专利名称：利用微载体的产后来源的细胞的体外扩增的制作方法
相关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2006年11月13日提交的美国申请号60/865,558的权益，其全部内容通过引用合并在本文中。
领域
本发明一般地涉及哺乳动物细胞的生长和扩增。特别是，本发明涉及利用表面或颗粒，例如微载体颗粒、丸粒或珠子的、哺乳动物产后来源的细胞(PPDCs)的体外生长和扩增的方法。
背景
商业性细胞治疗产品优选的是在闭合的无菌系统中生产的。然而，用于商业性细胞治疗产品的许多细胞类型的生长是贴壁依赖的。
虽然搅拌罐反应器、摇动烧瓶、旋转烧瓶、抬升反应器等等，对于在悬浮液中生长的细胞都是有用的(例如，用于单克隆抗体生产的杂交瘤、用于重组DNA技术的多种细胞，以及大多数昆虫细胞培养物)，用于生长和扩增贴壁依赖细胞的选择是更为有限的。
包括在贴壁依赖细胞之内的有许多正常的二倍体细胞株，以及大多数原代细胞类型。用于这些细胞的大规模生产的选择包括滚瓶、纤维床、空心纤维系统、多平板的或堆叠的平板培养系统、细胞立方体(cell cube)和微载体，每一种都具有优点和缺点。
细胞培养的基于微载体的方法提供了许多优点，包括在许多应用中下游加工的容易。微载体一般形状是大略球形，可以是大孔或微孔的，或是实心的。利用用于细胞附着的微载体便于使用搅拌罐和相关的反应器用于贴壁依赖细胞的生长。细胞附着到容易悬浮的微粒上。对可悬浮性的要求限制了微载体本身的物理参数。因而，微载体通常具有50-2000微米范围内的平均直径。在某些应用中，实心型的微载体从约100到约250微米，而多孔型微载体珠子从约250到约2500微米。这些大小范围容许选择足够大以容纳许多贴壁依赖细胞，同时足够小以形成具有适用于搅拌反应器中的性质的悬浮液的微载体。
多孔和实心型的微粒载体都是可从供应商来商业上获得的。商业上可获得的微载体的实例包括Cytodex
和Cytodex
其都是来自GE Healthcare Life Sciences的基于葡聚糖的微载体。在售的多孔微载体包括也来自GE Healthcare Life Sciences的Cytoline以及Cytopore产品。Biosilon(NUNC)和Cultispher(Percell Biolytica)也是商业上可获得的。
虽然对于某些类型的细胞，在高度弯曲的表面上，例如微载体所提供的表面上生长的细胞的形态可能是一个问题，就大规模的生长而言，一般地微载体提供了许多优点，包括易于收获细胞，易于从细胞本身中分离有用的细胞外产物。本领域需要高效的和高产量的方法，来生长和收获贴壁依赖细胞，例如源于脐带或胎盘的产后细胞。
概述
本发明提供了用于哺乳动物细胞的生长和扩增的组合物和方法。提供了方法用于利用表面，例如微载体珠子或多孔的微载体珠子体外生长和扩增产后来源的哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞是贴壁依赖的、产后来源的哺乳动物细胞，例如，脐来源的细胞或胎盘来源的细胞。
提供了培养贴壁依赖产后细胞的方法，其包括提供至少一种贴壁依赖产后细胞，提供用于生长所述产后细胞的细胞生长培养基，提供至少一种载体颗粒，其用于所述贴壁依赖产后细胞的附着，以及在允许所述细胞的附着和生长的条件下、在存在所述生长培养基的情况下用所述载体颗粒接触所述贴壁依赖细胞，从而培养所述贴壁依赖产后细胞。
培养贴壁依赖产后细胞的方法提供了在至少一种载体颗粒，例如微载体上培养细胞。所述微载体可以由天然的或合成来源的材料组成。实例包括基于胶原蛋白的微载体、基于葡聚糖的微载体、或基于纤维素的微载体，以及玻璃、陶瓷、聚合物或金属。微载体可以是无蛋白质的或蛋白质包被的，例如，具有胶原蛋白。在进一步的方面，所述微载体可以由化合物组成，或包被有化合物，所述化合物增强细胞与所述微载体的结合以及增强细胞从所述微载体上的释放，包括但不限于，聚(单硬脂酰基甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明质酸钠、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、n-异丙基丙烯酰胺、玻连蛋白。实例进一步包括具有微电流的微载体，例如具有产生低水平的生物学相关的电流的锌和铜的颗粒电偶的微载体；或顺磁性的微载体，例如顺磁性的钙-藻酸盐微载体。在进一步的方面，本发明提供了与贴壁依赖产后细胞共培养的第二细胞类型。
培养贴壁依赖产后细胞的方法提供了培养细胞来引起在约二十天内至少约五次群体倍增。培养贴壁依赖产后细胞的方法提供了培养细胞来引起在约二十天内至少约七次半的群体倍增。
提供了组合物，其包含所述方法培养的贴壁依赖产后细胞，所述方法利用用于附着到细胞的载体颗粒，例如微载体颗粒或多孔的微载体颗粒。所述贴壁依赖产后细胞表型上与在静态培养物中生长的细胞相同，如对一种或更多种标记物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ所确定的。在进一步的方面中，所述贴壁依赖产后细胞表型是CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。提供了包含在载体颗粒上培养的贴壁依赖产后细胞的生物反应器。提供了利用载体颗粒上培养的贴壁依赖产后细胞的用于细胞治疗的组合物。
详细说明 概述
本发明提供了用于哺乳动物细胞的生长和扩增的组合物和方法。提供了方法，其用于利用表面，例如微载体珠子或多孔的微载体珠子体外生长和扩增产后来源的哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞是贴壁依赖的、产后来源的哺乳动物细胞，例如，脐来源的细胞或胎盘来源的细胞。
提供了培养贴壁依赖产后细胞的方法，其包括提供至少一种贴壁依赖产后细胞，提供用于生长所述产后细胞的细胞生长培养基，提供至少一种载体颗粒，其用于所述贴壁依赖产后细胞的附着，以及在允许所述细胞的附着和生长的条件下、在存在所述生长培养基的情况下用所述载体颗粒接触所述贴壁依赖细胞，从而培养所述贴壁依赖产后细胞。
培养贴壁依赖产后细胞的方法提供了在至少一种载体颗粒，例如微载体上培养细胞。所述微载体可以由天然的或合成来源的材料组成。实例包括基于胶原蛋白的微载体、基于葡聚糖的微载体、或基于纤维素的微载体，以及玻璃、陶瓷、聚合物(例如聚苯乙烯)或金属。微载体可以是无蛋白质的或蛋白质包被的，例如，具有胶原蛋白。在进一步的方面，所述微载体可以由化合物组成，或包被有化合物，所述化合物增强细胞与所述微载体的结合以及增强细胞从所述微载体上的释放，包括但不限于，聚(单硬脂酰基甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明质酸钠、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、n-异丙基丙烯酰胺、玻连蛋白和胶原蛋白。实例进一步包括具有微电流的微载体，例如具有产生低水平的生物学相关的电流的锌和铜的颗粒电偶的微载体；或顺磁性的微载体，例如顺磁性的钙-藻酸盐微载体。
提供了组合物，其包含所述方法培养的贴壁依赖产后细胞，所述方法利用载体颗粒，例如微载体颗粒、多孔的微载体颗粒、具有微电流的微载体、或顺磁性微载体，用于附着到细胞。所述贴壁依赖产后细胞表型上与在静态T-烧瓶中生长的细胞相同，如对一种或更多种标记物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ所确定的。在进一步的方面中，所述贴壁依赖产后细胞表型是CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。在一个实施方式中，所述贴壁依赖产后细胞表型是CD13+、CD90+、CD34-和CD117-。在进一步的实施方式中，所述贴壁依赖产后细胞表型是CD10+、CD13+、CD44+、CD73+、CD90+PDGFr-α+、PD-L2+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+和CD31-、CD34-CD45-、CD80-、CD86-、CD117-、CD141-、CD178-、B7-H2、HLA-G-、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
要理解的是，本发明不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然地可以变化。还需要理解的是，在此使用的专有名词仅是用于描述本发明的特定实施方式的目的，不意味着限制本发明。如在本说明书和附随的权利要求中使用的，单数形式“一”和“该(the)”包括了复数的指示物，除非该内容明确地另外指明。因而，举例来说，提及“一种细胞”包括两种或更多种细胞的组合，等等。
在此使用的术语“约”当涉及可测值如数量、持续时间等等时，意思是包括离指定值±20％或±10％、更优选的±5％、再更优选的±1％、更加优选的±0.1％的变动，当这种变动适合于进行所公开的方法时。
除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的任何方法和材料可以被用于实践来测试本发明，在此描述了优选的材料和方法。在描述和主张本发明时，将使用以下术语。
在此处描述的方法中培养的细胞被称为“产后来源的细胞(PPDCs)”或“产后细胞”。本发明的细胞的亚组被称为“胎盘来源的细胞(PDCs)”或“人类脐组织来源的细胞(hUTCs)”。此外，细胞可以被描述为干细胞或祖细胞，后一术语广义地使用。术语“来源”被用于表明细胞已经从它们的生物学来源获得并被体外地生长或进行其他操作(例如，在生长培养基中培养来扩增群体和/或产生细胞系)。以下详细描述了本发明的产后来源的细胞的体外操作和产后来源的细胞的独特特征。
各种术语被用于描述培养中的细胞。“细胞培养物”一般涉及从活有机体取得并在受控的条件生长的细胞(“培养中”)。“原代细胞培养物”是在第一次传代培养之前直接取自有机体的细胞、组织或器官的培养物。当细胞置于生长培养基中处在便于细胞生长和/或分裂的环境中时，细胞被在培养中“扩增”，产生细胞的更大的群体。当细胞在培养中扩增时，细胞增殖的速率有时由细胞在数目上倍增所需的时间量来度量。这被称为“倍增时间”。
“细胞系”是由原代细胞培养物的一次或更多次移种形成的细胞群体。每一轮传代培养被称为传代。当细胞被传代培养时，它们被称为已经被“传代”。特定的细胞或细胞系的群体有时称为或表征为它被传代的次数的数字。例如，传代十次的培养的细胞群体可以称为“P10”培养物。原代培养物，即，在从组织分离细胞之后的第一培养物被称为P0。在第一次传代培养之后，细胞被称为第二培养物(P1或传代1)。在第二次传代培养之后，细胞称为第三培养物(P2或传代2)，如此等等。本领域技术人员将理解的是，在传代期间可能有多次群体倍增；因而，培养物的群体倍增的数目大于传代数。在传代之间时期的细胞扩增(即，群体倍增的数目)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、底物、培养基和传代之间的时间。
“条件培养基”是一种培养基，其中培养了特定的细胞或细胞群体，然后被去除。当细胞被培养在培养基中时，它们分泌可为其他细胞提供营养支持的细胞因子。这些营养因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质(ECM)、蛋白质、泡囊、抗体和微粒。含有细胞因子的培养基是条件培养基。
一般地，“营养因子”被定义为促进细胞的存活、生长、增殖、成熟、分化和/或维持，或刺激细胞的提高的活性的物质。在此使用的“营养支持”是指促进细胞的存活、生长、增殖、成熟、分化和/或维持，或刺激细胞的提高的活性的能力。
当涉及培养的脊椎动物细胞时，术语衰老(以及“复制型衰老”或“细胞衰老”)是指可归因于有限的细胞培养的性质；即，它们不能生长超过有限数量的群体倍增(有时称为“Hayflick’s限制”)。虽然利用成纤维细胞样细胞首次描述了细胞衰老，可以在培养中成功地生长的大多数正常人细胞类型经历细胞衰老。不同细胞类型的体外寿命是可变的，但是最大寿命一般少于100次群体倍增(这是所有细胞在培养中变得衰老因而使得培养物不能分裂的倍增次数)。衰老不取决于时序时间(chronological time)，而是由培养物已经经历的细胞分裂或群体倍增的次数来度量。因而，当重新引入生长因子时，通过除去必需的生长因子而变得休眠的细胞仍然能够恢复生长和分裂，此后进行与连续生长的相同细胞相同次数的倍增。类似地，当细胞在各种次数的群体倍增之后在液氮中冷冻然后解冻并培养时，它们经历与培养中维持不冷冻的细胞基本上相同的倍增次数。衰老的细胞不是死亡的或垂死的细胞；它们实际上对细胞分裂和程序性细胞死亡(细胞凋亡)有抗性，并可以无限地维持在它们的非分裂状态。这些细胞是非常有活力和代谢活性的，但是它们不分裂。还没有发现衰老的细胞的非分裂状态通过任何生物学、化学或病毒试剂而是可逆的。
