专利名称：REIC/Dkk-3基因的部分片段和包含所述部分片段的癌症治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用肿瘤抑制基因(即REIC/Dkk-3基因片段)对癌细胞凋亡进行的诱导、包含REIC/Dkk-3基因片段的癌细胞凋亡诱导剂、和包含
所述凋亡诱导剂的癌症治疗剂。
背景技术：
癌细胞的选择性去除在癌症治疗中起着关键的作用。不同类型的基因突变在肿瘤发生和癌症发展期间在细胞内出现(Vogelstein, B.等，TrendsGenet 9， 138-41, 1993)，且这些突变可以作为癌症基因疗法的靶标。当给定类型的基因过表达时，这些基因表现出选择性杀死癌细胞的效果。所述基因的代表性实例包括p53 (Chen， R L.等，Science 250， 1576-80， 1990;Fujiwara, T.等，J. Natl. Cancer Inst， 86, 1458-62， 1994; Nielsen, L. L.等，Cancer Gene Ther., 4， 129-38， 1997)和mda画7 (Fisher, R B.等，Cancer Biol.Ther.， 2， S23-37, 2003)，且所述基因被称作癌症抑制基因。
同时，已知REIC/Dkk-3基因与细胞永生化有关，并且据报道，在癌细胞中该基因的表达受到抑制(WO 01/038523， Tsuji， T.等，Biochem.Biophys. Res. Commun., 268, 20-4， 2000; Tsuji, T.等，Biochem. Biophys. Res.Commun., 289， 257-63， 2001; Nozaki， I.等，Int. J. Oncol" 19， 117-21, 2001;和Kurose, K.等，J. Urol" 171， 1314-8， 2004)。
REIC/Dkk-3基因是Dkk家族的一员，并且表明该基因通过Wnt受体而抑制Wnt信号传输(Bafico, A.等，Nat. Cell Biol" 3， 683-6, 2001;和Hoang, B. H.等，Cancer Res., 64, 2734-9, 2004)。据报道，所述Wnt基因在诸如细胞生长、分化和癌化等重要生物学条件中起着多重作用(Moon，R. T.等，Science 296， 1644-6,2002)。因此也认为所述Dkk家族(目前已知在人类中存在4种基因)在细胞生长、分化和癌化中起着关键的作用，尽管其大多数功能仍然未知。
目前，关于内质网应激的研究已经得到了发展。体内合成的分泌蛋 白被转移到内质网并由多种分子伴侣或折叠酶进行有效的折叠。然而， 折叠并非总能充分地进行，在这种情况下，具有较高级结构的异常蛋白
在内质网内凝集，从而诱导内质网应激(D. Thomas Rutkowski等，TRENDS in Cell Biology第14巻，第1瓶第20-28月，2004年1月)。据报道，细 胞可能由于由所述内质网应激诱导的凋亡而死亡(Mori K.， Traffic, 4, 519-528,2003)。
发明内容
本发明提供了包含REIC/Dkk-3基因片段的癌细胞凋亡诱导剂和包 含所述凋亡诱导剂的癌症治疗剂。
到现在为止，本发明人已证明，通过腺病毒强制表达REIC/Dkk-3 会诱导诸如前列腺癌细胞等癌细胞的凋亡，正常细胞在同一条件下不会 受到明显影响，且在动物移植模型中会观察到治疗癌症的显著效果(日 本专利第3813872号和WO 2006/098074)。此外，本发明人已进行了关 于表现强烈的凋亡诱导效果的REIC/Dkk-3蛋白区域和表现凋亡诱导效果 的机理的集中研究。
因此，本发明人发现了以下几点。
(1) 当将REIC/Dkk-3基因导入CHO细胞以强制表达REIC/Dkk-3且 对所述癌细胞施用在培养基中分泌的REIC/Dkk-3蛋白时，没有观察到凋 亡。
(2) 在通过REIC/Dkk-3基因的强制表达使癌细胞凋亡时，JNK被激 活且JNK抑制剂抑制了对凋亡的诱导。JNK通过各种因素激活，己知内 质网应激是一个重要因素。
(3) 由内质网内异常蛋白凝集引起的应激诱导的CHOP和BIP基因 伴随REIC/Dkk-3基因的强制表达而被诱导。
(4) 当使促进蛋白正常构象的构建的Hsp蛋白诱导剂作用于癌细胞 时，所述癌细胞没有发生凋亡。相反，当允许Hsp蛋白抑制剂作用于正常细胞时，在所述正常细胞内的凋亡受到诱导，所述正常细胞内通常不
会通过REIC/Dkk-3基因的强制表达而发生凋亡。
(5)通过部分肽的强制表达而诱导癌细胞凋亡，所述部分肽没有 REIC/Dkk-3的固有功能。
基于所述发现，本发明人发现了将内质网应激参与作为REIC/Dkk-3 诱导癌细胞凋亡的机理的可能性。
此外，本发明人还发现，在癌细胞内表达的REIC/Dkk-3基因片段会 诱导凋亡且会导致癌细胞死亡。这导致了本发明的完成。
具体而言，本发明涉及REIC/Dkk-3基因片段。另外，本发明涉及这 样的REIC/Dkk-3基因片段，所述REIC/Dkk-3基因片段会引起导入该 REIC/Dkk-3基因片段的细胞的内质网应激。此外，本发明还涉及这样的 REIC/Dkk-3基因片段，所述REIC/Dkk-3基因片段会诱导导入了该 REIC/Dkk-3基因片段的细胞的凋亡。
本发明涉及这样的载体，该载体能够在含有REIC/Dkk-3基因片段的 细胞内表达该REIC/Dkk-3基因片段。
此外，本发明还涉及包含上述片段或包含含有该片段的载体的凋亡 诱导剂。由该片段或载体诱导的凋亡通过内质网应激进行诱导。
此外，本发明还涉及包含上述片段或包含含有该片段的载体的癌症 治疗剂。
此外，本发明还涉及REIC/Dkk-3蛋白片段，所述蛋白片段为会引起 施用该片段的细胞发生内质网应激的部分肽。此外，本发明还涉及 REIC/Dkk-3蛋白片段，所述蛋白片段为会引起施用该片段的细胞的凋亡 的多肽片段。
此外，本发明还涉及包含所述多肽片段的凋亡诱导剂。由该多肽片
段诱导的凋亡通过内质网应激进行诱导。
此外，本发明还涉及包含含有上述多肽片段的载体的癌症治疗剂。 本说明书包括在日本专利申请第2006-289040号的说明书和/或附图
