包含含有三环二萜及其衍生物的混合物的鼠尾草提取物的膳食和药物组合物及其用途的制作方法

专利名称：包含含有三环二萜及其衍生物的混合物的鼠尾草提取物的膳食和药物组合物及其用途的制作方法
专利说明包含含有三环二萜及其衍生物的混合物的鼠尾草提取物的膳食和药物组合物及其用途 发明简述 本发明涉及鼠尾草提取物用作为药物，特别是用于治疗与受损的(例如降低的)神经传递相关的病症的用途，以及含有这类鼠尾草提取物的膳食和药物组合物及其用途，所述鼠尾草提取物含有三环二萜及其衍生物的混合物。

背景技术：
众所周知，受损的神经传递例如低神经递质水平与精神疾病相关，如抑郁和广泛性焦虑障碍(GAD)和提高的压力易感性。
能提高脑中的神经递质水平并从而提高它们的传递的化合物可显示抗抑郁特性以及对多种其它精神病症的有益作用(Neurotransmitters，Drugs andBrain Function R.A.Webster(ed)，John Wiley & Sons，New York，2001，p.187-211，289-452，477-498)。主要的神经递质是血清素、多巴胺、去甲肾上腺素(noradrenaline)(＝去甲肾上腺素(norepinephrine))、乙酰胆碱、谷氨酸、γ-氨基-丁酸以及神经肽。与情绪相关病症尤其相关的神经递质包括血清素、去甲肾上腺素和多巴胺。这样达成增强或延长的神经传递通过抑制进入突触前神经末端的再摄取，来提高突触间隙中的神经递质浓度，或通过抑制降解酶(如单胺氧化酶(MAO)-A和-B)来预防神经递质代谢。
抗抑郁药和情绪相关病症 三环抗抑郁化合物(TCA)如丙米嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和氯米帕明(clomipramine)抑制血清素和去甲肾上腺素的再摄取。它们被广泛认为是属于可获得的最有效的抗抑郁药，但是它们具有大量缺点，因为它们还与毒蕈碱乙酰胆碱-、组胺-和血清素-受体相互作用。这些活性导致的副作用除包括体位性低血压以外还包括口干燥、视力模糊、便秘和尿潴留。最重要的是，过量服用TCA是不安全的，通常显示急性心脏毒性。
另一类抗抑郁药是阻断血清素转运蛋白(SERT)的所谓的SSRI(选择性血清素再摄取抑制剂)，包括氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、西酞普兰(citalopram)和氟伏沙明(fluvoxamine)，它们能封闭血清素转运蛋白(SERT)——高亲和性的氯化钠依赖性神经递质转运蛋白，其通过摄取5-羟色胺来终止血清素激活的神经传递。。它们已被证明在治疗抑郁和焦虑症时与TCA同样有效，但是通常能被更好地耐受。这些药物通常以低剂量开始，并提高至其达到治疗水平。常见的副作用是恶心。其它可能的副作用包括降低的食欲、口干燥、出汗、感染、便秘、震颤、呵欠、嗜睡和性功能障碍。
另外，通过抑制MAOs -A和-B更广泛地预防神经递质代谢的化合物显示抗抑郁的作用。MAOs催化含胺基的神经递质如血清素、去甲肾上腺素和多巴胺的氧化。
另外，神经传递的调节剂(modulator)对精神和认知功能显示多效作用。
存在对治疗或预防精神疾病和/或病症的化合物的需要，所述化合物不显示已知抗抑郁药的不利副作用。许多患者对下述备选疗法感兴趣，所述备选疗法能够最小化高剂量药物相关的副作用，并产生累加的临床益处。严重的抑郁是一种长期并复发的疾病，其通常很少被诊断出来。另外，许多患者患有温和或中度严重的抑郁。因此，对下述化合物以及药物和/或膳食组合物开发的兴趣越来越大，所述化合物或组合物可被用于在风险人群中治疗精神疾病/病症或预防精神疾病/病症(如抑郁和抑郁症)的发生，以稳定情绪并达到感情平衡。
患者通常遭受由于GAD的复合病变(comorbidity)到抑郁或孤独，所述GAD是初级护理(～10％患者)中一种高度盛行的焦虑病症和慢性病(Wittchen，et al 2005 Eur.Neuropsycho.15357-376)。患者对他们的初级护理医师表达多种生理症状。GAD的特征是慢性紧张和焦虑的担忧和紧张(＞6个月)，这是无能为力并且不能控制的，并且伴随着特征性的警觉过度综合征(包括坐立不安、肌肉紧张和睡眠问题)。如果不治疗的话，GAD进行慢性的、波动的过程，并趋向于随着年龄变得越来越严重。GAD患者遭受亚综合征(subsyndromal)的抑郁，并作用于所有焦虑症和抑郁病症的最高的总体直接和间接健康经济负担。尽管GAD发病率高，但是很少有患者被诊断、开出药物处方或接受精神病治疗；需要帮助患者识别和监测的简单诊断工具。即使有特异的诊断，医师仍需要有效的GAD-症状疗法。SSRI如帕罗西汀对GAD治疗是有效的(Stocchi et al.2003，J.Clin.Psych.，63(3)250-258)。另外，全身性评估和有安慰剂作对照的RCT(随机化的临床试验)表明一些SSRI(依他普仑(escitalopram)、帕罗西汀和舍曲林)、SNRI(选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂)文拉法辛(venlafaxine)、一些苯并二氮杂卓类(阿普唑仑(alprazolam)和地西泮(diazepam))、TCA、丙米嗪和5-HT1A部分激动剂、丁螺环酮在急性治疗中均是有效的。一般而言，治疗的影响通常是中等的，当治疗周期停止时症状复发。因此，使用具有比SSRI更少的副作用并可长时间应用的化合物进行连续长期治疗或预防可能比药物治疗更有利。