“生长培养基”是指足够用于产后来源的细胞的扩增的培养基。生长培养基优选地含有Dulbecco’s修饰的必需培养基(DMEM)。更优选的，生长培养基含有葡萄糖。生长培养基优选地含有DMEM-低葡萄糖(DMEM-LG)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。生长培养基优选地含有约15％(v/v)血清(例如，胎牛血清，规定的牛血清)。生长培养基优选地含有至少一种抗生剂和/或抗真菌剂(例如，青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素、制霉菌素；优选的，50单位/毫升青霉素G钠和50微克/毫升链霉素硫酸盐)。生长培养基优选地含有2-巯基乙醇(Sigma，St.Louis MO)。最优选的，生长培养基含有DMEM-低葡萄糖、血清、2-巯基乙醇和抗生剂。
“标准生长条件”是指包含约5％CO2的标准大气条件、约35-39℃的温度，更优选的37℃，以及约100％的相对湿度。
“分离的”是指已经从其天然环境中移出的细胞、细胞成分或分子。
“贴壁依赖细胞”是一些细胞，包括哺乳动物细胞，其需要附着在表面上，例如组织培养烧瓶表面或微载体颗粒表面，来在组织培养中复制。
“微载体”是指对于在培养中贴壁依赖细胞的附着和生长有用的颗粒、珠子或丸粒。微载体具有以下性质(a)它们足够小以容许它们在悬浮培养物中使用(以不引起对微载体或细胞的显著剪切破坏的搅拌速度)；(b)它们是实心的，或具有表面上由多孔包被的实核心；和(c)它们的表面(对于多孔载体来说外表面和内表面)可以是带正电或负电的。在一个方面，所述微载体具有约150到350μm之间的总体粒径，具有约0.8到2.0meq/g之间的正电荷密度。有用的微载体包括，非限制性地，Cytodex
Cytodex
或Cytodex
(GE Healthcare Life Sciences)。
在另一个方面，所述微载体是实心载体。实心载体特别适合于粘附细胞，例如贴壁依赖细胞。所述载体颗粒也可以是多孔的微载体。实例进一步包括具有微电流的微载体，例如具有产生低水平的生物学相关的电流的锌和铜的颗粒电偶的微载体；或顺磁性的微载体，例如顺磁性的钙-藻酸盐微载体。
“多孔的微载体”是指对于培养中贴壁依赖细胞的附着和生长有用的颗粒。多孔的微载体具有以下性质(a)它们足够小以容许它们在悬浮培养物中使用(以不引起对微载体或细胞的显著剪切破坏的搅拌速度)；(b)它们具有足够大小的孔和内部空间以容许细胞迁移到所述颗粒的内部空间中，以及(c)它们的表面(外表面和内表面)可以是带正电或负电的。在一系列的实施方式中，载体(a)具有约150到350μm之间的总体粒径；(b)具有为约15到约40μm之间的平均孔开口直径的孔；以及(c)具有约0.8到2.0meq/g之间的正电荷密度。在某些实施方式中，所述正电荷由DEAE(N，N，-二乙氨基乙基)基团提供。有用的多孔微载体包括，非限制性地，
1和
2(GE Healthcare Life Sciences，PiscatawayN.J.)。
本发明首次展现了用于来自产后组织包括脐和胎盘的细胞的分离和培养的方法，其可以在微载体颗粒或多孔的微载体颗粒上体外扩增到大的数量。贴壁依赖产后细胞能够分化成中胚层、外胚层或内胚层的谱系。
本发明的贴壁依赖产后细胞具有分化成任何一种或更多种组织类型的能力，所述组织类型包括但不限于，中胚层组织，例如成熟的脂肪组织、骨骼、软骨、心脏的各种组织(例如，心包膜、心外膜、心肌外膜、心肌、心包膜、瓣组织)、真皮结缔组织、hemangial组织(例如，小体(corpuscles)、心内膜、血管上皮)、造血(hematopeotic)组织、肌肉组织(包括骨骼肌、心肌、平滑肌)、泌尿生殖组织(例如，肾脏、前肾、后和中肾管、后肾憩室、输尿管、肾盂、集合小管)、雌性生殖结构的上皮(特别是输卵管、子宫和阴道)、中胚层腺组织(例如，肾上腺皮质组织)和基质组织(例如，骨髓)。当然，由于所述产后细胞可以保持发育成为成熟细胞的潜力，也可认识到它通过分化成合适的前体细胞(例如，前脂肪细胞、前肌细胞、前骨细胞)的发育表型潜能。
来自它们的产后细胞可以用于身体的任何组织的组织修复、再生或增加。此外，本发明的细胞可以用于营养支持。
从产后组织分离细胞
分离和收集PPDCs的方法在共同待决的美国申请号10/877,012和10/877,446中描述，通过将它们全文引用来合并在此。为了收集产后的脐和胎盘用于载体颗粒上细胞的分离和培养，在分娩后立即获取胎盘和脐。举例来说，而不是为了限制，在除去羊膜之后，胎盘或脐带(排干血液)或其切片，可以在含有盐溶液或培养基，例如Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)的无菌容器例如烧瓶、烧杯或培养皿中从出生位置转运到实验室。在组织的收集之前和期间，脐带优选地在无菌条件下维持和操作，另外可以通过用例如70％(体积比)的乙醇的水溶液对脐带作简短的表面处理，随后用无菌的蒸馏水或等渗的盐溶液清洗来表面灭菌。在约3℃到约50℃，脐带可以短暂地保存约1到24小时。在细胞的提取之前，优选地将组织保存在4℃到10℃，而不是冷冻。抗生素或抗真菌物质可以包括在培养基中来降低微生物污染。通过本领域已知的任何合适的方法在无菌条件下从脐带和胎盘收集细胞。这些实例包括用酶例如分散酶、胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶来消化，或解剖或切碎。长出细胞的分离的细胞或组织碎片可以用于起始细胞培养。
产后的组织可以使用抗凝血剂溶液例如肝素来清洗。组织可以在用于移植的器官的转移所使用的溶液中转运，例如成斯康星大学溶液或全氟化合物溶液。
产后细胞的培养
分离的细胞被转移到无包被的或用细胞外基质或配体如层粘连蛋白、胶原蛋白、明胶包被的无菌组织培养器皿。为了生长，添加细胞培养基，例如DMEM(高或低葡萄糖)、McCoys 5A培养基、Eagle’s基础培养基、CMRL培养基、Glasgow最小必需培养基、Ham’sF-12培养基(F12)、Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基、Liebovitz L-15培养基、MCDB和RPMI 1640，等等。培养基可以补充有一种或更多种成分，包括，例如，胎牛血清(FBS)、马血清(ES)、人血清(HS)、生长因子，例如PDGF、FGF、促红细胞生成素以及一种或更多种抗生素和/或抗真菌剂来控制微生物污染，例如，青霉素G、链霉素硫酸盐、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独地或组合地，等等。
处于一定密度以容许细胞生长的培养容器中的细胞被置于孵化器中，具有空气中0到5％(体积比)的CO2，空气中2到25％的O2，25到40℃。培养容器中的培养基可以是静态的或摇动的，例如，使用生物反应器。细胞可以是低氧化应激下培养(例如，添加谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰基半胱氨酸)。如在此使用的“低氧化应激”是指对培养的细胞没有或具有最小的自由基损害的条件。细胞也可以在改变的条件下生长，例如，一段时期的正常氧之后是一段时期的缺氧。
最合适的培养基、培养基制备和细胞培养技术的选择方法是本领域公知的，在各种来源中描述了，包括Doyle等，(eds.)，1995，Cell&Tissue CultureLaboratory Procedures，John Wiley&Sons，Chichester；and Ho and Wang(eds.)，1991，Animal CellBioreactors，Butterworth-Heinemann，Boston，通过全文引用将它们合并在此。
在培养分离的细胞或组织碎片足够的时间之后，例如，约10到约12天，外植的组织中存在的产后细胞将倾向于从组织中长出，作为从中迁移或细胞分裂的结果，或两者共同的结果。产后细胞然后移动到含有与最初使用的相同或不同类型的新鲜培养基的独立培养容器中，在其中细胞群体可以有丝分裂地扩增。
做为选择，产后组织中存在的不同的细胞类型被分级成亚群，从中可以分离产后细胞。这可以使用用于细胞分离的标准技术实现，包括但不限于，酶处理来将产后组织离解成它的组成细胞，之后利用形态学和/或生物化学的标记物来克隆和选择特定的细胞类型，选择性破坏不需要的细胞(负选择)，根据混合的群体中与例如大豆凝集素的不同细胞可凝集性来分离，冻融操作，混合的群体中细胞的不同粘附性质，过滤，常规的和区带离心，离心淘洗(逆流离心)，单位重力分离，逆流分布，电泳，以及荧光活化的细胞分选(FACS)。对于克隆选择和细胞分离技术的综述，参见Freshney，R.I.，Culture ofAnimal Cells；A Manual of Basic Techniques，4th Ed.，Wiley-Liss，Inc.，New York，2000，通过全文引用将其合并在此。
培养基根据需要来改变，通过例如使用移液管小心地从平皿吸出培养基，并补充新鲜的培养基。如上所述继续孵育，直到平皿中足够数量或密度的细胞积累，例如，大约百分之70汇合。可以使用标准技术或使用细胞刮刀除去原始的外植的组织切片，其余的细胞被胰蛋白酶消化。在胰蛋白酶消化之后，收集细胞，移到新鲜培养基中并如上所述的孵育。培养基可以在胰蛋白酶之后24小时至少改变一次以除去任何漂浮的细胞。保留在培养物中的细胞是产后细胞。
产后细胞可以利用流式细胞术、免疫组织化学、基因阵列、PCR、蛋白质阵列或本领域已知的其他方法来表征。
产后细胞可以经历至少10次群体倍增。本领域技术人员将能够确定细胞何时经历群体倍增(Freshney，R.I.Culture of AnimalCellsA Manual of Basic Techniques 4th Ed.，Wiley-Liss，New York，2000)。
虽然产后细胞可以是分离的，优选的它处在细胞的群体内。本发明提供了产后细胞的被定义的群体。在一个实施方式中，所述群体是异质的。在另一个实施方式中，所述群体是同质的。
在又一个实施方式中，产后细胞的群体可以支持细胞用于培养其他细胞。例如，可被PPDC群体支持的细胞可以包括其他类型的干细胞，例如，神经干细胞(NSC)、造血干细胞(HPC，特别是CD34+干细胞)、胚胎干细胞(ESC)和其混合物。在其他实施方式中，所述群体是基本上同质的，基本上由PPDCs组成。
对于一种或更多种标记物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ，在微载体颗粒或多孔的微颗粒上培养的贴壁依赖产后细胞已经被表型地表征为与静态培养物中生长的细胞相同。在进一步的方面中，所述贴壁依赖产后细胞已经被表征为具有包括CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-的表型。在一个实施方式中，所述贴壁依赖产后细胞表型是CD13+、CD90+、CD34-和CD117-。在进一步的实施方式中，所述贴壁依赖产后细胞表型是CD10+、CD13+、CD44+、CD73+、CD90+PDGFr-α+、PD-L2+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+和CD31-、CD34-CD45-、CD80-、CD86-、CD117-、CD141-、CD178-、B7-H2、HLA-G-、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
产后细胞可以用于在化合物或肽的天然库或合成库中筛选引起分化或信号转导途径的分子，包括激酶，例如Jak、MAP、Jun、p38Akt、PKC、调钙蛋白、酪氨酸激酶、SMAD、ERK、JNK、MEK、ErbB、FAK和PI3。
产后细胞可以通过利用基因芯片分析或抗体阵列来进一步表征。
用于细胞培养的微载体
微载体培养是一种技术，其使得贴壁依赖细胞，例如，贴壁依赖产后细胞的实际的高产量培养成为可能。微载体已经被专门地开发用于细胞的培养，例如哺乳动物产后细胞，在从几毫升到高过一千升的培养体积中。微载体是生物学惰性的，提供了搅拌的微载体培养物的强的但是非刚性基底。微载体可以是透明的，容许附着的细胞的显微镜检查。Cytodex
(GE Healthcare Life Sciences，PiscatawayN.J.)由化学地偶联到交联的葡聚糖的基质的变性胶原蛋白的薄层组成。Cytodex
上的变性的胶原蛋白层对于多种蛋白酶的消化是敏感的，包括胰蛋白酶和胶原酶，提供了从微载体移除细胞同时保持最大的细胞生存力、功能和完整性的能力。
无蛋白的微载体可以用于培养产后细胞。例如，在生产和实验室或研究用途中使用的、以商品名称
(SoloHillEngineering，Inc.，Ann Arbor，MI)销售的微载体珠子是修饰的聚苯乙烯珠子，具有附着于表面的阳离子三甲基铵来为所述微载体提供带正电的表面。珠子直径从直径约90到约200微米。