中公开的部分或全部内容，该专利申请是本申请的优先权文件。
图1显示了 REIC/Dkk-3片段。
图2显示了 REIC/Dkk-3基因片段诱导细胞死亡的活性。
图3是显示由REIC/Dkk-3基因片段(第I部分)诱导的PC3细胞死 亡的状态的照片。
图4是显示由REIC/Dkk-3基因片段(第II部分)诱导的PC3细胞 死亡的状态的照片。
图5显示了 PC3和OUMS-24对诱导由REIC/Dkk-3基因片段所诱导 的凋亡的效果;其中A显示了关于PC3的结果，而B显示了关于OUMS-24 的结果。
图6是显示REIC/Dkk-3片段对内质网应激标记蛋白的诱导的照片。 图7显示了所述REIC/Dkk-3基因片段对间皮肿瘤细胞系凋亡的诱导。
图8是显示当使用FuGENE将含有所述REIC/Dkk-3基因片段作为 诱导试剂的质粒导入间皮肿瘤细胞系时的细胞死亡状态的照片。
图9是显示当使用CytoPure将含有所述REIC/Dkk-3基因片段作为 诱导试剂的质粒导入间皮肿瘤细胞系时的细胞死亡状态的照片。
图10是显示所述REIC/Dkk-3基因片段在体内抑制肿瘤的效果的照片。
具体实施例方式
下文将对本发明进行详细的说明。
本发明的凋亡诱导剂或癌症治疗剂包含诱导凋亡且具有作为癌症治 疗剂的效果的REIC/Dkk-3基因片段作为活性成分。
REIC/Dkk-3基因的全长核苷酸序列和由该基因编码的蛋白的氨基 酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。在如SEQ ID NO: 2 所示的氨基酸序列中，包含第1 19个氨基酸的序列被推断为信号序列。 所述信号序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO: 7中，且其氨基酸序列显 示于SEQ ID NO: 8中。基于SEQ ID NO: 1的序列信息，REIC/Dkk-3基因可以从人类细胞或组织等获得。此外，该基因还可根据WO 01/038523 的说明书而获得。
诱导凋亡且具有作为癌症治疗剂的效果的本发明的REIC/Dkk-3基 因片段包括多核苷酸(a) (p)中的任一条，所述基因片段编码具有凋亡活 性的多肽；
(a) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽由如SEQ ID NO: 2所示的 REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39 78个氨基酸中的 任一个氨基酸的氨基酸序列组成；
(b) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽由从如SEQ ID NO: 2所示的 REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39 78个氨基酸中的 任一个氨基酸的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而 衍生的氨基酸序列组成，并且具有凋亡活性；
(c) 由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1 个核苷酸至第117 234个核苷酸中的任一个核苷酸的核苷酸序列组成的 多核苷酸；
(d) 在严格条件下与由核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并且编码具 有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与由如SEQ ID NO: 1所 示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1个核苷酸至第117 234个核 苷酸中的任一个核苷酸组成的核苷酸序列互补；
(e) 由编码如SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的核苷酸序列组成的多 核苷酸；
(f) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽由从如SEQ ID NO: 4所示的氨 基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列 组成，并且具有凋亡活性；
(g) 由如SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列组成的多核苷酸；
(h) 在严格条件下与由核苷酸序列组成的多核苷酸杂交且编码具有 凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与如SEQ ID NO: 3所示的 核苷酸序列互补；
(i) 有编码如SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(j)编码多肽的多核苷酸，所述多肽从如SEQ ID NO: 6所示的氨基 酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸衍生，并且具有凋亡活 性；
(k)由如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(1)在严格条件下与由核苷酸序列组成的多核苷酸杂交且编码具有
凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与如SEQ ID NO: 5所示的
核苷酸序列互补；
(m)包含编码多肽片段的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，所 述多肽片段包含由SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列 的第1 19个氨基酸的序列组成的信号肽，并且包含至少39个氨基酸但 不包含所述REIC/Dkk-3蛋白的全长序列；
