氯 乙烯、氯苯及其混合物。
11. 权利要求8的方法，其中所述极性非质子溶剂选自乙腈、二甲 基曱酰胺、二曱亚砜及其混合物。
12. 权利要求1的方法，其中所述方法是在约-100。C至溶剂沸点 的温度下进行。
13. 权利要求12的方法，其中所述温度是约0-60。C。
14. 权利要求13的方法，其中所述温度是约20-50°C。
15. 权利要求l的方法，其中基于所述短链视黄酯的量，长链酸或 长链酯以约0.85至20当量的量存在。
16. 权利要求15的方法，其中基于所述短链视黄酯的量，长链酸 或长链酯以约1.0至10当量的量存在。
17. 权利要求1的方法，其中所述酶选自蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶 和酉旨酶。
18. 权利要求17的方法，其中所述脂肪酶是全细胞、分离的天然 酶或固定在载体上。
19. 权利要求1的方法，其中所述方法是在至少一种分子筛和离子 交换树脂存在下进行。
20. 权利要求19的方法，其中所述分子筛是亲有机物质的分子筛。
21. 权利要求19的方法，其中所述离子交换树脂是碱性离子交换 树脂。
22. 权利要求21的方法，其中基于短链视黄酯的量，所述碱性离 子交换树脂是以10%至1000%重量的量存在。
23. 权利要求l的方法，其中所述方法还包括经由萃取、色谱法、 蒸馏或结晶来分离视黄酯。
24. 制备由通式1代表的长链视黄酯的方法所述方法包括将短链视黄酯与长链酸或长链酯在有机溶剂和酶存在下 反应，以形成长4连;現黄酯，其中R是至少一个选自下列的基团Q-C24烷基、CrC24烯基、C4-C24二烯基、C6-C24三烯基、Cs-C24四烯基、C3-Cg环烷基、。6-。2()碳环芳基和QrC2o杂芳基，其中所述杂芳基包括硫、氮和氧中的至少一个。
25.权利要求24的方法，其中所述烷基、烯基、二烯基、三烯基、 四烯基或环烷基被1-3个选自下列的基团取代CrCV烷氧基、氰基、 C2-CV烷氧基羰基、C2-Qr烷酰基氧基、羟基、芳基、杂芳基、巯基、硫醚、二硫化物和卣素。
26. 权利要求24的方法，其中所述碳环芳基包括苯基、萘基和蒽基中的至少一个。
27. 权利要求26的方法，其中所述苯基、萘基或蒽基被l-3个选 自下列的取代基取代d-CV烷基、取代的d-C6-烷基、C6-do芳基、 取代的CVCk)芳基、d-CV烷氧基、卣素、羧基、氰基、d-CV烷酰基 氧基、d-CV烷硫基、d-CV烷基磺酰基、三氟甲基、羟基、C2-CV烷 氧基羰基、C2-C6-烷酰基氨基和-0-R3、 S-R3、 -S02-R3、 -NHS02R3和 -NHC02R3,其中W是苯基、萘基或者被l-3个选自下列的基团取代的 苯基或萘基C广C6-烷基、C6-C!o芳基、C卜CV烷氧基和卤素。
28. 权利要求24的方法，其中所述杂芳基包括含有1-3个选自氧、 硫和氮的杂原子的5或6元芳环中的至少 一 个。
29. 权利要求28的方法，其中所述杂芳基包括以下基团中的至少 一个噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑 基、嚼唑基、异嗯唑基、三唑基、p塞二唑基、P恶二唑基、四唑基、吡 啶基、嘧啶基、苯并ff恶唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基和吲哚基。
30. 权利要求24的方法，其中所述方法是在选自下列的惰性溶剂 中进行醚溶剂、烃溶剂、极性非质子溶剂及其混合物。
31. 权利要求30的方法，其中所述醚溶剂选自乙醚、二异丙基醚、 叔丁基甲基醚、四氢呋喃及其混合物。
32. 权利要求30的方法，其中所述烃溶剂选自苯、甲苯、二曱苯、 己烷、庚烷、环己烷、芋烯、二氯曱烷、二氯乙烷、二溴乙烷、四氯 乙烯、氯苯及其混合物。
33. 权利要求30的方法，其中所述极性非质子溶剂选自乙腈、二 甲基甲酰胺、二曱亚砜及其混合物。
34. 权利要求24的方法，其中所述方法是在约-100。C至溶剂沸点 的温度下进行。
35. 权利要求34的方法，其中所述温度是约0-60。C。
36. 权利要求35的方法，其中所述温度是约20-50°C。
37. 权利要求24的方法，其中基于所述短链视黄酯的量，长链酸 或长链酯以约0.85至20当量的量存在。
38. 权利要求37的方法，其中基于所述短链视黄酯的量，长链酸或长链酯以约1.0至10当量的量存在。
39. 权利要求24的方法，其中所述酶选自蛋白酶、脂肪酶、磷脂 酶和酯酶。
40. 权利要求39的方法，其中所述脂肪酶是全细胞、分离的天然 酶或固定在载体上。
41. 权利要求24的方法，其中所述方法是在至少一种分子筛和离 子交换树脂存在下进行。
42. 权利要求41的方法，其中所述分子筛是亲有机物质的分子筛。
43. 权利要求41的方法，其中所述离子交换树脂是碱性离子交换 树脂。
44. 权利要求43的方法，其中基于短链视黄酯的量，所述碱性离 子交换树脂是以10%至1000%重量的量存在。
45. 权利要求24的方法，其中所述方法还包括经由萃取、色谱法、 蒸馏或结晶来分离视黄酯。
全文摘要
经由化学酶方法，在酶存在下，由短链视黄酯与适当长链酸或酯制备视黄醇的长链酯。使用各种不同添加剂提高了所需酯的产率并且促进了其纯化。
文档编号C12P23/00GK101553574SQ200780037515
公开日2009年10月7日 申请日期2007年9月18日 优先权日2006年10月6日
发明者N·W·博亚兹, S·K·克伦登宁 申请人:伊士曼化工公司