细胞培养的基于微载体的方法提供了许多优点，包括在许多应用中下游加工的容易。微载体一般形状是大略球形，可以是多孔的或实心的。利用微载体用于细胞附着便于使用搅拌罐和相关的反应器用于贴壁依赖细胞的生长。细胞附着到容易悬浮的微粒上。对可悬浮性的要求限制了微载体的物理参数。因而，微载体通常具有50-2000微米范围内的平均直径。在某些应用中，实心型的微载体从约100到约250微米，而多孔型微载体珠子从约250到约2500微米。这些大小范围容许选择足够大以容纳许多贴壁依赖细胞，同时足够小以形成具有适用于搅拌反应器中的性质的悬浮液的微载体。
在利用微载体珠子等等中考虑的因素有附着效力、免疫原性、生物相容性、生物降解的能力、达到汇合的时间、附着的细胞的生长参数，包括每单位表面积的最大可得密度，需要的解离技术、解离的效力、培养条件的可测量性以及在扩大条件下培养物的匀质性、成功地扩大解离过程的能力，和珠子是否将用于植入。这些考虑可以受到微载体珠子的表面性质、以及微载体的多孔性、直径、密度和操作性质的影响。
例如，微载体颗粒或珠子的密度是一种考虑。过度的密度可能引起微载体颗粒或珠子沉淀出悬浮液，或倾向于完全地接近培养容器的底部，因而可能引起反应器中细胞、培养基和气相的不良的散料混合。另一方面，过低的密度可能导致微载体的过度的漂浮。1.02到1.15g/cm3的密度是许多微载体珠子的典型。
微载体颗粒的小的直径以及可以添加到反应器的颗粒的体积，容许所述微载体贡献相当大的表面积，大大地超过在滚瓶中或生长贴壁依赖细胞的其他方法，例如在平板上所得到的。多孔的微载体提供了每单位体积或重量甚至更大的表面积。这些多孔的微载体具有大的腔，其对于贴壁依赖细胞的生长是可用的。这些腔大大地提高了表面积，可以保护细胞免于有害的机械效应，例如剪切应力，例如，来自混合或来自气体喷射的。最大化滚瓶中产后细胞的生长的方法在2005年12月19日申请的美国申请系列号60/751,550中描述了，通过全文引用将其合并在此。
微载体表面可以有网纹来增强细胞附着和增殖。微载体表面网纹可以通过一些技术，包括但不限于，建模、浇铸、leeching和蚀刻来实现。有网纹的表面的特征的分辨率可以在纳米级别。有网纹的表面可以用来诱导微载体表面上的特定细胞排列。多孔微载体内的孔的表面也可以有网纹来增强细胞附着和增殖。孔表面网纹可以通过一些技术，例如但不限于，建模、浇铸、leeching和蚀刻来实现。
微载体表面可以被血浆包被来为微载体表面赋予特定电荷。这些电荷可以增强细胞附着和增殖。
在其他实施方式中，微载体由热反应性聚合物，例如聚-N-异丙基丙烯酰胺组成，或包被有所述物质，或具有电机械性质。
微载体可以具有微电流，例如，具有产生低水平的生物学相关电流的锌和铜的颗粒电偶的微载体。微载体可以是顺磁性的，例如顺磁性的钙-藻酸盐微载体。
多孔和实心型的微粒载体都是可从供应商来商业上获得的。商业上可获得的实心微载体的实例包括Cytodex
和Cytodex
其都是来自GE Healthcare Life Sciences的基于葡聚糖的微载体。在售的多孔微载体包括也来自GE Healthcare Life Sciences的Cytoline以及Cytopore产品。Biosilon(NUNC)和Cultispher(Percell Biolytica)也是商业上可获得的。
载体颗粒还可以含有生物学活性试剂。载体颗粒还可以含有可调节细胞的生长或功能或者组织环境的生物学活性试剂，这些因子可以包括但不限于成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、骨骼形态发生蛋白、转化生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子。可以使用完整的因子、其模拟物或活性片段。
微载体可以用第二细胞类型接种并与贴壁依赖产后细胞共培养。在一个实施方式中，该两种(或更多种)细胞类型可以以相等或不等的比例附着到单独的微载体上。该两种或更多种细胞类型可以同时接种到微载体上，或它们可以在不同的时间接种。微载体可以这样处理，来优先地将特定的细胞类型粘附到微载体的特定区域上。在进一步的实施方式中，具有附着的单个或多个细胞类型的微载体可以在培养容器中与悬浮培养的第二细胞类型共同培养。
第二细胞类型可以包括，例如，上皮细胞(例如，口腔粘膜、胃肠道、鼻上皮、呼吸道上皮、阴道上皮、角膜上皮的细胞)、骨髓细胞、脂肪细胞、干细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、真皮成纤维细胞、角质形成细胞、血管内皮细胞(例如，主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞、髂动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、脐动脉内皮细胞、脐静脉内皮细胞以及内皮的祖代细胞(例如，CD34+、CD34+/CD117+细胞))、成肌细胞、肌细胞、肝细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、基质细胞，和其他软组织细胞或祖细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛细胞、神经细胞，其包括但不限于神经元、星形细胞、施万(Schwann)细胞、肠神经胶质细胞、少突胶质细胞。
还包括的是软骨组织、半月板组织、韧带组织、腱组织、椎间盘组织、牙周组织、皮组织、血管组织、肌肉组织、筋膜组织、骨膜组织、眼组织、嗅觉组织、围心组织、肺组织、滑液组织、神经组织、肾脏组织、骨髓、泌尿生殖组织、肠组织、肝脏组织、胰腺组织、脾脏组织或脂肪组织的细胞。
根据当前的公开内容，其他的实施方式和用途对于本领域技术人员是显而易见的。
示范性的实施方式 实施例1 叶轮旋转烧瓶生物反应器中微载体上的脐组织来源的产后细胞的生长和收获
这项工作的目标是建立一些方法来在叶轮旋转烧瓶生物反应器中的微载体上接种、扩增和收获人类脐组织来源的细胞(hUTCs)。微载体上生长的细胞应当展现与利用静态T-烧瓶方法培养的细胞相似的生长动力学和细胞表型。作为确定用这些方法培养的细胞是否保持了它们典型的表型的初步步骤，进行了通过流式细胞术的细胞表面标志物的分析，与T-烧瓶中培养的(hUTCs)所表达的细胞表面标志物相比较。这项工作的另一个目标是降低所述方法中胰蛋白酶-EDTA(动物来源的产品)的使用，因而降低传播病原体的风险。
材料和方法
细胞。来自CBAT lot#050604B传代8细胞的细胞被解冻，在T225烧瓶中扩增一次传代。
微载体。Cytodex
(GE Healthcare Life Sciences，cat.no，17-0485)微载体珠子在PBS中水化至少3小时并高压灭菌。
旋转烧瓶。具有内部悬吊承载叶轮组(Internal OverheadBearing Impeller Assembly)的旋转烧瓶，100ml和250ml(Bellco，Inc.)。
汇合。汇合被定义为在代表性的显微镜检查视野中观察到的大约90％的微载体的超过大约60％的表面积被细胞覆盖。
传代。传代被定义为用获自独立的旋转烧瓶培养物的汇合微载体的整分试样接种含有新鲜微载体的旋转烧瓶。
接种和培养。通过胰蛋白酶从T225烧瓶收获细胞，4.0E+06细胞整分试样添加到含有40mL培养基的100ml叶轮或玻璃棒旋转烧瓶中330mg微载体珠子上。在孵育之前烧瓶用5％CO2气体冲洗1分钟。接种物转速频率是每30分钟里30rpm 2分钟，持续8小时。在八小时时，培养基体积增加到100ml，旋转速度设置为45rpm持续旋转，在37℃孵育。
传代。传代1-(100ml到250ml烧瓶)培养细胞八天。收集来自100ml烧瓶的所有微载体，容许通过重力从培养基中分离。吸出培养基，微载体重新悬浮在10ml新鲜培养基中。在吸移以确保均匀分布之后，移出具有微载体的5ml培养基，放入250ml旋转烧瓶中。大约660mg的新鲜水化并高压灭菌的Cytodex
微载体和培养基也添加到烧瓶中。培养基体积增加到200ml，在孵育之前烧瓶用5％CO2气体冲洗1分钟。旋转速度设置为45rpm持续旋转，在37℃孵育。其余的细胞通过胰蛋白酶消化来收获，利用Guava PCA仪器(Guava Technologies，Hayward，CA)计数。
传代2-(250ml到250ml烧瓶)培养细胞六天。收集来自250ml烧瓶的所有微载体，容许通过重力从培养基中分离。吸出培养基，微载体重新悬浮在25ml新鲜培养基中。在吸移以确保均匀分布之后，移出具有微载体的5ml培养基，放入250ml旋转烧瓶中。大约660mg的新鲜水化并高压灭菌的Cytodex
微载体和培养基也添加到烧瓶中。培养基体积增加到200ml，在孵育之前烧瓶用5％CO2气体冲洗1分钟。旋转速度设置为45rpm持续旋转，在37℃孵育。其余的细胞通过胰蛋白酶消化来收获，利用Guava PCA仪器计数。
培养基交换。从培养中取下旋转烧瓶，容许微载体靠重力沉淀到烧瓶的底部。通过抽吸除去大约一半的培养基体积，替换为等体积的新鲜培养基。烧瓶用5％CO2气体冲洗1分钟，并放回培养。在第1天、第4天进行培养基交换。
生存力染色。从烧瓶中取出1ml整分试样，容许微载体靠重力沉淀。通过抽吸来除去培养基，替换为1ml活/死(Live/Dead)染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分钟。在孵育之后，20微升整分试样添加到玻璃显微镜载玻片，通过荧光显微镜检查来观察。活的细胞染色为绿色，死的细胞染色为红色。人工地分析显微镜视野来评估附着于微载体的活的和死的细胞的分布和比例。评估至少三个显微镜视野，统计活细胞的近似的百分比。
细胞收获。从旋转烧瓶收集微载体，在PBS中洗涤三次，在两个50ml锥形管间平均分配。每个试管在37℃与25ml胰蛋白酶孵育10分钟。试管用PBS达到50ml体积，容许微载体靠重力沉淀。含有细胞的上清液通过抽吸来收集，并转移到预先填充2.5ml FBS的50ml锥形管中(产生5％FBS溶液来灭活胰蛋白酶)。重复这个过程四次，单独地收集每个级分。所有收获的细胞被离心，重新悬浮在含有血清的生长培养基中，通过使用Guava PCA仪器来计数。
静态T-烧瓶培养。从T225烧瓶收获的细胞的整分试样被用于接种两个T225烧瓶，利用美国专利申请No.10/877012中声明的方法孵育四天。收获细胞并通过流式细胞术分析。
流式细胞术。利用Becton-Dickinson FACSCalibur仪器(Becton Dickinson，San Jose，CA)通过流式细胞术分析收获的细胞来测定细胞表面标志物分布。所有抗体购自BD PharMingen(SanDiego，CA)。
结果
细胞收获。表1显示了在旋转烧瓶培养中Cytodex
微载体上从传代九到传代十一扩增的脐细胞系050604B的每次传代的收获物级分、细胞产量和生存力。
表1
细胞动力学。表2显示了在旋转烧瓶培养中Cytodex
微载体上从传代九到传代十一扩增的脐细胞系050604B的生长动力学。表格显示了总体倍增是7.48，每次倍增的平均小时是69.53(+/-17.52)小时。
表2
活/死染色。活/死染色的微载体整分试样的分析显示了大部分微载体表面覆盖有绿色染色(活的)细胞，具有红色染色的核(死的)的少量的点。细胞展现了与静态条件中培养的细胞的形态学类似的形态学。
流式细胞术分析。表3显示了旋转烧瓶中的微载体珠子收获的人脐组织来源的细胞(hUTCs)、对比从静态的T烧瓶中的培养物收获的hUTCs所表达的细胞表面标志物的结果(“+阳性”或“-阴性”)。表格显示了通过两种方法产生的细胞所表达的标志物是一致的。
表3在静态的T烧瓶中、或在旋转烧瓶系统中Cytodex
微载体上扩增的Umb 050604B细胞的细胞表面蛋白表达的比较，通过流式细胞术来分析。
结论
人类脐组织来源的细胞(hUTCs)在叶轮旋转烧瓶生物反应器中的Cytodex
微载体上培养。细胞在二十天内实现了7.48次群体倍增，具有69小时的平均群体倍增时间。每个传代的细胞生存力从94.4％到99.7％。对微载体上培养的hUTCs上十三种细胞表面标志物的表达的分析，与细胞培养T烧瓶中培养的hUTCs的细胞表面标志物表达一致。这项工作提供了初步证据，表明微载体可以用于在生物反应器系统中接种、扩增和收获hUTCs。
实施例2 在旋转烧瓶中在MGSA、HA和PLGA微载体上扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTCs)的生长
与无菌地封闭的系统一起使用的微载体可以潜在地生产商业数量的扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTC)。无菌地封闭的系统降低了扩增和维持商业的细胞产品所需的人员操作，因而降低了操作者误差、污染和监测。与细胞培养烧瓶相比，微载体提供了实质上更大的表面积用于细胞附着，从而产生更高的细胞产量。