(n)编码包含由如SEQIDNO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序 列的第1 19个氨基酸的序列组成的信号肽和具有凋亡活性的多肽的多 核苷酸，所述多肽包含从包含至少39个氨基酸残基但不包含所述 REIC/Dkk-3蛋白的全长序列的多肽片段的氨基酸序列通过取代、缺失或 添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列；
(o)包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包括编码信号序列 的核苷酸序列且包含至少117个核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全长核苷 酸序列，所述信号序列由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核 苷酸序列的第1 57个核苷酸的序列组成；或
(p)在严格条件下与包含核苷酸序列的多核苷酸杂交且编码具有凋 亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与包括编码信号序列的核苷 酸序列且包含至少117个核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全长核苷酸序列 的核苷酸序列互补，所述信号序列由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3 基因的核苷酸序列的第1 57个核苷酸的序列组成。
在上述(a)和(b)中，术语"如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白 的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39 78个氨基酸中的任一个氨基酸的 氨基酸序列"指N端为如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第1个氨基酸而C端为如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第39 78个氨基酸中 的任一个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列的氨基酸残基数为39 78。 该氨基酸序列包括包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第1个氨基 酸至第39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77或78个氨基酸的氨基酸序列。
在上述(c)和(d)中，术语"如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因 的核苷酸序列的第1个核苷酸至第117 234个核苷酸中的任一个核苷酸 的核苷酸序列"指5'端为如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的第1个核 苷酸而3'端为如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的第117 234个核苷 酸中的任一个核苷酸的核苷酸序列。核苷酸数为117 234，且该数目优 选对应于包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第1个氨基酸至第 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77或78个氨基酸的氨基酸序列。
在上述(b)、 (f)、 (j)和(n)中，在术语"通过取代、缺失或添加l个或 数个氨基酸的…氨基酸序列"中的术语"1个或数个"指1 10个，优选 为1 5个，且更优选为1或2个。
诱导凋亡且具有癌症治疗剂的效果的本发明的REIC/Dkk-3基因片 段包括编码氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列具有与氨基酸序列 (a)、 (e)、 (i)或(m)相比为至少85%，优选为90%以上，更优选为95%以上， 特别优选为97%以上的同源性，所述同源性使用例如BLAST (基本区域 比对 叟寻工具，Basic Local Alignment Search Tool)在National Center for Biological Information计算(使用例如缺省参数，即初始参数)。
在(d)、 (h)、 (l)和(p)中的在"严格条件"下，例如，用IXSSC、 0.1% SDS且在37°C进行杂交。在较为严格的条件下，用0.5X SSC、 0.1% SDS 且在42。C进行杂交。在更加严格的条件下，用0.2XSSC、 0.1% SDS且 在65。C进行杂交。于是，在更严格的杂交条件下，可以预期具有与探针 序列相比为更高同源性的DNA发生分离。应当注意的是，上述SSC、 SDS和温度条件的组合是举例说明，可通过将探针浓度、探针长度、杂交反 应时间和其它条件适当组合来实现必要的严格性。
诱导凋亡且具有癌症治疗剂的效果的本发明的REIC/Dkk-3基因片 段包括多核苷酸，所述多核苷酸是具有与多核苷酸(c)、 (g)、 (k)或(o)的核 苷酸序列相比为至少85%，优选为90%以上，更优选为95%以上，特别 优选为97M以上的同源性且具有诱导凋亡的活性的DNA，所述同源性使 用例如BLAST (基本区域比对搜寻工具)在National Center for Biological Information计算(使用例如缺省参数，即初始参数)。