情绪病症和职业压力(occupational stress)可导致睡眠障碍、失眠、低睡眠质量和昼夜节律(所谓的生物节律)的整体性失调；这些病症的性质通常是慢性和持久的。另外，由远距离航班(飞行时差(jet-lag))和轮班工作导致的昼夜节律失调可引起相似的症状和苦恼(distress)。因此，可能最期望的是用膳食补剂治疗，以维持正常的昼夜节律(人或动物所习惯的昼夜节律)和/或减轻和预防与紊乱的昼夜节律相关的症状，如认知功能和记忆损伤，和精神和生理疲劳。
发明详述 鼠尾草提取物及其优选的组分 已发现，根据本发明，包含下式I到III的三环二萜(衍生物)的鼠尾草提取物可用于用于治疗与降低的神经传递相关的病症的药物中，所述三环二萜(衍生物)即鼠尾草酚(式I的化合物)、鼠尾草酸(式II的化合物)和鼠尾草酸12-甲基醚(式III的化合物)。

也可任选地存在迷迭香酚(式IV的化合物)和/或20-脱氧鼠尾草酚(式V的化合物)。

特别优选的是(除了鼠尾草酚、鼠尾草酸和鼠尾草酸12-甲基醚以外)额外地含有迷迭香酚的鼠尾草提取物。
鼠尾草提取物中这些三环二萜的量可在下述范围内变化以鼠尾草提取物的总重为基础，对鼠尾草酸而言在从0.1到15重量-％的范围内(优选地从1到12重量-％，更优选地从9到11重量-％)，对鼠尾草酚而言在从0.01到10重量-％的范围内(优选地从2到8重量-％，更优选地从2到5重量-％)，和对鼠尾草酸12-甲基醚而言在从0.1到7重量-％的范围内(优选地从0.2到6重量-％，更优选地从3到5重量-％)，其中鼠尾草酸优选地是主要组分。
如果存在迷迭香酚，则其含量可在从0.1到1.0重量-％的范围内变化，优选地从0.1到0.7重量-％，更优选地从0.1到0.5重量-％。
如果存在20-脱氧-鼠尾草酚，则其含量可低于1.0重量-％，优选地，其可在从0.01到1.0重量-％的范围内变化，更优选地从0.05到0.8重量-％，最优选地从0.07到0.5重量-％。
术语“鼠尾草提取物”表示任何下述鼠尾草提取物，其含有三环二萜(衍生物)I、II和III，优选地含有三环二萜(衍生物)I、II、III和IV，更优选地含有三环二萜(衍生物)I、II、III、IV和V。合适的鼠尾草物种是Salvia officinalis、Salvia miltiorrhiza、Salvia lanigera、Salviacanariensis、Salvia fruticosa、Salvia mellifera、Salvia tomentosa、Salviadeserta、Salvia przewalskii和Salvia sclarea。优选的是Salvia officinalis。
适用于本发明用途的鼠尾草提取物可商业得自例如FLAVEXNaturextrakte GmbH，Rehlingen，德国。实施例(见下文)中使用以下两种提取物 (1)″Salbei Extrakt，Typ Nr.063.001″，以鼠尾草提取物的总重为基础含0.06重量-％的鼠尾草酚，0.14重量-％的鼠尾草酸和0.36重量-％的鼠尾草酸12-甲基醚(用纯物质作为参照，通过HPLC-UV在210nm处测量)。
(2)″Salbei Antioxidans Extrakt，Typ Nr.063.007″，以鼠尾草提取物的总重为基础含3.50重量-％的鼠尾草酚，10.70重量-％的鼠尾草酸，4.30重量-％的鼠尾草酸12-甲基醚，0.3重量-％的20-脱氧鼠尾草酚和0.3重量-％的迷迭香酚(用纯物质作为参照，通过HPLC-UV在210nm处测量)。
适合本发明目的的另一鼠尾草提取物含有以鼠尾草提取物总重为基础7.44重量-％的鼠尾草酚，1.56重量-％的鼠尾草酸，0.23重量-％的鼠尾草酸12-甲基醚，低于0.1重量-％的20-脱氧鼠尾草酚和0.41重量-％迷迭香酚(使用纯物质作为参考，通过HPLC-UV在210nm处测量)。
适用于本发明用途的鼠尾草提取物可根据以下两种方案之一制造 方案1 将干Salvia officinalis叶(原料)以机械方式变成小片，然后置于压强稳定的提取管中。然后在从25℃到75℃范围内的温度(优选地在约50℃的温度)和高压(优选地280bar)下，在存在小量乙醇时使超临界的CO2通过提取管，从而使得亲脂化合物溶解。在分离器中，在从15℃到45℃范围内的温度下(优选地在30℃的温度下)，通过减压至40到80bar范围内的压强(优选地通过减压至60bar)分离溶解的化合物(提取物)。CO2可被再循环回该过程中。可从14到20kg干Salvia officinalis叶中获得含有以下的约1kg鼠尾草提取物 鼠尾草酚(优选地含量以鼠尾草提取物的总重为基础从2到5重量-％)， 鼠尾草酸(优选地含量以鼠尾草提取物的总重为基础从7到15重量-％)， 鼠尾草酸12-甲基醚(优选地含量以鼠尾草提取物的总重为基础从2到7重量-％)， 迷迭香酚(优选地含量以鼠尾草提取物的总重为基础从0.1到1重量-％)， 20-脱氧鼠尾草酚(优选地含量以鼠尾草提取物的总重为基础从0.1到1重量-％)。
方案2 通过甲醇提取700g干Salvia officinalis叶，然后蒸发至干燥。随后进行溶剂-溶剂分离，所述分离使用己烷∶H2O，随后使用甲基叔丁基醚(MTBE)∶H2O。将MTBE级分蒸发至干燥。可获得40g该提取物，其产生富集量的松香烷和三萜(鼠尾草酚，含量优选地含量从5到10重量-％；鼠尾草酸，含量优选地从1到3重量-％；鼠尾草酸12-甲基醚，含量优选地从0.05到0.5重量-％；迷迭香酚，含量优选地从0.1到1重量-％；和20-脱氧鼠尾草酚，含量优选地低于0.1重量-％；所有含量以鼠尾草提取物的总重为基础)。如果需要的话，可随后进行MPLC色谱从提取物中去除齐墩果酸、桦木酸(betulinic acid)或熊果酸(产量25g)。