研究了hUTCs附着到由合成的可再吸收生物材料制成的微载体的能力，包括在旋转烧瓶培养中维持生存力的能力，以及在重新接种到静态培养中时增殖的能力。扩增的hUTCs接种到微载体上，所述微载体由聚-(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、透明质酸钠(HA)和聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)(MGSA)材料。商业上生产的Cytodex
微载体也在这个实例中用作对照。具有细胞的材料在旋转烧瓶中培养五天，通过胰蛋白酶消化收获，重新接种到静态培养物中。重新接种的细胞在静态培养中在四天内扩增，表现了它们的增殖能力的存留。这个实施例展现了合成的生物材料用作微载体用于旋转烧瓶培养的能力。
材料和方法 表4.微载体
PLGA微球体的制备。PLGA微球体通过超临界流体加工(SCF)来制备。SCF单元被高压灭菌或用70％乙醇擦拭，置于层流罩超静台下。在无菌条件下，一克PLGA注入SCF单元的室中。闭合SCF单元，移动到普通的通风橱中。将单元连接到具有0.2微米滤器的入口管上。压力和温度分别是300巴和35℃。叶片的转速是250rpm。反应进行15分钟。在完成加工之后，SCF单元与CO2的入口和出口的管道断开，移入层流罩超静台中，打开室。产生的材料转移到具有液氮的磨床并研磨。
MGSA微球体的制备。MGSA微球体通过超临界流体加工来制备。SCF单元被高压灭菌或用70％乙醇擦拭，置于层流罩超静台下。在无菌条件下，2克MGSA注入SCF单元的室中。闭合SCF单元，移动到普通的通风橱中。将单元与具有0.2微米滤器的入口管连接。压力和温度分别是150巴和35℃。叶片的转速是250rpm。反应进行20分钟。在完成加工之后，SCF单元与CO2的入口和出口的管道断开，移入层流罩超静台中，打开室。
透明质酸钠加工。称出五克透明质酸钠(Novamatrix，Pharm 80)，干粉置于Mixer转矩流变仪(Caleva，U.K.)的原尺寸(full size)碗中。在转矩流变仪中以50rpm混合10秒之后，一毫升的乙醇/水(50/50v/v)溶液人工地添加(利用注射器)到粉末混合物中。在添加流体之后，以相同的速率继续进行另外的10秒混合，添加另一毫升的乙醇/水溶液。继续这种模式直到添加了5毫升的溶液。湿物质置于卧式螺旋挤压机附件中，含有在单个环形图案上等间隔的2.0mm直径孔洞的压模置于挤压机附件的末端。螺旋速度是50rpm，手持的压实器用于将湿的造粒压入螺旋中。制剂被挤压成很快地干燥的不连续的链。挤出的链用直缘刀片人工地切割成长度2mm的丸粒。
微载体制备。大约1克的每种PLGA微载体悬浮在25mlDulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一小时。通过抽吸除去PBS，在接种之前，材料重新悬浮在25ml生长培养基中至少30分钟。
大约1g的每种MGSA微载体悬浮在25ml 70％乙醇中30分钟来润湿材料。通过抽吸除去乙醇，用PBS清洗MGSA三次，在接种之前重新悬浮在25ml的生长培养基中至少30分钟。
透明质酸钠(260mg)在25ml 70％乙醇中灭菌2小时。通过抽吸除去乙醇，然后用PBS清洗三次，接种之前重悬浮在25ml的生长培养基中至少30分钟。
在接种之前一天，775mg的Cytodex
微载体珠子在40ml PBS中水化至少3小时并高压灭菌。接种的当天，通过抽吸除去PBS，在接种之前Cytodex
重新悬浮在生长培养基中至少30分钟。
表5.使用的微载体数量。
接种和培养。在实施例1中使用的材料、细胞类型、生长培养基、旋转烧瓶、接种和培养条件、培养基交换、生存力染色和细胞收获方法在这个实施例中使用。
细胞收获。由于在MGSA旋转盘(＜75μm)、MGSA SCF、PLGA 50/50)和HA样品中大量的生物材料碎屑，以及阻塞仪器的可能性，收获的细胞没有利用Guava PCA来计数。所有具有碎屑的收获的细胞被重新接种到T225烧瓶中。从重新接种的收获量回算微载体收获量。
结果
微载体产量计算。根据39小时的群体倍增时间或四天时间内2.46次倍增来计算微载体产量(静态条件中hUTC生长动力学的历史数据)。使用方程式倍增＝(Log10(收获物)-Log10(接种的))/Log10(2)。
表5a.最终的细胞产量
收获的细胞重新接种。从所有材料(除了Cytodex
)收获的细胞以大约5,000细胞每平方厘米重新接种到T225组织培养烧瓶中。从所有材料收获的细胞在重新接种后增殖。
扩增的hUTCs接种到PLGA、HA和MGSA材料上，在旋转烧瓶中培养五天，通过胰蛋白酶消化收获，并重新接种到静态培养物中。从合成的微载体收获的细胞是超过90％存活的。重新接种的细胞在静态培养中在四天内扩增，表现了它们的增殖能力的存留。这个实施例展现了合成的生物材料用作微载体用于旋转烧瓶培养的能力。
实施例3 在旋转烧瓶中在胶原蛋白包被的MGSA和PLGA微载体上扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTCs)的生长
研究了hUTCs附着到由具有胶原蛋白包被的合成可重吸收生物材料制成的材料的能力，包括在旋转烧瓶培养中维持生存力的能力，以及在重新接种到静态培养中后增殖的能力。扩增的hUTCs接种到胶原蛋白包被的或未包被的聚-(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)(MGSA)微载体。具有细胞的微载体在旋转烧瓶中培养五天，通过胰蛋白酶消化收获，重新接种到静态培养物中。
材料和方法 表6.微载体
微载体制备。微载体润湿-大约1g的每种MGSA和PLGA微载体无菌地悬浮在25ml 70％乙醇中30分钟来润湿微载体。通过抽吸除去乙醇，然后用PBS清洗微载体三次，重新悬浮在25ml的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
胶原蛋白包被。湿润的微载体(PBS)通过离心来丸粒化，通过抽吸除去PBS，微载体重新悬浮在2.9％胶原蛋白溶液(Vitrogen 1000，Cohesion，Inc.Palo Alto，CA)中。微载体在胶原蛋白中孵育30分钟。残余的胶原蛋白通过抽吸来除去，用PBS洗涤胶原蛋白包被的微粒三次。
表7.使用的微载体数量。
接种和培养。在实施例1中使用的材料、细胞类型、生长培养基、旋转烧瓶、接种和培养条件、培养基交换、生存力染色和细胞收获方法在这个实施例中使用。
结果 表7a.细胞收获。
收获的细胞重新接种。从包被的和未包被的MGSA和PLGA微载体收获的细胞以大约5,000细胞每平方厘米重新接种到T225中。重新接种后四天，从两种材料收获的细胞增殖到超过50％汇合。
扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTCs)接种到胶原蛋白包被的PLGA和MGSA微载体上，在旋转烧瓶中培养五天，通过胰蛋白酶消化收获，并重新接种到静态培养物中。从合成的微载体收获的细胞是超过90％存活的。重新接种的细胞在静态培养中在四天内扩增，表现了它们的增殖能力的存留。这个实施例展现了合成的生物材料用作微载体用于旋转烧瓶培养的能力。
实施例4 在旋转烧瓶中在明胶包被的MGSA微载体上扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTCs)的生长
研究了hUTCs附着到由具有明胶包被的合成可重吸收生物材料制成的微载体的能力，包括在旋转烧瓶培养中维持生存力的能力，以及在重新接种到静态培养中时增殖的能力。扩增的hUTCs接种到明胶包被的或未包被的聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)(MGSA)材料上。商业上生产的Cytodex
微载体也在这个实例中用作对照。具有细胞的微载体在旋转烧瓶中培养五天，通过胰蛋白酶消化收获，重新接种到静态培养物中。
材料和方法 表8.微载体
微载体制备。对于Cytodex
微载体制备参见实施例1。对于MGSA微载体润湿和制备参见实施例2。
明胶包被。PBS中未包被的MGSA被离心，通过抽吸除去PBS，重新悬浮在25ml的2％明胶溶液中。微载体在明胶中孵育30分钟。通过抽吸除去残余的明胶溶液，明胶包被的微载体用PBS洗涤三次，重新悬浮在25ml PBS中。
在接种之前一天，775mg的Cytodex
微载体珠子在40ml PBS中水化至少3小时并高压灭菌。接种的当天，通过抽吸除去PBS，在接种之前Cytodex
重新悬浮在生长培养基中至少30分钟。
表9a.使用的微载体数量。
接种和培养。在实施例1中使用的微载体、细胞类型、生长培养基、旋转烧瓶、接种和培养条件、培养基交换、生存力染色和细胞收获方法在这个实施例中使用，除了以下例外。接种物转速/频率是每30分钟里30rpm 2分钟，持续8小时。在八小时时，培养基体积增加到对于MGSA的100ml和对于Cytodex
的250ml，旋转速度设置为45rpm持续旋转，在37℃孵育。
培养基交换。在培养三天后，从搅动平板上除下烧瓶，容许微载体沉淀。通过抽吸除去大约一半(50ml和125ml)的培养基体积，替换为等体积的新鲜的生长培养基。
这个方法被用于MGSA材料，除了以下例外；使用50ml锥形管和10ml胰蛋白酶。
所有收获的细胞被离心，重新悬浮在生长培养基中，通过使用Guava PCA仪器来计数。
结果 表9b.细胞收获。
收获的细胞重新接种。从明胶包被的和未包被的MGSA材料收获的细胞以大约5,000细胞每平方厘米重新接种到T225烧瓶中。重新接种收获的细胞后四天，细胞增殖到超过50％汇合。
扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTCs)接种到具有明胶蛋白质包被的MGSA材料上，在旋转烧瓶中培养五天，通过胰蛋白酶消化收获，并重新接种到静态培养物中。从合成的微载体收获的细胞是超过80％存活的。重新接种的细胞在静态培养中在四天内扩增，表现了它们的增殖能力的存留。这个实施例展现了明胶包被的合成生物材料用作微载体用于旋转烧瓶培养的能力。
实施例5 基于SoloHill微载体的hUTC培养用于细胞生产和回收的可行性
扩增的hUTCs的生长在SoloHill，Inc.SoloHillEngineering，Inc.(Ann Arbor，MI)生产的微载体上评估。微载体珠子由SoloHill在它们的目录中销售，在此被称为胶原蛋白包被的(目录no.C104-1521)、
II(目录no.H112-170)和pronectin-包被的(ProNectin F，目录no.PF104-1521)。
对于在含血清的培养基中的hUTC生产，评估了胶原蛋白包被的、pronectin包被的和未包被的
II微载体的(1)细胞附着、(2)铺展、(3)生长、(4)细胞解离的效率和(5)从微载体的细胞分离。培养条件与实验1到5中在接种微载体培养物之前在明胶包被的T-225烧瓶中生长hUTCs所使用的几乎相同。人工的完整细胞和细胞释放核的计数被用于计算hUTC生长指数在培养开始时的细胞数量(接种密度(Ni))、在指定时点的细胞收获(Nh)、以小时表示的培养时间(t)、群体倍增水平(PDL)、每24小时的群体倍增(r)和每次群体倍增的小时数(PDT)。
在这些研究中，对
II和胶原蛋白包被的微载体的均匀的细胞附着分别在1小时和4小时内发生。Pronectin包被的微载体由于不令人满意的附着结果从这个实施例中淘汰。类似于在明胶包被的T-225组织培养烧瓶中生长的hUTC，在细胞附着到
II和胶原蛋白包被的微载体之后不久发生铺展。基于Nh和PDT值的生长测量被用于比较组织培养物和微载体培养物；T-225组织培养烧瓶中的生长的细胞被用于接种实验1到5的微载体培养物。对于T-烧瓶中生长的细胞，Nh值处在3.5×104/cm2到6.9×104/cm2的范围内，PDT值在26-36的范围内。利用对微载体培养可行性研究几乎相同的细胞培养条件，Nh/PDT范围基本上相同于T-烧瓶中生长的细胞。两个非正常值看起来与92hr±4时点相关，可能表明，细胞处在稳定-死亡期。从
II和胶原蛋白包被的微载体和T-烧瓶除去细胞产生了健壮的、单细胞悬浮液。这些初步的结果是有前途的，是hUTC的微载体培养规模扩大所需的。从
II和胶原蛋白包被的微载体分离细胞产生了72％到146％的回收率。
材料和方法
试剂所有研究 组织培养烧瓶-T-225Corning，lot#13005020 2％猪的明胶-Sigma Corp. 培养基-DMED低葡萄糖，15％FBS，1ppm BME，1％青霉素/链霉素 hUTC系Umb 120304 P6 Bellco旋转烧瓶-SoloHill Engineering，Inc.的100到250工作体积的定做(custom)叶轮，Bellco直叶片叶轮。