上述(m)和(n)包括包含信号肽的REIC/Dkk-3蛋白片段。术语"包含 由如SEQIDNO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 19个 氨基酸的序列组成的信号肽的多肽片段的氨基酸序列，并且包含至少39 个氨基酸但不包含REIC/Dkk-3蛋白的全长序列"中的氨基酸残基数为例 如39、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、 105、 110、 115、 120、 125、 130、 135、 140、 145、 150、 155、 160、 165、 170、 175、 180、 185、 190、 195、 200、 205、 210、 215、 220、 225、 230、 235、 240、 245、 250、 255、 260、 265、 270、 275、 280、 285、 290、 300、 305、 310、 315、 320、 325、 330、 335或340。
上述(o)和(p)各自是包含编码信号肽的核苷酸区域的REIC/Dkk-3基 因片段。
这些片段在细胞内表达多肽，这些多肽被转移到内质网，但所述多 肽不能构成正常的更高级的结构。据认为这引起了内质网应激。本发明 的REIC/Dkk-3基因片段优选包含编码信号肽的核苷酸序列以使表达产物 被转移至内质网。
此外，本发明包括包含所述REIC/Dkk-3基因片段的载体。可将所述 载体导入受试对象中，以在所述受试对象体内表达由所述REIC/Dkk-3基 因片段编码的多肽并表现出诱导凋亡的效果。在基因治疗中，可根据传 统技术将目标基因导入受试对象内。在受试对象内导入基因的技术的实 例包括涉及病毒载体的使用的方法和涉及非病毒载体的使用的方法。各 禾中技术是已矢B的(Bessatsu Jikken-Igaku, Idenshi-Chiryo画No-Kisogijutsu(Basic Techniques for Gene Therapy (基因治疗基石出技术)),Yodosha Co.， Ltd., 1996; Bessatsu Jikken Igaku (Separate volume, Experimental Medicine (实验医学分册))，Idenshi donyu禾口 hatsugen kaiseki jikken-hou (Experimentation of gene introduction & expression analysis (基因导入禾口表 达分析实验))，Yodosha, Co., Ltd.;和日本基因治疗学会(Japan Society of Gene Therapy)(编),"Idenshi chiryo kaihatsu kenkyu handbook淳因治疗石开 发手册)，，，N.T.S., 1999)。
用于基因导入的病毒载体的代表性实例包括腺病毒载体、腺伴随病 毒载体和逆转录病毒载体。可通过将目标基因导入诸如解毒逆转录病毒 (detoxicated retrovirus)、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、 辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、仙台病毒(Sendai virus)、 SV40或HIV等DNA 或RNA病毒内并用所述病毒感染细胞来将目标基因导入所述细胞内。
当本发明的基因用于使用病毒的基因治疗时，优选使用腺病毒载体。 腺病毒载体的特征是(l)它能将基因导入多种类型的细胞内；(2)它能在 生长停滞期将基因有效地导入细胞内；(3)它能通过离心浓縮来获得高滴 度的病毒(10PFU/mL llPFU/mL以上)；和(4)它适用于将基因体内直 接导入组织或细胞中。作为用于基因治疗的腺病毒载体，已经开发了缺 乏El/E3区的第一代腺病毒载体(Miyake, S.等，Proc. Natl. Acad. Sci.， U.S.A., 93， 1320, 1996)、通过除E1/E3区外还缺失E2或E4区从而由第一 代腺病毒载体制备的第二代腺病毒载体(Lieber, A.等，J. Virol.， 70, 8944， 1996; Mizuguchi, H.和Kay, M. A.， Hum. Gene Ther.， 10， 2013， 1999)和缺乏 几乎所有腺病毒基因组的第三代腺病毒载体(GUTLESS) (Steinwaerder， D. S.等，J.Viro1.，73，9303, 1999)。可以没有特别限制地使用任何这类腺病毒 载体导入本发明的基因。此外，可以使用已赋予有将基因引入AAV染色 体中的腺-AAV杂交载体(adeno-AAV hybrid vector)(Recchia, A.等，Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 96， 2615， 1999)或能使用转座子基因将基因引入 染色体中的腺病毒载体，从而所述载体可应用于基因的长期表达。此外， 可以插入表现出对腺病毒纤维的HI环的组织特异性转移能力的多肽序 列使所述腺病毒载体具有组织特异性(Mizuguchi, H.和Hayakawa, T.,Nippon Rinsho, 7， 1544, 2000)。
作为另一种选择，可以使用其中已经引入诸如质粒载体等基因表达 载体的重组表达载体而不使用上述病毒来将目标基因导入细胞或组织 内。例如，可通过脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法或 使用微玻璃管直接注射DNA法来将基因导入细胞内。此外，可通过例如 使用内部脂质体的基因导入法、使用静电型脂质体的基因导入法、使用 HVJ脂质体的方法、使用经修饰HVJ脂质体的方法(g卩，HVJ-AVE脂 质体方法)、使用HVJ-E (包膜)载体的方法、受体介导的基因导入法、 使用基因枪利用载体(即金属颗粒)将DNA分子导入细胞内的方法、裸 DNA的直接导入法或使用各类高分子的基因导入法来将重组表达载体引 入细胞内。在此情形中，可使用任何表达载体，只要该载体能在体内表 达目标基因。这类载体的实例包括pCAGGS (Gene 108， 193-200， 1991)、 pBK-CMV、pcDNA3、pcDNAl和pZeoSV (Invitrogen， Stratagene)及pVAXl 载体。
包含所述REIC/Dkk-3基因片段的载体可适当包含用于转录所述基 因的启动子或增强子、聚A信号、用于标记和/或选择已经导入有所述基 因的细胞的标记基因等。在此情形下，可使用已知的启动子。