本领域技术人员已知产生下述鼠尾草提取物的其它提取方法，所述鼠尾草提取物富含鼠尾草酸、鼠尾草酚和鼠尾草酸12-甲基醚，并优选地还富含迷迭香酚和/或20-脱氧鼠尾草酚。
“鼠尾草酚”表示外消旋混合物以及纯(4aR，9S，10aS)-鼠尾草酚或纯(4aS，9R，10aR)-鼠尾草酚或它们的任何混合物或非对映异构体。优选(4aR，9S，10aS)-鼠尾草酚。
“鼠尾草酸”表示外消旋混合物以及纯(4aR，10aS)-鼠尾草酸或纯(4aS，10aR)-鼠尾草酸或它们的任何混合物或非对映异构体。优选(4aR，10aS)-鼠尾草酸。
“鼠尾草酸12-甲基醚”表示外消旋混合物以及纯(4aR，10aS)-鼠尾草酸12-甲基醚或纯(4aS，10aR)-鼠尾草酸12-甲基醚或它们的任何混合物或非对映异构体。优选(4aR，10aS)-鼠尾草酸12-甲基醚。
“迷迭香酚”表示外消旋混合物以及纯(4aR，9S，10aS)-迷迭香酚或纯(4aS，9R，10aR)-迷迭香酚或它们的任何混合物或非对映异构体。优选(4aR，9S，10aS)迷迭香酚。
“20-脱氧-鼠尾草酚”表示外消旋混合物以及纯(4aR，9S，10aS)-20-脱氧-鼠尾草酚或纯(4aS，9R，10aR)-20-脱氧-鼠尾草酚或它们的任何混合物或非对映异构体。(4aR，9S，1OaS)-20-脱氧-鼠尾草酚是优选的。
鼠尾草提取物及其组分的用途 因此，本发明一方面涉及含有这些三环二萜(衍生物)I、II和III的鼠尾草提取物，优选地涉及含有这类三环二萜(衍生物)I、II、III和IV的混合物的鼠尾草提取物，更优选地涉及含有这类三环二萜(衍生物)I到V的混合物的鼠尾草提取物，所述提取物用作治疗与降低的神经传递相关的病症的药物。
另一方面，本发明涉及含有三环二萜(衍生物)的混合物的具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物用于制造用于治疗与降低的神经传递相关的病症的组合物的用途，尤其是用于制造抗抑郁药、情绪/生活力改善剂、减压剂、状况改善剂、焦虑减轻剂、强迫行为减轻剂、弛缓剂、睡眠改善剂和/或失眠缓解剂的用途。
还在另一方面，本发明涉及包含含有三环二萜(衍生物)的混合物的鼠尾草提取物的膳食组合物，以及包含含有三环二萜(衍生物)的混合物的鼠尾草提取物和常规药物运载体的药物组合物。
另外，本发明涉及在动物(包括人)中治疗与降低的神经传递相关的病症的方法，所述方法包括对有需要的动物(包括人)施用有效剂量的下述鼠尾草提取物，所述鼠尾草提取物含有三环二萜(衍生物)的混合物。
在本发明的上下文中，动物包括人，并包括哺乳动物、水产养殖鱼和鸟。优选的“动物”是人、宠物和伴侣动物和农业动物。宠物和伴侣动物的例子是犬、猫、鸟、水族箱鱼(aquarium fish)、荷兰猪、(jack)兔、野兔和雪貂。农业动物的例子是鱼、猪、马、反刍类(牛、绵羊和山羊)和家禽。
在本发明的上下文中，“治疗”也包括共同治疗以及预防。“预防”可表示第一次发生(一级预防)或复发(二级预防)。
术语“降低的神经传递”在本申请中根据本领域技术人员公知的含义被使用，并涉及神经传递的失调，所述失调可在神经递质生物合成、加工、储存、释放、再摄取和受体结合的水平上发生。降低的神经传递在动物(包括人)中可自身表现为行为、感情、情绪和思考过程紊乱，例如表现为多种类型的抑郁之一。
因此，本发明还涉及在动物(包括人)中预防与降低的神经传递相关的病症的方法，所述方法包括对有需要的动物(包括人)施用有效量的具有上述定义和偏好的鼠尾草提取物，所述鼠尾草提取物含有三环二萜(衍生物)的混合物。在这一点上，有效量的鼠尾草提取物可特别用于维持精神正常，用于维持平衡的认知功能，用于帮助降低情绪波动的风险，用于帮助保持积极的情绪和用于支持认知健康，和用于帮助维持良好的睡眠质量。
在本发明的上下文中，术语“病症”还包括疾病。
用于治疗与降低的神经传递相关的病症的药物/组合物包括抗抑郁药、情绪/生活力改善剂、减压剂、状况改善剂、焦虑减轻剂和强迫行为减轻剂、弛缓剂、睡眠改善剂和/或失眠缓解剂。它们均改善、增强和支持神经传递，特别是在中枢神经系统中，并因而减轻精神功能障碍。
抗抑郁药是用于治疗精神-、行为-和感情/情感-、神经-、神经变性-、进食-和压力-相关病症的药物/组合物，所述病症如单相抑郁、双相抑郁、急性抑郁、慢性抑郁、亚慢性抑郁、抑郁症、产后抑郁、月经前病理性心境恶劣(dysphoria)/综合征(PMS)、更年期抑郁综合征、攻击、注意力缺陷病症、社交焦虑症、季节性情感障碍和焦虑(病症)如GAD、纤维肌痛综合征、创伤后应激病症、惊恐性障碍(panic disorders)和强制性障碍(obsessive-compulsive disorders)、下肢不宁综合征(restless leg syndrome)、神经质、偏头痛/原发性头痛和一般性疼痛、呕吐、食欲过盛、神经性厌食、狂饮-进食障碍、胃肠道病症、身心衰竭综合征(burn-out syndrome)和易激惹(irritability)。
抗抑郁药也可用于(制造组合物，所述组合物用于)对神经认知损伤进行一级和二级预防和/或治疗。另外，它们也能有效治疗抑郁症状或与受干扰的神经传递相关的、为慢性疾病(如心血管疾病、中风、癌症、阿尔茨海默病、帕金森氏症及其它)中的复合病变发生的其它症状，所述作。