表10.SoloHill Engineering的微载体
用于研究的旋转烧瓶体积。如研究1到5中表明的，比例是225cm2/50mls和675cm2/150mls。
缩写。
Ni＝培养开始时的细胞数量(接种密度) Nh＝在指定时点的细胞收获物 t＝以小时表示的培养时间 PDL＝群体倍增水平 r＝每24小时的群体倍增 PDT＝每次群体倍增的小时数 微载体初步胰蛋白酶消化方法
烧瓶从孵化器转移到生物学安全罩，容许
或胶原蛋白包被的微载体靠重力沉淀。从沉淀的微载体除去培养基。通过以珠子群堆的2×-4×体积的比率向容器添加DPBS彻底地清洗加载了细胞的微载体，小心不泼洒微载体和逐出细胞。含有装载细胞的微载体的烧瓶然后在40-55rpm、室温下洗涤15分钟。除去DPBS，重复洗涤步骤。在除去DPBS的第二次清洗之后，以微载体群堆的1×-2×体积的比率添加胰蛋白酶(0.05％)。含有装载细胞的微载体的烧瓶然后在40rpm-55rpm、室温下搅动15分钟。利用显微镜观察在50-100ml吸移管中从微载体上除去细胞。在吸移管中轻轻地上下移动微载体来完全地逐出细胞。容许微载体靠重力沉淀，含有细胞的上清液通过吸移管收集。
采样微载体培养物的工艺开发步骤；采集样品用于测试和修改胰蛋白酶消化方案。
培养容器从孵化器转移到生物学安全罩，将容器置于设定在60rpm的搅动平板上。培养物在搅动模式时，用15mL吸移管获得10ml整分试样，吸移管从容器的一个侧臂延伸到培养物的中心点，并且没有叶轮组。整分试样转移到15ml锥形管。(注意对于细胞/ml，珠子群堆是从培养物移除的10ml的部分。)。容许微载体靠重力沉淀，通过吸移管除去培养基。装载细胞的微载体用5ml的DPBS清洗两次。在除去DPBS的第二次清洗之后，以微载体群堆的1×-2×体积的比率添加胰蛋白酶(0.05％)，容许沉淀10分钟。重复地轻轻地吸移和分配微载体，产生单细胞悬浮液。容许微载体靠重力沉淀，含有细胞的上清液通过吸移管收集，对细胞进行计数。
核释放方法。用50-60rpm的叶轮旋转采集的1-10ml同质的微载体培养物样品，转移到试管，然后200g离心5分钟，之后弃去上清液。(注意
II不需要离心)。团化的微载体悬浮在含有0.1％w/v结晶紫的1ml 0.1M柠檬酸(溶于水中用于低渗效果)中。试管的内含物用振动混合器混合(1分钟)，然后在37℃孵育1小时。试管的内含物的蒸发通过利用湿润的孵化器或通过用塑料膜密闭试管来避免。在孵育之后，试管的内含物用振动混合器再次混合，之后用血球计计数释放的染色的核。样品中的微载体不会影响计数。样品可以在4℃保存最长至一周。当培养物是均匀地悬浮时，以及当培养条件避免了微载体和细胞的聚集时，测定培养物中细胞的数目的这种方法是最精确的。
研究1实验设计。这个实验的目的是确定在三种类型的SoloHill微载体(
II(H)、胶原蛋白包被的(c)和Pronectin-包被的(P))之中对细胞附着和细胞的均匀分布的基本培养要求。建立了每组有两个旋转烧瓶的三个微载体组。每个组中的一个烧瓶用恒定的搅动来起始，每个组中的第二个烧瓶用间歇的搅动周期(i)来起始。在培养72小时之后，每个培养烧瓶的内含物准备用于细胞核释放计数。
变量 1)微载体。每个组中
II(H)、胶原蛋白包被的(C)或Pronectin包被的(PF)。
2)每个组内的搅动条件 50-60rpm的恒定搅动；或在改变成恒定搅动之前50-60rpm搅动3分钟并且停止30分钟的间歇搅动，长达24小时。
3)叶轮。定做叶轮用于
II微载体培养物，Bellco叶轮用于两个其他的微载体组。
表11.每225cm2微载体的度量
开始时的恒定培养条件 每50ml培养基225cm2总表面积 3.0×106细胞/225cm2 pH 7.4 37℃/5％CO2 CBAT系列hUTC系120304传代8 结果
观察结果在恒定搅动和间歇的搅动/停止周期下，
II培养物显示了均匀的细胞分布和单一的微载体细胞汇合。在恒定搅动下，胶原蛋白包被的微载体培养物显示了均匀的细胞分布和单一的微载体细胞汇合。胶原蛋白包被的微载体间歇周期培养物在前24小时形成了微载体聚集，围绕聚集物生长的细胞显著地地降低了细胞计数。在两个组中，利用这些培养条件，Pronectin包被的微载体培养物是不令人满意的。
表12.微载体上细胞附着的结果
表13.74小时后核计数的结果。在培养中(i＝间歇的)
作为这项研究的结果，将使用恒定搅动起始胶原蛋白包被的和
II微载体培养。间歇的搅动周期不是在含血清培养基中hUTC附着和铺展所需的。
研究2实验设计。为了确定接种密度对hUTC生长指数的影响，开始了每组具有3个烧瓶的两个微载体组。组内的3个烧瓶的每一个含有不同的接种密度。在培养中第3和4天的一个时点，细胞释放核计数被用作定量分析。
表14.每个组的hUTC接种密度
表15.每675cm2的微载体的度量
开始时的恒定培养条件 CBAT系列hUTC系120304传代9 在55-60rpm恒定搅动 每150ml Hayflick培养基675cm2(3×225cm2)表面积 37℃/5％CO2 pH 7.4 培养的时间 用于培养物接种的细胞悬液库 在培养中88小时后细胞释放核计数和细胞生长指数的结果 表16a.计数#1
表16b.计数#2
研究3 实验设计。这项研究的目的是三个1)测定在最长达96小时的培养中hUTCs在
II和胶原蛋白包被的微载体上的生长速度。在指定的时点，制备实施例中的烧瓶的内含物用于细胞核释放(CNR)计数。2)测定胰蛋白酶消化过程在利用74微米筛目从微载体除下单细胞以及从微载体的细胞分离的效率。完整的细胞计数被用于测量结果。3)比较完整细胞计数和细胞释放核计数的结果。制备了八个烧瓶每组四个(H和C)。在指定的时点，每个组中的三个烧瓶通过CNR分析。每个组中的一个烧瓶胰蛋白酶消化，过滤细胞悬液。
表17.变量
用于接种烧瓶的细胞悬液库 悬浮在具有酚红的Hayflick培养基中的细胞 悬浮在没有酚红的Hayflick培养基中的细胞
用于起始的恒定的培养条件 CBAT系列hUTC系120304传代10 在55-60RPM恒定搅动 每50ml完全Hayflick培养基225cm2表面积 37℃/5％CO2 pH 7.4 时点d2、d3和d4(以起始后的小时数表示) 表18.以细胞释放核计数表示的生长曲线的结果
注意不充足的细胞接种到一个
II烧瓶中。在HILLEX
II组中，第一个时点(47小时)未被分析。
表19.以完整细胞计数表示的、培养中73小时时T-225cm2细胞对照的胰蛋白酶消化的结果
研究4实验设计。测定在胰蛋白酶消化加工之后hUTC回收以及从
II和胶原蛋白包被的微载体的完整细胞分离的效率。制备了四个烧瓶每组两个烧瓶(H和C)。胰蛋白酶消化的每个组的一个烧瓶通过完整细胞计数来分析；每个组中的第二个烧瓶通过细胞核释放计数来分析。
表20.变量
用于接种烧瓶的细胞悬液库 悬浮在具有酚红的Hayflick培养基中的细胞 悬浮在没有酚红的Hayflick培养基中的细胞
培养的时间
II培养96小时，胶原蛋白72小时。
用于起始的恒定的培养条件 CBAT系列hUTC系120304传代8 每675cm2 9.0×106个细胞 在55-60rpm恒定搅动 每150mls Hayflick培养基675cm2 37℃/5％CO2 pH 7.4 表21.对于胶原蛋白在72小时的完整细胞计数和细胞释放核计数(NRC)的结果
表22.从
II在96小时的完整细胞计数和细胞释放核计数(NRC)的结果
注意在96小时，根据高的NRC计数所指示的，
IICBAT培养物是高度汇合的。然而，在胰蛋白酶消化之后，如低的完整细胞计数所表明的，存在的大量粘性材料表明大量死亡的细胞群体。避开粘性材料的细胞是具有82％生存力的单细胞。
研究5 实验设计。将评估CBAT胰蛋白酶消化和从胶原蛋白和
II微载体的完整细胞分离的效率。制备八个培养烧瓶每组四个相同的烧瓶(H和C)。来自两个组的每一个的一只烧瓶胰蛋白酶消化，细胞过滤通过74微米筛孔滤器；每个组的第二个烧瓶通过细胞释放核计数来分析。比较完整细胞计数和CRN计数的一致性。评估了两个时点。以更低的接种密度(6.66×103/cm2)接种培养物。
表23.变量
用于起始的恒定的培养条件 CBAT系列hUTC系120304传代9 用于接种的细胞悬液库 在55-60rpm恒定搅动 每50ml具有酚红的Hayflick培养基225cm2 37℃/5％CO2 pH 7.4 培养的时间69和92小时 每225cm2150×104个细胞。
表24.在69小时时来自胶原蛋白的完整细胞计数和细胞释放核计数(NRC)的结果
表25.在69小时时来自
II的完整细胞计数和细胞释放核计数(NRC)的结果
注意来自
II培养物的25ml过滤后的细胞悬液转移到T-225烧瓶中。这个培养物代表了所有来自69小时的
II培养物的细胞。次日，细胞被胰蛋白酶消化和计数。假定的是，活细胞将在复制之前附着和铺展，因而，在24小时拯救的细胞将与从
II培养物平板接种的细胞相等。
表26.用来自
II培养物的hUTC接种的T-225培养物在24小时的结果 表27.在92小时的完整细胞计数和细胞释放核计数A(NRC)的结果
在这些研究中，对
II和胶原蛋白包被的微载体的均匀的细胞附着分别在1小时和4小时内发生。Pronectin由于不令人满意的附着结果从这个实施例中淘汰。类似于在明胶包被的T-225组织培养烧瓶中生长的hUTC，在细胞附着到
II和胶原蛋白包被的微载体之后不久发生铺展。基于Nh和PDT值的生长测量被用于比较组织培养和微载体培养；T-225组织培养烧瓶中的细胞生长被用于接种微载体培养实验1到5。对于T-烧瓶中生长的细胞，Nh值处在3.5×104/cm2到6.9×104/cm2的范围内，PDT值在26-36的范围内。利用与微载体培养可行性研究几乎相同的细胞培养条件，Nh/PDT范围相同于T-烧瓶中生长的细胞。两个非正常值看起来与92hr±4时点相关，表明可能细胞处在稳定-死亡期。从
II，胶原蛋白包被的微载体和T-烧瓶除去细胞产生了健壮的、单细胞悬浮液。这些结果是有前途的，是hUTCs的微载体培养规模扩大所需的。从HILLEX
II和胶原蛋白包被的微载体分离细胞产生了72％到146％的回收率。
实施例6 在Wave生物反应器系统中在Cytodex
微载体上扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTCs)的生长
与无菌地封闭的系统一起使用的微载体可以潜在地生产商业数量的扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTCs)。无菌地封闭的系统降低了扩增和维持商业的细胞产品所需的人员操作，因而降低了操作者误差、污染和监测。与细胞培养烧瓶相比，微载体提供了实质上更大的表面积用于细胞附着，从而产生更高的细胞产量。
当前的工作提供了用于在无菌地闭合的Wave Biotech，Inc.生物反应器系统(Wave Biotech LLC，Somerset，NJ)中在微载体上hUTCs的扩增的初始方法。使用以下的方法，hUTCs首先接种到250ml旋转烧瓶系统中Cytodex
微载体上，培养五天。具有附着的细胞的微载体然后转移到含有另外的培养基和没有细胞的微载体的Wave系统中，培养七天。细胞从250ml旋转烧瓶到1L Wave系统中的转移或传代不利用胰蛋白酶来实现。这消除了来自细胞扩增过程的动物来源的产物。hUTCs在Wave系统中在12天中实现了3.02次群体倍增。在收获时，细胞在采样的所有微载体上均匀分布。
材料和方法
细胞。hUTC系120304传代9
培养基。Dulbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖、15％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)、β巯基乙醇(BME) 250ml旋转烧瓶培养
微载体。Cytodex
(GE Healthcare Life Sciences，cat.no，17-0485)微载体珠子在PBS中水化至少3小时并高压灭菌。
旋转烧瓶。具有内部悬吊承载叶轮组(Internal OverheadBearing Impeller Assembly)的旋转烧瓶，250ml(Bellco，Inc.)。
接种和培养。大约70％汇合的细胞通过胰蛋白酶从T225烧瓶收获，9.0×106细胞整分试样添加到含有80mL培养基的250ml叶轮旋转烧瓶中660mg微载体珠子上。在孵育之前烧瓶用5％CO2气体冲洗1分钟。接种物转速频率是每30分钟里30rpm 2分钟，持续8小时。在八小时时，培养基体积增加到250ml，旋转速度设置为45rpm持续旋转，在37℃孵育。
Wave生物反应器
微载体转移和设备加载。具有附着的细胞的微载体从250ml旋转烧瓶中收获，重新悬浮在50ml培养基中。这个溶液添加到含有1L培养基和2.4g水化和高压灭菌的无细胞Cytodex