可通过例如直接将基因治疗剂导入体内的体内方法或间接体内方法 来将包含本发明的REIC/Dkk-3基因片段的药物组合物导入受试对象内， 在所述间接体内方法中，从人类提取给定的细胞、将基因治疗剂导入所 述离体细胞然后将所述细胞返回到体内(Nikkei Science, 1994年4月，第 20-45页；Gekkan Yakuji， 36(1)， 23-48, 1994; Jikken igaku zoukan, 12(15)， 1994;日本基因治疗学会(编)，Idenshi chiryo kaihatsu kenkyu handbook, N. T. S., 1999)。
此外，本发明的凋亡诱导剂或癌症治疗剂包含作为活性成分的 REIC/Dkk-3蛋白的多肽片段，所述多肽片段诱导凋亡且具有作为癌症治 疗剂的效果。
所述多肽片段包括如(a)、 (b)、 (e)、 (f)、 (i)或(j)所述的具有凋亡活性 的REIC/Dkk-3蛋白的多肽片段(a) 由如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 个氨基酸至第39 78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列组成的多 肽；
(b) 由从如SEQIDNO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第 1个氨基酸至第39 78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列通过取 代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列组成且具有凋亡 活性的多肽；
(e) 由如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的多肽；
(f) 由从如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1 个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列组成且具有凋亡活性的多肽；
(i)由如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列组成的多肽；和 (D由从如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1 个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列组成且具有凋亡活性的多肽。
REIC/Dkk-3蛋白的多肽片段(a)、 (b)、 (e)、 (f)、 (i)和(j)的细节如上所述。
由本发明的基因编码的本发明的蛋白诱导受体细胞的衰老状态或静 息状态并因此能介导癌细胞分化为非癌性细胞。例如，该蛋白可用于治 疗以抑制癌细胞或原始癌细胞的急性生长。
一般而言，肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，而后一类肿瘤统称为"癌症"。
可以使用本发明的蛋白治疗的肿瘤不受特别限制，良性肿瘤和恶性 肿瘤都可治疗，且本发明的蛋白对恶性肿瘤特别有效。
恶性肿瘤根据肿瘤形成的器官位置分为颅神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、 肺癌、肝癌、淋巴瘤/白血病、结肠癌、胰腺癌、肛门癌/直肠癌、食道癌、 子宫癌、乳腺癌、骨瘤/骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤 (mesoep池elioma)和其它癌症。如上所述，可治疗的肿瘤不受特别限制， 且可以治疗上述肿瘤和癌症。本发明的蛋白对前列腺癌、肺癌、肝癌、 胃癌、食道癌、头颈癌、卵巢癌和骨瘤/骨肉瘤特别有效。所述蛋白对前 列腺癌和间皮癌更为有效，并且对高度恶性前列腺癌特别有效。本文所用术语"高度恶性前列腺癌"指例如Gleason评分为8以上的前列腺癌。 此外，在这些器官中形成的癌症根据组织学性质大致分为源自于上 皮细胞的癌、非源自于上皮细胞的肉瘤及其混合肿瘤。使用本发明的蛋 白能够治疗的肿瘤不受特别限制，源自于上皮细胞的癌、非源自于上皮 细胞的肉瘤及其混合肿瘤都可受治疗。本发明的蛋白对源自于上皮细胞 的癌特别有效。
本发明的药物组合物包含REIC/Dkk-3基因片段或包含所述基因片 段的载体、和药用载体、稀释剂或赋形剂。
此外，本发明的药物组合物包含REIC/Dkk-3多肽片段和药用载体、 稀释剂或赋形剂。
本发明的药物组合物可以以多种剂型施用。剂型的实例包括口服 施用剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂和糖浆剂；和胃肠外施用剂 型，如注射剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、滴眼剂、鼻剂和贴剂。
本发明的药物组合物可以局部施用。例如，可将所述组合物通过注 射施用到癌症部位以提供其效果。
本发明的药物组合物包含通常用在制药领域的载体、稀释剂和赋形 剂。例如，可以使用乳糖或硬脂酸镁作为片剂的载体或赋形剂。含生理 盐水、葡萄糖和其他佐剂的等渗溶液可以用作注射水溶液。等渗溶液可 与适当的增溶剂(如醇、诸如丙二醇等多元醇、或非离子表面活性剂) 组合使用。芝麻油或豆油等用作油性液体，并且苯甲酸苄酯或苯甲醇等 可以作为增溶剂组合使用。
剂量根据症状、年龄、体重和其它情况而变化。在REIC/Dkk-3基因 片段或包含所述片段的载体的情形中，剂量可以是以数日、数周或数月 为间隔的0.001 mg 100 mg所述REIC/Dkk-3多核苷酸片段，且该多核 苷酸片段可通过皮下注射、肌内注射或静脉内注射来施用。在REIC/Dkk-3 多肽片段的情形中，口服施用情形中的剂量可为每日约0.001 mg 100mg， 且该片段可以以一次剂量或数次分开剂量施用。在胃肠外施用的情形下， 可以通过皮下注射、肌内注射或静脉内注射来施用约0.001 mg 100mg 的剂量。下文将参考以下实施例对本发明进行详细说明，但本发明的技术范 围并不限于所述实施例。