因此，含有三环二萜衍生物的混合物的鼠尾草提取物以及含有它们的膳食/药物组合物适用于治疗动物(包括人)。
在本发明的又一实施方案中，含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物可用作一般情绪改善剂，以及用于制造用于这类用途的组合物(如膳食/药物组合物、食物、饮料)。“情绪改善剂”、“感情健康加强剂”或“生活力改善剂”表示经其治疗的人情绪增强，自我尊重提高和/或负面想法和/或负面紧张被减少。其还表示感情平衡，和/或一般(特别是精神)健康和生活力被改善或维持，以及情绪波动的风险(被帮助)降低，和正面情绪(被帮助)保留。
含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物一般也可用作用于动物(包括人)的焦虑减轻剂和/或强迫行为减轻剂；优选地用于人、宠物动物和农业动物。
“焦虑减轻剂”表示慢性紧张和焦虑的担忧和紧张被减少或减轻。警觉过度综合征(Hypervigilance syndrome)被减少或缓解，其包括不安(restlessness)、肌肉紧张(muscle tension)和睡眠问题。社交恐怖症和其它恐怖症被解决。一般而言，社交环境被体验为较不具有威胁性。所述人感情放松，体验舒适并享受陪伴和与其它人的接触。
“弛缓剂”、“睡眠改善剂”或“失眠缓解剂”表示改善睡眠开始比国内帮助人容易地进入睡眠，以整晚维持不受干扰的睡眠。其还表示归因于飞行时差(jet-lag)或轮班工作的昼夜节律相关的睡眠紊乱被纠正，与失眠相关的症状(即认知功能和记忆受损，精神和生理疲劳，多梦)被除去或缓解，总体生活质量和生机能量(vital energy)被提高。
另外，含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物以及包含有效剂量的它们的组合物可用于治疗、预防和缓解压力相关的症状，用于治疗、预防和缓解与超负荷工作、衰竭和/或身心衰竭相关的症状，用于提高对压力的抗性或耐性，和/或在正常健康个体中支持和促进放松，即这些组合物具有“减压剂”的作用。
另外，含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物适用于在人和动物中治疗、预防和缓解焦虑和强迫行为。
本发明的又一实施方案涉及含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物和含有它们的组合物(如膳食/药物组合物、食物、饮料)作为“状况改善剂”的用途，即作为下述手段的用途，所述手段用于在患病或正常的健康个体中降低应激性和疲劳，降低、预防或缓解生理和精神疲劳，和在更普遍的情况下提高能量，特别是提高脑能量生产。另外，用于一般认知改进，和特别用于维持或改善注意和集中，改善记忆和记忆能力，改善学习能力、语言加工、问题解决和智力功能；用于改善短期记忆；用于提高精神机警；用于增强精神警觉；用于减轻精神疲劳；用于支持认知健康和用于维持平衡的认知功能，用于调节饥饿和饱满感，和用于调节运动活动。
兽医用途 宠物和农业动物可处于需要增强的或改善的神经传递的状态下，所述增强或改善的神经传递可由本发明提供。动物可针对压力情况显示不利的行为和/或生理反映；在大量生产环境中饲养或在不利条件下运输的动物可显示肉或乳品质或数量的降低；应激的家禽可采取拔掉羽毛(feather-picking)、减少产卵和同种相残。许多动物在不利的居住或运输条件下会变得好斗或显示刻板-(stereotypic-)、焦虑-和强迫的行为。
因此，本发明的另一方面是含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物作为膳食/药物组合物的兽医用途。
在本发明的一个优选的实施方案中，含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物被施用，用于在农业动物中和大量生产的家畜饲养业、运输至屠宰场期间预防压力，和/或用于预防这类环境下所述农业动物的肉品质损失。农业动物优选地是家禽、牛、绵羊、山羊和猪。
在本发明的另一个优选的实施方案中，含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物被施用给家禽，用于预防拔掉羽毛和同种相残，所述拔掉羽毛和同种相残导致例如肉品质和卵生产的损失。
本发明的另一方面是在水产养殖中预防和/或缓解压力的方法，包括对有需要的动物施用含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物，其中所述动物是鱼或虾。
在本发明的另一个优选的实施方案中，含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物被施用给宠物或陪伴动物，用于减轻在压力条件下显示的压力、紧张和进攻性和强迫行为，所述压力条件如主人的分离、改变或丢失，假日分离期间和所谓的“动物旅馆”中的饲养，和动物保护地或保护区中的饲养。
本发明的再一方面是在用于皮毛工业的动物(优选地为水貂、狐狸和野兔)中预防/减少与压力条件相关症状的方法。
本发明优选的剂量和组合物 对本发明的目的而言，用于人的具有上述定义和偏好的鼠尾草酚提取物的合适的每日剂量可以是使得三环二萜(衍生物)在每天每kg体重0.001mg到每kg体重约20mg的范围内的剂量。更优选的是每kg体重从约0.01到约10mg三环二萜(衍生物)混合物的每日剂量，特别优选的是每kg体重从约0.05到5.0mg三环二萜(衍生物)混合物的每日剂量。