微载体的2L Wave生物反应器袋(cat.no.CELLBAG2L/S-NU)中。Wave袋加载到Wave Biotech 2/10EH系统上。向Wave袋中利用5％CO2空气通过厂家的规格来膨胀。系统的加热板设置到37℃。
接种阶段。2/10EH系统设置在2°角，6rpm的摇摆速度大约16小时(过夜)。
扩增阶段。2/10EH系统设置在5°角，10rpm的摇摆速度七天。
生存力染色。1ml整分试样的培养基和微载体转移到15ml锥形管，容许微载体靠重力分离。通过抽吸来除去培养基，替换为1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分钟。在孵育之后，20微升整分试样的细胞悬液添加到玻璃显微镜载玻片，通过荧光显微镜检查来观察。活的细胞染色为绿色，死的细胞染色为红色。人工地分析显微镜视野来评估附着于微载体的活细胞的分布。评估至少三个显微镜视野，统计活细胞的近似的百分比。
细胞收获。从wave袋收集微载体到四个250ml锥形管中，在PBS中洗涤三次，合并到一个250ml锥形管中。微载体在37℃与25ml胰蛋白酶搅动孵育10分钟。试管用PBS达到200ml体积，容许微载体靠重力沉淀。含有细胞的上清液通过抽吸来收集，并转移到预先填充10ml FBS的250ml锥形管中(产生5％FBS溶液来灭活胰蛋白酶)。用所有合并的级分重复这个过程两次。所有收获的细胞被离心，重新悬浮在含有血清的生长培养基中，通过使用Guava PCA仪器来计数。
表28.结果
细胞从250ml旋转烧瓶到Wave系统中的转移不利用胰蛋白酶来实现。这消除了来自细胞扩增过程的动物来源的产物。hUTC在Wave系统中在12天中实现了3.02次群体倍增。在收获时，细胞在采样的所有微载体上均匀分布。这个方法表现了扩增的人类脐组织来源的细胞从Wave Biotech生物反应器系统中培养的微载体上接种、扩增和收获的能力。
实施例7 在三升生物反应器系统中在Cytodex
微载体上扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTC)的生长
与无菌地封闭的系统一起使用的微载体可以潜在地生产商业数量的扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTC)。无菌地封闭的系统降低了扩增和维持商业的细胞产品所需的人员操作，因而降低了操作者误差、污染和监测。与细胞培养烧瓶相比，微载体提供了实质上更大的表面积用于细胞附着，从而产生更高的细胞产量。
当前的工作提供了在具有叶轮搅动的、无菌地闭合的三升生物反应器系统中在微载体上hUTCs的扩增的初步方法。在这个系统中hUTCs实现了2.88次群体倍增。生物反应器中随着时间的过去的葡萄糖消耗和乳酸盐生成是代谢活性的细胞的表现。在收获时，存在的细胞表现为在采样的微载体上均匀分布。在重新接种到静态培养条件下从生物反应器收获的细胞扩增到汇合，表现了细胞增殖能力的存留。这个方法表现了扩增的人类脐组织来源的细胞从具有叶轮搅动的、无菌地闭合的三升生物反应器系统中培养的微载体上接种、扩增和收获的能力。
使用这些的方法，hUTCs首先接种到250ml旋转烧瓶系统中Cytodex
微载体上，培养五天。具有附着的细胞的微载体然后转移到含有1L培养基和另外的没有细胞的微载体的生物反应器系统中，培养七天。在第七天，另外的2L培养基和另外的无细胞微载体添加到生物反应器系统中，培养十天。
材料和方法 细胞。hUTC系Umb 120304，传代9
培养基。Dulbecco′s改良的Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖、15％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)、β巯基乙醇(BME) 250ml旋转烧瓶
微载体。Cytodex
(GE Healthcare Life Sciences，cat.no，17-0485)微载体珠子在PBS中水化至少3小时并高压灭菌。
旋转烧瓶。具有内部悬吊承载叶轮组的旋转烧瓶，250ml(Bellco，Inc.)。
接种和培养。大约70％汇合的细胞通过胰蛋白酶从T225烧瓶收获，9.0E+06细胞整分试样添加到含有80mL培养基的250ml叶轮旋转烧瓶中660mg微载体珠子上。在孵育之前烧瓶用5％CO2气体冲洗1分钟。接种物转速频率是每30分钟里30rpm 2分钟，持续8小时。在八小时时，培养基体积增加到250ml，旋转速度设置为45rpm持续旋转，在37℃孵育。
生物反应器
设备。使用了具有叶轮搅动的三升闭合的生物反应器系统。系统参数(pH值、氧张力、温度、叶轮rpm)用BioStat B-DCU(B.Braun International)控制。
生物反应器前收获。具有附着的细胞的微载体从250ml旋转烧瓶中收获，重新悬浮在30ml培养基中。移出5ml整分试样的悬浮液(含有大约100mg或1/6的总微载体)。来自这个整分试样的细胞利用以下列出的方法收获。
微载体转移-250ml到1L。从250ml旋转烧瓶中收获的具有附着的细胞的剩余500mg微载体，重新悬浮在50ml培养基中。这个溶液添加到含有1L培养基和2.6g水化和高压灭菌的无细胞Cytodex
微载体的2L Wave生物反应器袋(cat.no.CELLBAG2L/S-NU)中。Wave袋然后在进入口上无菌地熔接到生物反应器，内含物通过重力导液来转移。然后启动叶轮，维持在45rpm。
微载体转移-1L到3L。上文列出的波浪袋方法利用含有2L培养基和6克空的微载体的wave袋来使用。
采样。1ml整分试样的培养基和微载体转移到15ml锥形管，容许微载体靠重力分离。吸出培养基，替换为1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分钟。在孵育之后，20微升整分试样的细胞悬液添加到玻璃显微镜载玻片，通过荧光显微镜检查来观察。活的细胞染色为绿色，死的细胞染色为红色。人工地分析显微镜视野来评估附着于微载体的活细胞的分布。评估至少三个显微镜视野，统计活细胞的近似的百分比。
葡萄糖分析。培养基的样品从培养物获得，分析葡萄糖和乳酸盐含量。
收获。5L Labtainer BioProcess容器(Hyclone，cat.no.SH30640.01)无菌熔接到附着于生物反应器的出口上。容器置于生物反应器下方，内含物靠重力导液来转移。容器的内含物然后无菌地转移到(3)750cm2滚瓶(Corning LifeSciences，Corning，NY)中。附着细胞的微载体用PBS洗涤，合并到单个滚瓶中。微载体在37℃与100ml胰蛋白酶搅动孵育10分钟。试管用PBS达到1L体积，容许微载体靠重力沉淀。含有细胞的上清液通过抽吸来收集，并转移到各自预先填充10ml FBS的四个250ml锥形管中(产生5％FBS溶液来灭活胰蛋白酶)。所有收获的细胞被离心，重新悬浮在含有血清的生长培养基中，通过使用Guava PCA仪器来计数细胞。
结果
培养基添加。在第15天，由于低的葡萄糖读数，500ml的培养基添加给系统。
3L生物反应器细胞动力学。从250ml旋转烧瓶的总微载体体积的1/5的细胞收获物计算接种的细胞数量。
表29.250ml前-3L生物反应器
观察和RPM调整。在第三天在生物反应器容器的底部注意到(总体积1L)微载体沉淀。叶轮速度增加到60rpm。在第10天(在总体积调整到3L后三天)，再次注意到微载体沉淀。叶轮速度再次提高到85rpm。在收获物的那天(第17天)，在生物反应器容器的底部再次注意到微载体沉淀。
收获的细胞重新接种。从生物反应器收获的细胞以5,000细胞每平方厘米重新接种到T75烧瓶中，扩增到汇合，表明了它们的增殖潜力的存留。
细胞从250ml旋转烧瓶到生物反应器系统中的转移、以及在第七天从1L到3L的规模扩大不利用胰蛋白酶来实现。这消除了来自细胞扩增过程的动物来源的产物。在这个系统中hUTC实现了2.88次群体倍增。生物反应器中随着时间的葡萄糖消耗和乳酸盐生成是代谢活性的细胞的表现。在收获时，存在的细胞表现为在采样的微载体上均匀分布。在重新接种到静态培养条件下从生物反应器收获的细胞扩增到汇合，表现了细胞增殖能力的存留。这个方法表现了扩增的人类脐组织来源的细胞从具有叶轮搅动的、无菌地闭合的三升生物反应器系统中培养的微载体上接种、扩增和收获的能力。
实施例8 在降低的胎牛血清生长培养基中hUTC的扩增
这项研究的目标是比较在含有15％胎牛血清(FBS)的标准生长培养基中、或含有7.5％FBS的降低的血清生长培养基中，连续培养扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTC)的生长动力学和细胞表面标志物。在降低的血清培养基中hUTC细胞治疗产品的生产将通过降低动物来源的产品的使用来提高产品安全性。降低的血清培养基的使用还降低了生产成本，并降低了在气体喷射生物反应器中的起泡沫可能性。
在标准生长培养基中和降低的血清培养基中，hUTC微量培养板形式的增殖分析产生的数据表明，hUTC在降低的血清培养基中活跃地增殖。作为这些增殖数据的结果，评估了组织培养烧瓶条件下多次传代过程的hUTC的生长动力学和表面蛋白质表达表型。低温保存的hUTC分离物120304被解冻，用于立即接种含有标准或降低的血清培养基的T75烧瓶，连续培养多次传代。从每个培养基收获的细胞的细胞表面蛋白表达通过流式细胞术来分析。另外，低温保存的hUTC分离物120304被解冻，用于立即接种含有Hillex II微载体、含有标准或降低的血清培养基的旋转烧瓶，连续培养多次传代。
低温保存的hUTC分离物120304被解冻，在具有降低的血清生长培养基的双份T75烧瓶中扩增十一次传代。每个复本T75烧瓶的每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长。每次群体倍增的小时数的所有数据点通过单向ANOVA的统计分析，与标准生长培养基对照相比，对于所有数据点没有显示hUTC生长动力学方面的显著差异(p＝0.821)。在降低的血清培养基中扩增的hUTC的细胞表面蛋白表达与在标准生长培养基中扩增的hUTCs一致。
另外，低温保存的hUTC分离物120304被解冻，在含有Hillex II微载体的旋转烧瓶中、用降低的血清生长培养基扩增三次传代。每个旋转烧瓶的每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长。每次群体倍增的平均小时数的双样品t-测验的统计分析显示了，在两种测试的培养基之间的hUTC生长动力学没有显著差异。(p＝0.424)。
这些数据表明，hUTC利用降低的血清培养基在静态T烧瓶中或微载体培养系统中以稳定的、一致的方式扩增多次传代、同时保持表型的细胞表面蛋白表达的能力。这项研究的目标是比较在含有15％胎牛血清(FBS)的标准生长培养基中、和含有7.5％FBS的降低的血清生长培养基中，连续培养扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTC)的生长动力学和细胞表面标志物。在降低的血清培养基中hUTC细胞治疗产品的生产将通过降低动物来源的产品的使用来提高产品安全性。另外，通过降低材料的消耗和降低喷气生物反应器中培养期间起泡沫的可能性，利用降低的血清培养基将提高生产效率。
在微量培养板形式分析中hUTC的增殖表明了在降低的血清的条件下连续培养的潜力。这个分析起初包括以96孔形式在标准的基础生长培养基中、以及在可选择的降低的血清的基础培养基中从15％到0％的FBS连续稀释。在培养96小时之后，发现的是，对于两种基础培养基，hUTC增殖在含有15％、7.5％和3.75％FBS的培养基中是最好的。结果，以24孔形式建立了第二次微量培养板分析，对于两种基础培养基类型仅使用三种主要的FBS浓度。根据24孔形式中观察到的增殖，对于具有15％FBS的标准生长培养基和具有7.5％FBS的可选择的基础生长培养基，开始了hUTC生长动力学的比较。
低温保存的hUTC分离物120304被解冻，用于立即接种含有标准或降低的血清培养基的T75烧瓶，连续培养多次传代。从每个培养基收获的细胞的细胞表面蛋白表达通过流式细胞术来分析。另外，低温保存的hUTC分离物120304被解冻，用于立即接种含有HillexII微载体、含有标准或降低的血清培养基的旋转烧瓶，连续培养多次传代。
材料和方法
细胞。低温保存的扩增的人类脐带组织细胞(hUTC)分离物12034群体倍增(PD)12。
生长培养基(Hayflick)。Dulbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco；Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone；Logan，UT)，青霉素/链霉素(P/S)(Gibco；Grand Island，NY)，β巯基乙醇(BME)(Sigma；St.Louis，MO)。