实施例l: REIC/Dkk-3基因片段(l)的凋亡诱导 使用如下材料以下列方式进行该实施例。
(1) 细胞培养
使用添加了 10%胎牛血清的HAM'S F-12 K培养基培养来自人类前 列腺癌的细胞系(PC3)。
(2) 重组质粒的制备
使用合成引物通过PCR制备了 REIC/Dkk-3 (F: 1-350 aa(氨基酸))的 全长cDNA及其片段(l: 1-39 aa; 2: 1-78 aa)，用EcoRl和Xhol限制酶消 化所得物，然后将其引入质粒(pDNR-CMV) (pDNR-CMV-F 、 pDNR-CMV-l和pDNR-CMV-2)。图1显示了所述片段在REIC/Dkk-3蛋
白上的位置。
(3) 重组质粒在细胞内的导入
将如上制备的质粒通过磁转染导入所述PC3细胞内(将质粒、转染 试剂(DreamFect试齐!j; OZ BIOSC正NCES， Marseille France)和磁性纳米颗 粒混合，将所得物加入细胞培养体系，然后让所述细胞在磁板上静置30分 钟)。使用GFP表达质粒(pDNR-CMV-GFP)评价将质粒导入细胞内的效 率，发现该效率在导入后24小时高达约70%。
(4) 细胞死亡的评价
在所述质粒导入后72小时，对细胞死亡进行评价。通过涉及使用乙 锭同二聚体l (ethidium homodimer 1，对死亡细胞染色红色荧光)与 Hoechst 33342 (对所有细胞染色蓝色荧光)的组合的染色方法进行评 价。在该系统中，对100个细胞(即，Hoechst 33342阳性细胞)中的死 亡细胞数(即，乙锭同二聚体1阳性细胞)计数，总共进行四次，然后 确定死亡细胞的百分比。
图2显示了当所述REIC/Dkk-3片段在PC3细胞中表达时的死亡细 胞百分比。使用腺病毒-LacZ和pDNR-CMV-GFP作为阴性对照并使用腺 病毒-REIC (全长)作为阳性对照。对死亡细胞百分比进行确定，其中在使用腺病毒的情况中在感染后36小时时进行确定，而在使用质粒的情况
中则在感染后72小时时进行确定。如图2所示，发现片段1和片段2具 有高的诱导细胞死亡的活性。图3显示了在此情形中在相差显微镜下对 细胞状态的观察结果。相似地，在片段1和片段2中观察到了显著降低 的细胞密度。
实施例2: REIC/Dkk-3基因片段(2)的凋亡诱导
将PC3细胞(1X1()S细胞)接种到6孔板上，24小时后，使用 TransIT⑧-Keratinocyte试齐U (转染试剂，Minis Bio Corporation)将其中 已经插入有所述REIC片段的cDNA的pTracer-EF-A-l (#1: 1-39 aa)、 pTracer-EF-A陽2 (#2: 1-78 aa)和pTracer-EF-A-6 (全长1-350 aa)质粒导入 PC3细胞内。使用FuGENE⑧-HD试齐U(转染试齐!J， Roche Applied Science) 将质粒导入OUMS-24。 48小时后，用Hoechst 33342对仍然存活的细胞 进行核染色，然后在荧光显微镜下观察。使用GFP阳性细胞(含质粒的 细胞)作为分母计算已发生凋亡的细胞(即，核凝集的细胞)百分比。 此处也采用实施例1中所用的细胞培养条件。
向PC3导入基因所用的质粒能利用不同的启动子同时表达所插入的 基因(即，所述REIC/Dkk-3片段)禾BGFP。因此，GFP (绿色)检测能 实现对其中表达了所述REIC片段的细胞的间接检测。在导入后48小时， 评价细胞凋亡的诱导。图4显示了染色图像。如图4所示，在1和2的 情形中观察到了核(用Hoechst染色蓝色)己经显著凝集(即，凋亡) 的GFP阳性细胞。在图4中，符号(-)代表空质粒，即没有插入所述REIC 片段的pTracer-EF-A。
图5A显示了通过使用GFP阳性细胞(含质粒的相比)作分母计算 利用PC3的凋亡(g卩，核凝集的细胞)百分比的结果。在REIC片段1(#1: 1-39 aa)和2 (#2: 1-78 aa)中观察到了凋亡诱导的显著效果。图5B显示了 使用OUMS-24获得的结果。在PC3中观察到的凋亡诱导效果在正常成 纤维细胞OUMS-24中没有观察到。
实施例3: REIC/Dkk-3片段对内质网应激标记蛋白的诱导
将PC3细胞(1X1(^细胞)接种到10cm培养盘中，24小时后，使用TransIT-Keratinocyte试剂(转染试剂)将其中已经插入有所述REIC 片段的cDNA的pTmcer-EF-A-l (#1: 1-39 aa)、pTracer-EF-A-2 (#2: 1-78 aa) 和pTracer-EF-A-6 (全长l-350aa)质粒导入PC3细胞。使用FuGENE-HD 试剂(转染试剂)将质粒导入OUMS-24。 48小时后，回收细胞并通过蛋 白提取制备样品。对所得样品进行SDS-PAGE，然后通过Western印迹进 行目标蛋白的表达分析。
结果如图6所示。在图6中，"Ad-REIC"显示了与其中导入了诱导全 长REIC过表达的腺病毒载体的细胞有关的结果。"对照"代表与其中插 入了不含REIC片段的空质粒(即，pTracer-EF-A)的细胞有关的结果。 在PC3细胞中，质粒1 (#1: 1-39 aa)和2 (#2: 1-78 aa)都显著诱导了内质网 应激标记CHOP、 BIP和JNK的磷酸化。然而，在OUMS-24中没有观察 到该现象。
实施例4: REIC/Dkk-3基因片段在间质上皮肿瘤细胞系中对凋亡的
诱导
将211H人类恶性间皮肿瘤细胞(1X1()S细胞)接种到6孔板上， 24小时后，使用FuGENE -HD (Roche Applied Science)和CytoPure 试 剂(Nitto Denko Technical Corporation),并导入其中插入有所述REIC片段 的cDNA的pTracer画EF-A-l (#1: 1-39 aa)、 pTracer-EF-A-2 (#2: 1-78 aa)和 pTracer-EF-A-6 (全长l-350aa)质粒。48小时后，用Hoechst 33342对仍 然存活的细胞进行核染色，然后在荧光显微镜下观察。使用GFP阳性细 胞(含质粒的细胞)作为分母计算发生凋亡的细胞(即，核凝集的细胞) 百分比。