术语“膳食组合物”包括任何类型的(强化)食物/饲料和饮料，还包含临床营养品和膳食补充剂。根据本发明的膳食组合物可还含有保护性水胶体、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等等)、吸附剂、载体、填充剂、辅助化合物、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、遮味剂、增重剂、啫喱化剂(jellyfying agents)、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。
除了可药用载体和含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物以外，根据本发明的药物组合物还可含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂或稀释剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、湿润剂、填充剂等等。载体材料可以是适用于口/肠胃外/可注射施用的有机或无机惰性载体。
根据本发明的膳食和药物组合物可以是适用于对动物体(包括人体)施用的任何盖仑形式(galenic form)，特别是对经口施用而言常规的任何形式，例如固体形式如食物或饲料(用于食物或饲料的添加剂/补充剂)、食物或饲料预混合物、强化的食物或饲料、片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、胶囊和泡腾配制物如粉末和片剂，或液体形式如溶液、乳液或悬浮液，如例如饮料、糊剂和油悬浮液。糊剂可以被填充进硬壳或软壳胶囊中。其他应用形式的例子是用于经皮、肠胃外或可注射施用的形式。膳食和药物组合物可以是受控(延迟)释放配制物的形式。
强化食物的例子是谷物棒和烘焙物如蛋糕和曲奇。
饮料包括无醇饮品和含酒精的饮品，以及要添加进饮用水和液体食物中的液体制剂。无醇饮品为例如软饮、运动饮品、果汁、柠檬水、接近水的饮品(例如具有低卡路里含量的基于水的饮品)、茶和基于乳的饮品。液体食物为例如汤和乳制品(例如什锦谷物饮品)。
在用于人的固体剂量单位制剂中，三环二萜(衍生物)的混合物以下述用量适当地存在，所述用量在每剂量单位从约0.1mg到约1000mg的范围内，优选地在从约1mg到约500mg的范围内。可相应地计算含有三环二萜(衍生物)的混合物的、具有上述定义和优选性的鼠尾草提取物的量。
在膳食组合物，特别是用于人的食物和饮料中，三环二萜(衍生物)的混合物以下述量适当地存在，所述量以食物或饮料的总重为基础从约0.0001(1mg/kg)到约5重量-％(50g/kg)，优选地从约0.001％(10mg/kg)到约1重量-％，(10g/kg)，更优选地从约0.01(100mg/kg)到约0.5重量-％(5g/kg)。可相应地计算含有这类三环二萜(衍生物)混合物的鼠尾草提取物的量。
在本发明的一个优选的实施方案中，在食物和饮品中，三环二萜(衍生物)混合物的量在每份从10到30mg的范围内，即每kg食物或饮品120mg。可相应地计算含有这类三环二萜(衍生物)混合物的鼠尾草提取物的量。
对除人之外的动物而言，用于本发明目的的三环二萜(衍生物)混合物的量的合适的每日剂量可在每天每kg体重从0.001mg到每kg体重约1000mg。更优选的是在每kg体重从约0.1mg到约500mg的范围内的每日剂量，特别优选的是每kg体重从约1mg到100mg范围内的每日剂量。可相应地计算含有这类三环二萜(衍生物)混合物的鼠尾草提取物的量。
本发明通过以下的实施例进一步阐述。
实施例 在下述实验中使用了三种不同的鼠尾草提取物。
鼠尾草提取物A得自FLAVEX Naturextrakte GmbH，Rehlingen，德国(“Salbei Extrakt，Typ Nr.063.001”)。其含有以鼠尾草提取物总重为基础0.06重量-％的鼠尾草酚，0.14重量-％的鼠尾草酸和0.36重量-％的鼠尾草酸12-甲基醚，使用纯物质作为参考通过HPLC-UV(高效液相色谱-紫外)在210nm处测量。
鼠尾草提取物B得自FLAVEX Naturextrakte GmbH，Rehlingen，德国(“Salbei Antioxidans Extrakt，Typ Nr.063.007”)。其含有以鼠尾草提取物总重为基础3.50重量-％的鼠尾草酚，10.70重量-％的鼠尾草酸，4.30重量-％的鼠尾草酸12-甲基醚，0.3重量-％的20-脱氧鼠尾草酚和0.3重量-％迷迭香酚，用纯物质作为参考通过HPLC-UV在210nm处测量。如下生产提取物将干Salvia officinalis叶(原料)以机械方式变成小片，然后置于压强稳定的提取管中。然后在50℃的温度下、280bar的高压下、在存在小量乙醇时使超临界的CO2通过提取管，从而溶解亲脂化合物。在分离器中，在30℃的温度下，通过减压至60bar分离溶解的化合物(提取物)。CO2可被再循环回该过程中。可从14到20kg干Salvia officinalis叶中获得约1kg鼠尾草提取物B。