降低的血清培养基(Adv.DMEM/F12)。改进的DMEM/F12(Gibco；Grand Island，NY)，7.5％胎牛血清(FBS)，青霉素/链霉素(P/S)，4.0mM GlutaMAX(Gibco；Grand Island，NY)
多孔微量培养板。包被有明胶(Sigma；St.Louis，MO)的组织培养96孔和24孔微量培养板(Corning，Inc.；Corning，NY)
组织培养烧瓶。包被有明胶的T75烧瓶(Corning Inc.；Corning，NY)。
微载体。Hillex II微载体(Solo Hill；Ann Arbor，MI)在DI水中水化至少30分钟并高压灭菌。Hillex II微载体以12g/L的浓度使用。
旋转烧瓶。100ml和500ml单一用途、一次性的旋转烧瓶(Corning，Inc.；Corning，NY)用作培养容器。
在96孔微量培养板中的接种和培养。低温保存的hUTC小瓶被解冻，洗涤并重悬浮在生长培养基中。利用Hayflick和Adv.DMEM/F12制备生长培养基，其补充有15％、7.5％、3.75％、1.88％、0.94％或0％FBS。5.00×103hUTC每孔添加到每种条件的两个孔中。每个孔含有250μl生长培养基。平板在5％CO2、37℃组织培养孵化器中培养96小时。
来自96孔微量培养板的细胞的收获和计数。含有细胞的96孔微量培养板从孵育中取出，通过无菌的抽吸除去培养基。细胞用100μl PBS每孔来洗涤；通过无菌抽吸除去PBS，添加75μl TrypLESelect(Gibco；Grand Island，NY)。细胞在37℃孵育5分钟，之后，轻轻地敲打平板来移去细胞。向每个孔添加75μl的合适的培养基。向每个孔添加50μl的计数试剂。计数试剂是合适的生长培养基+2％Guava ViaCount Flex(Guava Technologies；Hayward，CA)+2％二甲亚砜(Guava Technologies；Hayward，CA)的溶液。产生的细胞悬液无菌地转移到超低簇96孔微量培养板中用于在Guava EasyCyte仪器(Guava Technologies；Hayward，CA)中计数。
在24孔微量培养板中的接种和培养。低温保存的hUTC小瓶被解冻，洗涤并重悬浮在生长培养基中。利用Hayflick和Adv.DMEM/F12制备生长培养基，其补充有15％、7.5％和3.75％。1.00E+04hUTC每孔添加到每种条件的四个孔。每个孔含有1ml生长培养基。平板在5％CO2、37℃组织培养孵化器中培养96小时。
来自24孔微量培养板的细胞的收获和计数。含有细胞的24孔微量培养板从孵育中取出，通过无菌的抽吸除去培养基。用1mlPBS每孔来洗涤细胞；通过无菌抽吸来除去PBS，添加500μl TrypLESelect。细胞在37℃孵育5分钟，之后，轻轻地敲打平板来移去细胞。细胞悬液吸移几次，然后转移到含有500μl Guava ViaCount试剂(Guava Technologies，Haywood，CA)的1.5mL Eppendporf试管用于在Guava PCA仪器(Guava Technologies，Haywood，CA)中计数。
在T75烧瓶中的接种和培养。低温保存的hUTC的小瓶被解冻，洗涤并重悬浮在生长培养基中。3.75E+05hUTC添加到含有15ml培养基的T75烧瓶中。烧瓶在5％CO2、37℃组织培养孵化器中培养三到四天。
来自T75烧瓶的细胞的收获和传代。含有细胞的T75烧瓶从孵育中取出，通过无菌的抽吸除去培养基。细胞用5mLPBS洗涤；通过无菌抽吸除去PBS并替换为1ml TrypLE Select。细胞在37℃孵育5分钟，之后，轻轻地敲打烧瓶来移去粘附的细胞。5ml的培养基添加给每个烧瓶，细胞悬液通过吸移管转移到锥形管中。细胞在300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中，为细胞计数获取整分试样。在计数之后，获得了被计算含有3.75E+05细胞的整分试样，被用于接种含有新鲜培养基的新的T75烧瓶。
在100ml旋转烧瓶中的接种和培养。低温保存的hUTC小瓶被解冻，洗涤并重悬浮在生长培养基中。3.1E+06hUTC添加到含有100ml培养基的100ml旋转烧瓶中的1.2g的Hillex II(5.0×103个细胞每cm2)，并置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘上的旋转烧瓶置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
100ml旋转烧瓶培养物向500旋转烧瓶培养物的传代。100ml旋转烧瓶从它的旋转盘上取下，容许微载体沉淀。上清液培养基通过抽吸来除去，其余的具有粘附细胞的微载体堆重悬浮在20ml新鲜的生长培养基中。具有粘附细胞的微载体然后通过吸移管无菌地转移到含有480ml新鲜生长培养基和4.8g Hillex II微载体(6g最终的微载体内含物或12g/L的最终微载体浓度)的500ml旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘上的旋转烧瓶置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
一个500ml旋转烧瓶培养物向五个500ml旋转烧瓶培养物的传代。500ml旋转烧瓶从它的旋转盘上取下，容许微载体沉淀。上清液培养基通过抽吸来除去，其余的具有粘附细胞的微载体堆重悬浮在50ml新鲜的生长培养基中。具有粘附细胞的10ml整分试样的微载体然后通过吸移管无菌地转移到每个含有490ml新鲜生长培养基和4.8g Hillex II微载体(6g最终的微载体内含物或12g/L的最终微载体浓度)的五个独立的500ml旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘上的旋转烧瓶置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
附着到Hillex II微载体的细胞的收获。旋转烧瓶从它的旋转盘上取下，容许具有粘附的细胞的微载体靠重力沉淀。上清液培养基无菌地吸出。等于旋转烧瓶的工作体积的体积的PBS添加到旋转烧瓶中，容许微载体靠重力沉淀。在微载体的沉淀时，无菌地吸出PBS，等于工作体积的1/5体积的TrypLE Select添加到旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后在旋转盘上以60rpm持续旋转孵育10分钟。从它的旋转盘上取下旋转烧瓶，容许微载体靠重力沉淀。利用25ml的血清吸移管，微载体/TrypLE Select溶液通过上下地吸移～10次来从微载体上离解残余的粘附细胞。含有细胞的上清液通过重复地吸移来收集并转移到填充有100μm细胞渗滤器的多个锥形管。在收集细胞悬液之前用5mlPBS填充试管。在收集细胞悬液之后，试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中。
生存力染色。1ml整分试样的培养基和微载体转移到15ml锥形管，容许微载体靠重力沉淀。通过无菌抽吸来除去培养基，替换为1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224；Carlsbad，CA)在37℃孵育15分钟。在孵育之后，20μl整分试样施加到玻璃显微镜载玻片上，通过荧光显微镜检查来观察活细胞染色为绿色，非活细胞染色为红色。人工地分析显微镜视野来评估附着于微载体的活细胞的分布。评估至少三个显微镜视野，统计活细胞的近似的百分比。
培养物细胞计数-TrypLE Select分析。5ml(100ml旋转烧瓶)或10ml(500ml旋转烧瓶)整分试样的同质的微载体悬浮液从旋转烧瓶容器中获取，转移到15ml试管。容许微载体重力分离，通过无菌抽吸除去上清液培养基。微载体用10ml PBS洗涤一次，容许微载体重力分离，通过无菌抽吸除去PBS上清液。微载体在TrypLESelect中在37℃孵育十分钟。在孵育之后，添加5ml的PBS，容许微载体重力分离。含有细胞的上清液通过重复吸移来收集，转移到预先用1ml FBS加载的多个锥形管中。试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中，整分试样用于利用Guava PCA仪器(Guava Technologies，Haywood，CA)测定细胞计数。
流式细胞术。使用US2004877012A中声明的方法，利用Becton-Dickinson FACSCalibur仪器(Becton Dickinson，San Jose，CA)通过流式细胞术分析收获的hUTC来确定细胞表面标志物分布。所有抗体购自BD PharMingen(San Diego，CA)。
结果 表30.在96孔微量培养板形式增殖分析中来自hUTC分离物120304的每个孔的平均细胞。使用的培养基是具有连续稀释的FBS的Hayflick和具有连续稀释的FBS的改进的DMEM/F 12+4.00mMGlutaMAX。
表31.在24孔微量培养板形式增殖分析中来自hUTC分离物120304的每个孔的平均细胞。使用的培养基是具有3.75％，7.5％或15％的FBS的Hayflick或改进的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX。
表32.在改进的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在T75(烧瓶1)上hUTC分离物120304的连续培养。
改进的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS-烧瓶1 表33.在改进的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在T75(烧瓶2)上hUTC分离物120304的连续培养。
改进的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS-烧瓶2 表34.在改进的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在T75(烧瓶3)上hUTC分离物120304的连续培养。
改进的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS-烧瓶3 表35.在生长培养基中在T75(烧瓶1)上hUTC分离物120304的连续培养 生长培养基-烧瓶1 表36.在生长培养基中在T75(烧瓶2)上hUTC分离物120304的连续培养 生长培养基-烧瓶2 表37.在生长培养基中在T75(烧瓶2)上hUTC分离物120304的连续培养 生长培养基-烧瓶3 表38.在改进的DMEM/F12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS中在旋转烧瓶中hUTC分离物120304的连续培养 在旋转烧瓶培养中的改进的DMEM/F12+4.00mM GlutaMAX+7.5％FBS 表39.在生长培养基中在旋转烧瓶中hUTC分离物120304的连续培养 在旋转烧瓶培养中的生长培养基 表40.在改进的DMEM/F 12+4.0mM GlutaMAX+7.5％FBS或生长培养基中扩增的hUTC的细胞表面蛋白表达的比较。
低温保存的hUTC分离物120304被解冻，在具有降低的血清生长培养基的双份T75烧瓶中扩增十一次传代。每个复本T75烧瓶的每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长。每次群体倍增的小时数的所有数据点通过单向ANOA的统计分析对于所有数据点没有显示hUTC生长动力学方面的显著差异(p＝0.821)。在降低的血清培养基中扩增的hUTC的细胞表面蛋白表达与在标准生长培养基中扩增的hUTCs一致。
同样，低温保存的hUTC分离物120304被解冻，在具有降低的血清生长培养基、含有Hillex II微载体的旋转烧瓶中扩增三次传代。每个旋转烧瓶的每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长。每次群体倍增的平均小时数的双样品t-测验的统计分析显示了在两种测试的培养基之间的hUTC生长动力学没有显著差异(p＝0.424)。
该数据表明，hUTC利用降低的血清培养基在静态T烧瓶中或微载体培养系统中以稳定的、一致的方式扩增多次传代，并保持它的表型细胞表面蛋白表达的能力。
实施例9 在3L生物反应器中Hillex II微载体上hUTC的扩增