用于导入的质粒能利用不同启动子同时表达所插入的基因(即，所 述REIC/Dkk-3片段)和GFP。因此，GFP (绿色)检测能实现对表达所 述REIC片段的细胞的间接检测。导入后48小时，在荧光显微镜下观察 并评价细胞凋亡的诱导。使用GFP阳性细胞(含质粒的细胞)作为分母 计算发生凋亡的细胞(即，核凝集的细胞)百分比(图7)。结果，在质 粒1 (1-39 aa)和2 (1-78 aa)的情形中，作为FuGENE-HD试剂(图8)和 CytoPure试剂(图9)的应用结果，观察到了其中核(用Hoechst染色蓝色)己显著凝集(即，凋亡)的GFP阳性细胞。通过CytoPure试剂的 应用实现的凋亡诱导效果稍好于FuGENE-HD试剂的结果(图7)。 实施例5:体内肿瘤抑制
向人类恶性间皮肿瘤细胞系211H中引入荧光素酶表达基因，以获得 211H克隆4细胞(2X1()S细胞)，将所得物与Matrigd混合，然后将所得 物皮下异种移植到裸鼠内。3天后，通过IVIS (即，高灵敏度体内发光 成像系统)检査了皮下肿瘤形成情况，并在肿瘤形成部位注射 pTracer-EF-A-2 (#2: 1-78 aa)质粒/CytoPure的混合溶液(每日施用25昭 质粒一次，持续一周)。此后，终止施用，并在此后14天，通过IVIS (即， 高灵敏度体内发光成像系统)再次评价肿瘤形成情况。作为对照样品， 提供了单独施用Cytopure (CYTOPURE)的组以及施用Cytopure和对照载 体(表达红色荧光蛋白，CYTOPURE十pDsRed)的组。
图IO显示了所述结果。如图IO所示，在施用了所述REIC片段的5 只小鼠中有2只的肿瘤基本完全得到消除。
工业实用性
本发明的REIC/Dkk-3基因片段可用作能诱导诸如前列腺癌或间皮 癌等癌细胞的凋亡且能抑制所述癌症的癌细胞凋亡诱导剂或癌症治疗 剂。此外，本发明的REIC/Dkk-3基因片段及其表达产物具有小的分子量， 因此不易引起副作用。
本文通过参考引入本文所引用的所有出版物、专利和专利申请的全 部内容。
权利要求
1.编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(a)或(b)(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39～78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列；或(b)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含从如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39～78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并且具有凋亡活性。
2. 编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(c)或(d):(c) 包含如SEQIDNO: l所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1个核苷酸至第117 234个核苷酸中的任一个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸；或(d) 在严格条件下与包含核苷酸序列的多核苷酸杂交且编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1个核苷酸至第117 234个核苷酸中的任一个核苷酸的序列互补。
3. 编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(e)或(f):(e) 包含编码如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(f) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含从如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并且具有凋亡活性。
4. 编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(g)或(h):(g) 包含如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸；或(h) 在严格条件下与包含核苷酸序列的多核苷酸杂交且编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列互补。
5. 编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(i)或(j》(i) 包含编码如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(j)编码多肽的多核苷酸，所述多肽从如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸衍生，并且具有凋亡活性。
6. 编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(k)或(l):(k)包含如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的多核苷酸；或(1)在严格条件下与包含核苷酸序列的多核苷酸杂交且编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列互补。