鼠尾草提取物C含有以鼠尾草提取物总重为基础7.44重量-％的鼠尾草酚，1.56重量-％的鼠尾草酸，0.23重量-％的鼠尾草酸12-甲基醚。低于0.1重量-％的20-脱氧鼠尾草酸和0.41重量-％的迷迭香酚，用纯物质作为参考通过HPLC-UV在210nm下测量。根据以下的步骤制造鼠尾草提取物C用甲醇提取700g干燥的生物材料(Salvia officinalis叶)，然后蒸发至干燥。随后进行溶剂-溶剂分离，所述分离使用己烷∶H2O，随后使用甲基叔丁基醚(MTBE)∶H2O。将MTBE级分蒸发至干燥。获得40g该提取物，其产生富集量的松香烷和三萜。
通过血浆膜转运蛋白质在突触接头处对它们的快速摄取和清除来调节单胺神经递质、血清素、多巴胺和去甲肾上腺素的作用。中枢单胺能神经元中的单胺转运蛋白负责多达90％被释放的神经递质的回收，并且是大量神经活性剂如可卡因、苯丙胺和抗抑郁药的高亲和力靶标。这些药剂通过阻断转运蛋白并因而防止神经元摄取，提高中枢和外周神经系统二者中的细胞外神经递质浓度，有助于其行为效应(behavioural effect)和自主效应(autonomic effect)。因此，通过以下三个实施例阐述一种或多种鼠尾草提取物对血清素、多巴胺和去甲肾上腺素摄取的抑制。
实施例1 含三环二萜(衍生物)的鼠尾草提取物对血清素摄取的抑制 从R.Blakely，Vanderbilt University，USA获得稳定表达人血清素再摄取转运蛋白(hSERT)的人胚肾(HEK-293)细胞。在含10％经透析的胎牛血清(Invitrogen)、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺和抗生素G418的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(Bioconcept)中常规地培养细胞，并通过胰蛋白酶消化来对细胞加以传代。测定当天，通过用温热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)柔和洗涤，从80％汇合烧瓶中收集细胞。然后通过离心将细胞洗涤一次，并以160μl缓冲液中10,000个细胞的浓度重悬于补充了35μM帕吉林(pargyline)、2.2mM CaCl2、1mM抗坏血酸和5mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-甲磺酸(HEPES缓冲液)的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(Sigma)中，并以每孔10,000个细胞分装于圆底聚丙烯96-孔微量滴定板(Corning)中。如下测定进入细胞的血清素摄取以20nM的浓度添加放射性标记的[3H]-血清素(GE Healthcare)，并在37℃下柔和摇动孵育40分钟。这段时间结束时，使用Tomtec Mach III M细胞收获仪，通过滤经Unifilter 96 GF/B平板(Perkin Elmer)去除未掺入的标签。使用Microscint-40/Topcount(PerkinElmer)，通过液体闪烁计数法定量保留在平板上的被掺入的血清素。
如下文所述来测定鼠尾草提取物A、B和C对血清素摄取的影响在添加[3H]-血清素之前10分钟或期间，将其以0.00316和100mg/ml之间的浓度范围包含在测定中。使用SSRI、氟西汀、(0.03nM-1μM)作为参考化合物。鼠尾草提取物A、B和C以浓度依赖性的方式抑制血清素通过转运蛋白的摄取。表1中显示针对鼠尾草提取物A、B和C对血清素摄取的抑制所计算的IC50值。
表1鼠尾草提取物A、B和C和氟西汀对血清素摄取进入经转染的HEK-293细胞的抑制。数据显示为均值±标准误差，其中进行了多次测定。
实施例2 鼠尾草提取物B对多巴胺摄取的抑制 在测定前涂布表达人多巴胺转运蛋白(hDAT)的中国仓鼠卵巢(CHO)-K1细胞。在改良的Tris-HEPES缓冲液(5mM Tris-HCl，7.5mM HEPES，pH7.1)中，将细胞(2×105/ml)与鼠尾草提取物B和/或载体于25℃下孵育20分钟，然后添加50nM[3H]-多巴胺孵育10分钟，所述改良的Tris-HEPES缓冲液还含有120mM NaCl、5.4mM KCl、1.2mM CaCl2、1.2mMMgSO4、5mM D-葡萄糖和1mM抗坏血酸。在存在10μM诺米芬辛(nomifensine)(多巴胺再摄取抑制剂)时测定特异信号。然后用1％SDS裂解缓冲液溶解细胞。相对于载体对照50％或更多(≥50％)的[3H]-多巴胺摄取减少表明显著的抑制活性。在十个浓度(0.00316-100μg/ml)下筛选鼠尾草提取物B，这些相同的浓度被同时应用于分离的细胞组，并且只有在观察到显著的摄取抑制时才评价可能的化合物诱导的细胞毒性。使用诺米芬辛(0.001-0.1μM)作为参考化合物。
表2针对鼠尾草提取物B和参考化合物诺米芬辛对多巴胺再摄取进入经转染的CHO-K1细胞的抑制，测量的IC50值。
实施例3 鼠尾草提取物B对去甲肾上腺素摄取的抑制 在测定前一天涂布稳定表达人去甲肾上腺素转运蛋白(hNAT)的MadinDarby犬肾(MDCK)细胞。在改良的Tris-HEPES缓冲液(5mM Tris-HCl，7.5mM HEPES，pH 7.1)中，将细胞(2×105/ml)与鼠尾草提取物B和/或载体于25℃下孵育20分钟，然后添加25nM[3H]-去甲肾上腺素孵育10分钟，所述改良的Tris-HEPES缓冲液还含有120mM NaCl、5.4mM KCl、1.2mMCaCl2、1.2mM MgSO4、5mM D-葡萄糖和1mM抗坏血酸。然后将各孔中的细胞冲洗两次，用1％SDS裂解缓冲液溶解，并分析裂解物以测定[3H]-去甲肾上腺素摄取。在存在10μM地昔帕明(desipramine)(三环抗抑郁药，其抑制去甲肾上腺素再摄取)时测定特异信号。相对于载体对照50％或更多(≥50％)的[3H]-去甲肾上腺素摄取减少表明显著的抑制活性。在十个浓度(0.00316-100μg/ml)下筛选鼠尾草提取物B，这些相同的浓度被同时应用于分离的细胞组，并且只有在观察到显著的摄取抑制时才评价可能的化合物诱导的细胞毒性。使用地昔帕明(0.5-50nM)作为参考化合物。
表3针对鼠尾草提取物B和参考化合物地昔帕明对去甲肾上腺素再摄取进入经转染的MDCK细胞的抑制，所测量的IC50值。
因此，通过上述体外测定中对血清素、多巴胺和去甲肾上腺素的抑制，鼠尾草提取物B被证明具有三重再摄取抑制作用。
实施例4 含三环二萜(衍生物)的鼠尾草提取物对单胺氧化酶的抑制 有机胺对-酪胺或苄胺分别被用作单胺氧化酶A(MAO-A)和B(MAO-B)酶的底物。通过与香草酸的反应定量该反应产生的H2O2，所述与香草酸的反应由辣根过氧化物酶(HRP)催化。
反应于37℃下在聚苯乙烯微量滴定板中进行。将MAO酶(终浓度2U/ml)与适宜的对-酪胺(Sigma，终浓度0.5mM)或苄胺(Sigma，终浓度0.5mM)任一和生色溶液(含香草酸(Fluka)、4-氨酰安替比林(Fluka)和辣根过氧化物酶(Sigma)，终浓度分别为0.25mM、0.125mM和1U/ml)在0.2M磷酸钾缓冲液pH 7.6中混合。孵育40分钟后，在微量滴定板吸光度读数器例如Spectramax M5(Molecular Devices Corporation)中于495nm下分析平板。
在与底物孵育之前10分钟和孵育期间，通过在测定中包含浓度范围在0.03和100μM之间的鼠尾草提取物A、B和C，测定它们对单胺氧化酶的影响。为了测定提取物对HRP-催化的反应部分的影响，用H2O2(Molecular Probes，终浓度50μM)代替MAO酶。含MAO-A和MAO-B的反应均以剂量依赖的方式被鼠尾草提取物抑制，而对照反应未受影响。表4中显示针对鼠尾草提取物对单胺氧化酶活性的抑制所测量的IC50值。
表4鼠尾草提取物A、B和C对MAO-A和MAO-B的抑制。结果显示为均值±标准误差。
实施例5 小鼠中鼠尾草提取物B对大理石埋藏测试中行为的影响 通过埋藏有害物体的大鼠论证“防御性埋藏”行为，所述有害物体例如其中装有味道令人不快的液体的饮水槽(Wilkie et al，1979J.Exp.Anal.Behav.31299-306.)或冲击针(shock prod)(Pinel et al.J.Comp.Phys.Psych.92708-712)。大理石埋藏测试被设计为这类测试的修改(Poling et al 1981.J.Expl.Anal.Behav.3531-44)。将大鼠暴露于个体笼中，所述每个笼每天含有25块大理石，连续持续10或21天。计数10天周期内每天被埋藏的大理石数，或21天暴露后24小时被埋藏的大理石数。作者报道大理石的埋藏不是由新奇确定，或归因于任何有害的刺激。
小鼠的大理石埋藏行为被报道为除了对SSRI(例如氟伏沙明、氟西汀、西酞普兰)、三环抗抑郁药(例如丙米嗪、地昔帕明)和选择性去甲肾上腺素摄取抑制剂(例如瑞波西汀)敏感以外，在不诱导镇静作用的剂量下对一系列次要的(例如安定)和主要的(例如氟哌啶醇)安定药敏感(Broekkamp et al.，1986Eur.J.Pharm.，126223-229)。模型可反映焦虑样行为或强迫行为(见De Boer et al.，2003Eur.J.Pharm.463145-161)。
本文应用的方法遵循Broekkamp et al.(1986)所述的方法。将小鼠(每个处理组n＝15)个别地置于透明塑料笼(33×21×18cm)中，所述笼的地板上有5cm锯屑并且笼中央有一组25块大理石(直径1cm)。将第二个翻过来的笼子作为盖子。在30分钟测试周期结束时计数被锯屑覆盖(至少覆盖三分之二)的大理石数。由不知晓药物处理方案的研究人员进行所述测试。
在测试前，通过在每个笼中将10只首次实验的小鼠放置15分钟，使所有的测试笼和大理石被“灌输(impregnated)”。
因此在大理石埋藏测试中研究鼠尾草提取物B(30、100、300mg/kg，测试前24、5和1小时口服)，以评价其在小鼠中可能的抗焦虑作用。使用氯巴占、氟西汀和文拉法辛作为参考化合物。
表5小鼠中鼠尾草提取物B、文拉法辛、氟西汀和氯巴占在大理石埋藏测试中的影响(每组15只小鼠)。数据显示为均值±标准误差并显示为相对于对照的％改变，其中NS＝不显著的，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001(学生t-检验)。

#第一次施用后(1/15)和第二次施用后死亡(1/15)。
测试的最高剂量的鼠尾草提取物B(300mg/kg)以与血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂文拉法辛相似的方式，清楚和显著地降低了大理石埋藏行为。
实施例6 小鼠中鼠尾草提取物B对光-暗盒测试中行为的影响 检测抗焦虑活性的方法遵循Crawley(1981，Pharmacol.Biochem.Behav.，15695-699)所述的方法。抗焦虑剂提高在光室中花费的时间。
将动物置于两室盒的光室中，所述两室盒一般是光亮和开放的(25×27×27cm)，另一半是黑暗和关闭的(20×27×27cm)。在3-分钟测试期间记录在每个室中花费的时间以及动物从一侧跨入另一侧的次数。每组研究15只小鼠。测试不知情地进行。