7. 编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(m)或(n):(m)包含编码多肽片段的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽片段包含由如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 19个氨基酸的序列组成的信号肽，并且包含至少39个氨基酸但不包含所述REIC/Dkk-3蛋白的全长序列；或(n)编码包含由如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1 19个氨基酸的序列组成的信号肽并具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述多肽包含从包含至少39个氨基酸残基但缺乏所述REIC/Dkk-3蛋白的全长序列的多肽片段的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列。
8. 编码REIC/Dkk-3蛋白并编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸片段(O)或(p):(0)包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包括编码信号序列的核苷酸序列，并且包含至少117个核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全长核苷酸序列，所述信号序列由如SEQ ID NO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1 57个核苷酸的序列组成；或(P)在严格条件下与包含核苷酸序列的多核苷酸杂交且编码具有凋亡活性的多肽的多核苷酸，所述核苷酸序列与包括编码信号序列的核苷酸序列且包含至少117个核苷酸但不包含REIC/Dkk-3的全长核苷酸序列的核苷酸序列互补，所述信号序列由如SEQIDNO: 1所示的REIC/Dkk-3基因的核苷酸序列的第1 57个核苷酸的序列组成。
9. 一种载体，所述载体包含如权利要求1 8任一项所述的多核苷酸。
10. —种凋亡诱导剂，所述凋亡诱导剂包含如权利要求1 8任一项所述的多核苷酸作为活性成分。
11. 如权利要求10所述的凋亡诱导剂，所述凋亡诱导剂引起细胞内的内质网应激而诱导凋亡。
12. —种凋亡诱导剂，所述凋亡诱导剂包含如权利要求9所述的载体。
13. 如权利要求12所述的凋亡诱导剂，所述凋亡诱导剂引起细胞内的内质网应激而诱导凋亡。
14. 一种癌症治疗剂，所述癌症治疗剂包含如权利要求1 8任一项所述的多核苷酸作为活性成分。
15. 如权利要求14所述的癌症治疗剂，所述癌症治疗剂引起细胞内的内质网应激而诱导凋亡。
16. —种癌症治疗剂，所述癌症治疗剂包含如权利要求9所述的载体。
17. 如权利要求16所述的癌症治疗剂，所述癌症治疗剂引起细胞内的内质网应激而诱导凋亡。
18. 如权利要求14 17任一项所述的癌症治疗剂，其中，所述癌症为前列腺癌。
19. 如权利要求14 17任一项所述的癌症治疗剂，其中，所述癌症为间皮癌。
20. REIC/Dkk-3蛋白的具有凋亡活性的多肽片段(a)或(b):(a) 包含如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第l个氨基酸至第39 78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列的多肽;或(b) 包含从如SEQ ID NO: 2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39 78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性的多肽。
21. REIC/Dkk-3蛋白的具有凋亡活性的多肽片段(e)或(f):(e) 包含如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽；或(f) 包含从如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性的多肽。
22. REIC/Dkk-3蛋白的具有凋亡活性的多肽片段(i)或(D:(i)包含如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽；或(D包含从如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性的多肽。
23. —种凋亡诱导剂，所述凋亡诱导剂包含如权利要求20 22任一项所述的多肽作为活性成分。
24. —种癌症治疗剂，所述癌症治疗剂包含如权利要求20 22任一项所述的多肽作为活性成分。
25. 如权利要求24所述的癌症治疗剂，其中，所述癌症为前列腺癌。
26. 如权利要求25所述的癌症治疗剂，其中，所述癌症为间皮癌。
全文摘要
本发明提供了包含REIC/Dkk-3基因片段的癌细胞凋亡诱导剂和包含所述凋亡诱导剂的癌症治疗剂。本发明还提供了编码REIC/Dkk-3蛋白的多核苷酸片段(a)或(b)，所述片段编码具有凋亡活性的多肽(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39～78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列；或(b)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含从如SEQ ID NO2所示的REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列的第1个氨基酸至第39～78个氨基酸中的任一个氨基酸的氨基酸序列通过取代、缺失或添加1个或数个氨基酸而衍生的氨基酸序列且具有凋亡活性。
文档编号C12N15/09GK101541960SQ20078004346
公开日2009年9月23日 申请日期2007年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者公文裕巳, 许南浩, 费尔南多·吉耶尔莫·阿瓦苏亚·卡韦萨斯, 那须保友, 阪口政清 申请人:公文裕巳;许南浩;阪口政清;那须保友;费尔南多·吉耶尔莫·阿瓦苏亚·卡韦萨斯