在三个剂量(30、100、300mg/kg，测试前24、5和1小时口服)下评价分散于玉米油中的鼠尾草提取物B，并与载体对照组(玉米油)比较。使用在测试前1小时施用的氯巴占(32mg/kg口服，分散于蒸馏水中0.2％w/v的羟丙基甲基纤维素中)作为参考物质。该组中的小鼠在测试前24小时和5小时接受额外的载体施用，从而维持实验为不知情的。
表6小鼠中鼠尾草提取物B(SAB)和氯巴占在光-暗盒测试中的影响(每组15只小鼠)。数据显示为均值±标准误差和相对于对照的％改变，其中NS＝不显著的，*p＜0.05，***p＜0.001(学生t-检验)。


#1在-1h口服施用后死亡(假施用)(1/15)。
#2镇静作用；300mg/kg的鼠尾草提取物B(1/14)和氯巴占(2/15)。
与载体对照相比，测试的最高剂量的鼠尾草提取物B(300mg/kg)清楚和显著地提高了在光室中花费的时间。因此，鼠尾草提取物B在300mg/kg下显示了抗焦虑药样活性。
实施例7 制备软明胶胶囊 制备包含以下成分的软明胶胶囊 可对成人每天施用两粒胶囊持续3个月，用于治疗温和的慢性抑郁症。
实施例8 制备软明胶胶囊 制备包含以下成分的软明胶胶囊 应当每天服用一粒胶囊持续14天，优选地在月经周期的下半部分服用，用于治疗月经前期综合征和月经前焦虑障碍。
实施例9 制备片剂 制备包含以下成分的片剂
对于一般健康、供能和减轻压力而言，每天两次服用一粒药片，持续3个月。
实施例10 制备即食的调味软饮 将所有成分混合并筛过500μm的筛网。将得到的粉末置于适宜的容器中，并在管状搅拌机中至少混合20分钟。为了制备饮品，向获得的125g混合的粉末中添加足量水，制备一升饮料。
即饮型软饮每份(250ml)含有约30mg三环二萜(衍生物)混合物。作为增强剂(strengthener)或对一般健康而言，每天应当引用2份(240ml)。
实施例11 制备强化的非烘焙的谷物棒 将三环二萜(衍生物)混合物与脱脂乳粉预混合，并置于行星式碗状搅拌机(planetary bowl mixer)中。添加玉米脆和脆麦酥，将整体柔和混合。然后添加干燥和切开的苹果。在第一烹调罐中，以上文给定的量混合糖、水和盐(溶液1)。在第二烹调罐中，以上文给定的量混合葡萄糖浆、转化糖浆和山梨醇糖浆(溶液2)。烘焙油脂、棕榈仁油脂、卵磷脂和乳化剂是油脂相。将溶液1加热至110℃。将溶液2加热至113℃，然后在冷水浴中冷却。之后将溶液1和溶液2合并。在水浴中于75℃下熔化油脂相，然后添加至溶液1和2的合并混合物中。向液体的糖-油脂混合物中添加苹果味香料和柠檬酸。将液体物料添加至干燥成分中，并在行星式碗状搅拌机中充分混合。将物料置于大理石板上并滚至期望的厚度，然后冷却至室温，并切件。未烘焙的谷物棒每份(30g)含有约25mg三环二萜(衍生物)混合物。对于一般健康和提供能量而言，每天应食用1-2只谷物棒。
权利要求
1.包含鼠尾草提取物的膳食或药物组合物，所述鼠尾草提取物包含鼠尾草酚、鼠尾草酸和鼠尾草12-甲基醚。
2.根据权利要求1的膳食或药物组合物，其还包含迷迭香酚和/或20-脱氧鼠尾草酚。
3.根据权利要求1或2的组合物，其选自由以下组成的组食物、饲料、乳制品、酸乳、强化食物、谷物棒、烘焙物、蛋糕、曲奇、膳食补剂、片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、胶囊、泡腾剂、无醇饮品、软饮、运动饮品、果汁、柠檬水、接近水的饮品、茶、基于乳的饮品、液体食物、汤和液体乳制品(什锦谷物饮品)。
3.根据权利要求1到3中任一项的组合物作为抗抑郁药、情绪/生活力改善剂、减压剂、状况改善剂、焦虑减轻剂、强迫行为减轻剂、弛缓剂、睡眠改善剂和/或失眠缓解剂的用途。
4.用作药物的权利要求1或2中定义的鼠尾草提取物。
5.用作药物的权利要求1或2中定义的鼠尾草提取物，所述药物用于治疗与降低的神经传递相关的病症。
6.权利要求6中定义的鼠尾草提取物，其用作抗抑郁药、情绪/生活力改善剂、减压剂、状况改善剂、焦虑减轻剂、强迫行为减轻剂、弛缓剂、睡眠改善剂和/或失眠缓解剂。
7.权利要求1或2中定义的鼠尾草提取物用于制造下述组合物的用途，所述组合物用于治疗与降低的神经传递相关的病症。
8.根据权利要求8的用途，其中所述组合物是抗抑郁药、情绪/生活力改善剂、减压剂、状况改善剂、焦虑减轻剂、强迫行为减轻剂、弛缓剂、睡眠改善剂和/或失眠缓解剂。
9.在动物中治疗与降低的神经传递相关的病症的方法，所述方法包括对需要其的动物施用有效剂量的权利要求1或2中定义的鼠尾草提取物，所述动物包括人。
10.根据权利要求10的方法，其中所述动物是人、宠物动物或农业动物。
全文摘要
本发明涉及含有式I到III的三环二萜(衍生物)的混合物的鼠尾草提取物，优选地涉及含有式I到IV的三环二萜(衍生物)的混合物的鼠尾草提取物，更优选地涉及含有式I到V的三环二萜(衍生物)的混合物的鼠尾草提取物，所述提取物用作为治疗与降低的神经传递相关的病症的药物，本发明还涉及膳食和药物组合物及其用途。
文档编号A23L1/30GK101541193SQ200780043631
公开日2009年9月23日 申请日期2007年11月22日 优先权日2006年11月24日
发明者安·福勒, 克劳斯·吉尔泊特, 戈德·斯库勒, 克利斯托弗·维瑞里, 艾德里安·维斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司