这项研究的目标是在小试规模(bench scale)生物反应器中扩增附着到Hillex II微载体的人类脐组织来源的细胞(hUTC)多次群体倍增。在小试规模生物反应器中在Hillex II上扩增hUTC多次群体倍增的能力将提供模型的生物处理系统，来扩大到用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。在500ml旋转烧瓶中在Hillex II微载体上扩增到大约70％汇合的hUTC分离物CNTO 2476被用于接种含有另外的培养基和Hillex II微载体的3L生物反应器。细胞在生物反应器中培养五天，采集整分试样来计算运行中期细胞计数。
hUTC在五天内实现了大约六次群体倍增。每次群体倍增的小时数是稳定的对数生长的指示。通过CO2空气覆盖而不用鼓泡，系统的pH值被成功地维持在7.0。通过氧气空气覆盖而不用鼓泡，系统的DO被成功地维持在40％。
这个数据展现了hUTC在小试规模生物反应器中在Hillex II上扩增的能力。这个模型的生物加工系统可以被扩大，用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。
这项研究的目标是在小试规模生物反应器中扩增附着到Hillex II微载体的人类脐组织来源的细胞(hUTC)多次群体倍增。在小试规模生物反应器中在Hillex II上扩增hUTC多次群体倍增的能力将提供模型的生物处理系统，来扩大到用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。在500ml旋转烧瓶中在Hillex II微载体上扩增到大约70％汇合的hUTC分离物CNTO 2476被用于接种含有另外的培养基和Hillex II微载体的3L生物反应器。细胞在生物反应器中培养五天，采集整分试样来计算运行中期细胞计数。
材料和方法
细胞。使用了低温保存的扩增的人类脐带组织细胞(hUTC)分离物CNTO 2476 lot 25126078 PD 7。
生长培养基。Dulbecco′s改良的Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖没有酚红(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan，UT)，4.0mM GlutaMAX(Gibco-Grand Island，NY)。
收获试剂。1x TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)，10x TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)。
微载体。Hillex II(SoloHill Inc.-Ann Arbor，MI)微载体在DI水中水化至少30分钟并高压灭菌。Hillex II微载体以12g/L的浓度使用。
生物反应器。具有B-DCU控制器(Sartorius BBI，Bethlehem，PA)的3L夹套生物反应器(Applikon，Inc.，FosterCity，CA)。
生物反应器接种。从500ml旋转烧瓶产生的、具有大约70％汇合的附着细胞的6g微载体无菌地转移到含有30g Hillex II和大约2L生长培养基的3L生物反应器中。然后添加其他生长培养基得到最终体积3L。
生物反应器设置。生物反应器叶轮被设置为85-100PRM。pH设置点是7.0，用CO2添加来控制。溶解氧(DO)被容许从100％降到40％DO设置点，通过氧添加来维持。空气覆盖被设置为50ccm，不使用鼓泡。
附着到Hillex II微载体的细胞的收获。生物反应器叶轮被关闭，容许具有粘附细胞的微载体靠重力沉淀。培养基上清液通过位于沉淀的微载体上方的滴管来泵出。将3L PBS泵入生物反应器中，容许微载体靠重力沉淀。PBS上清液通过位于沉淀的微载体上方的滴管来泵出。然后将500ml的1×TrypLE select和50ml的10×TrypLEselect泵入生物反应器。打开生物反应器叶轮65rpm 10分钟。叶轮被关闭，容许微载体靠重力沉淀。含有细胞的上清液通过位于沉淀的微载体上的滴管泵出到用少量FBS预先加载的转移容器。然后将1L PBS泵入生物反应器来重悬浮任何剩余的细胞。含有细胞的上清液通过位于沉淀的微载体上的滴管泵出到用FBS预先加载的转移容器。所有的含细胞上清液转移到多个500ml锥形管中。试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中，为细胞计数获取整分试样。
培养中细胞计数-TrypLE分析。5ml(100ml旋转烧瓶)或10ml(500ml旋转烧瓶)整分试样的同质的微载体悬浮液从旋转烧瓶容器中获取，转移到15ml试管。容许微载体重力分离，通过抽吸除去上清液。微载体用10ml PBS洗涤一次，容许微载体重力分离，通过抽吸除去PBS上清液。微载体在TrypLE Select中在37℃孵育十分钟。在孵育之后，添加5ml的PBS，容许微载体重力分离。含有细胞的上清液通过重复吸移来收集，转移到预先用1ml FBS加载的多个锥形管中。试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中，使用整分试样确定细胞计数。
结果 表41.hUTC分离物CNTO 2476在Hillex II微载体上的连续培养。
在Hillex II上的CNTO 2476
以70％汇合附着到6g的Hillex II上的hUTC分离物CNTO 2476被用于接种3L生物反应器。通过CO2空气覆盖而不用鼓泡，系统的pH值被成功地维持在7.0。通过氧气空气覆盖而不用鼓泡，系统的DO被成功地维持在40％。hUTC在五天内实现了大约六次群体倍增。每次群体倍增的小时数是稳定的对数生长的指示。这个数据展现了hUTC在小试规模生物反应器中在Hillex II上扩增的能力。这个模型的生物加工系统可以被扩大，用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。
实施例10 hUTC以12-24克/升浓度在Hillex II微载体上的扩增
这项研究的目标是在旋转烧瓶中在多种微载体浓度下连续地培养附着到Hillex II微载体的人类脐组织来源的细胞(hUTC)。在各种的微载体浓度的微载体上扩增hUTC的能力将提供用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产的更大的灵活性和选择。低温保存的hUTC分离物120304被解冻，立即用于接种含有浓度为12、16、20或24g/L Hillex II微载体的旋转烧瓶，连续培养多次传代。
群体倍增12.8时低温保存的hUTC分离物120304能够被解冻，在Hillex II微载体上扩增七次传代。每种微载体浓度的每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长。每次群体倍增的小时数的所有数据点通过单向ANOA的统计分析对于所有测试的条件没有显示hUTC生长动力学方面的显著差异(p＝0.277)。这个数据表明了hUTC以稳定的、一致的方式在微载体上扩增七次传代的能力。
这项研究的目标是在旋转烧瓶中在多种微载体浓度下连续地培养附着到Hillex II微载体的扩增的人类脐组织来源的细胞(hUTC)。在各种的微载体浓度的微载体上扩增hUTC的能力将提供用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产的更大的灵活性和选择。低温保存的hUTC分离物120304被解冻，立即用于接种含有浓度为12、16、20或24g/L Hillex II微载体的旋转烧瓶，连续培养多次传代。
材料和方法
细胞。低温保存的扩增的人类脐带组织细胞(hUTC)分离物12034群体倍增(PD)12。
生长培养基。Dulbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan UT)，青霉素/链霉素(P/S)(Gibco-Grand Island，NY)，β巯基乙醇(BME)(Sigma-St.Louis，MO)。
微载体。Hillex II微载体在DI水中水化至少30分钟，高压灭菌。Hillex II微载体以12、16、20和24g/L的浓度使用。(1gHillex II＝515cm2表面积)。
旋转烧瓶。使用100ml和500ml单一用途、一次性的旋转烧瓶(Corning，Inc.；Corning，NY)。
在100ml旋转烧瓶中的接种和培养。100ml旋转烧瓶用100ml生长培养基和合适浓度的微载体加载，来实现每升12、16、20或24克Hillex II。低温保存的hUTC小瓶被解冻，洗涤并重悬浮在生长培养基中。合适数量的细胞添加到每个100ml旋转烧瓶中来实现5.0×103个细胞每cm2。加载细胞的旋转烧瓶置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
从一个100ml旋转烧瓶到一个500ml旋转烧瓶的培养物的传代。从旋转盘上取下100ml旋转烧瓶，容许微载体沉淀。培养基上清液通过抽吸除去。具有粘附细胞的剩余的微载体堆重悬浮在20ml新鲜的生长培养基中。具有粘附细胞的微载体然后通过吸移管无菌地转移到含有480ml新鲜生长培养基和4.8g Hillex II微载体(6g最终的微载体含量)或1.2g Cytodex 1(1.5g的最终微载体含量)的一个500ml旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
从一个100ml旋转烧瓶到一个100ml旋转烧瓶的培养物的传代。从旋转盘上取下100ml旋转烧瓶，容许微载体沉淀。培养基上清液通过抽吸除去。具有粘附细胞的剩余的微载体堆重悬浮在50ml新鲜的生长培养基中。具有粘附细胞的微载体的10ml整分试样然后通过吸移管无菌地转移到独立的100ml旋转烧瓶中，所述旋转烧瓶各自含有90ml新鲜的生长培养基和0.96g Hillex II(1.2g最终的微载体含量)。旋转烧瓶然后置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
附着到Hillex II微载体的细胞的收获。从旋转盘上取下旋转烧瓶，容许具有粘附细胞的微载体靠重力沉淀。培养基上清液通过抽吸除去。等于旋转烧瓶的工作体积的体积的PBS添加到旋转烧瓶中，容许微载体靠重力沉淀。等于工作体积的1/5的体积的TrypLEselect体积添加到旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后在旋转盘上在60rpm孵育10分钟。从旋转盘上取下旋转烧瓶，容许微载体靠重力沉淀。利用25ml的血清吸移管，微载体-TrypLE Select溶液通过上下地吸移～10次来搅拌，以从微载体上离解残余的粘附细胞。含有细胞的上清液通过重复地吸移来收集，转移到用5ml FBS预先加载的多个锥形管中，在试管开口处插入100μm过滤单元。试管在300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中。
生存力染色。1ml整分试样的培养基和微载体转移到15ml锥形管，容许微载体靠重力分离。通过抽吸来除去培养基，替换为1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分钟。在孵育之后，20μl整分试样添加到玻璃显微镜载玻片，通过荧光显微镜检查来观察。活的细胞染色为绿色。人工地分析显微镜视野来评估附着于微载体的活细胞的分布。评估至少三个显微镜视野，统计活细胞的近似的百分比。
培养中细胞计数-TrypLE分析。5ml(100ml旋转烧瓶)或10ml(500ml旋转烧瓶)整分试样的同质的微载体悬浮液从旋转烧瓶容器中获取，转移到15ml试管。容许微载体重力分离，通过抽吸除去上清液。微载体用10ml PBS洗涤一次，容许微载体重力分离，通过抽吸除去PBS上清液。微载体在TrypLE Select中在37℃孵育十分钟。在孵育之后，添加5ml的PBS，容许微载体重力分离。含有细胞的上清液通过重复吸移来收集，转移到预先用1ml FBS加载的多个锥形管中。试管在300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中，整分试样用于利用Guava PCA仪器(Guava Technologies，Haywood，CA)测定细胞计数。
结果 表42.hUTC分离物120304在12g/L Hillex II微载体上的连续培养。
12g/L Hillex II 表43.hUTC分离物120304在16g/L Hillex II微载体上的连续培养。
16g/L Hillex II 表44.hUTC分离物120304在20g/L Hillex II微载体上的连续培养。
20g/L Hillex II 表45.hUTC分离物120304在24g/L Hillex II微载体上的连续培养。
24g/L Hillex II
群体倍增12.8时低温保存的hUTC分离物120304能够被解冻，在Hillex II微载体上扩增七次传代。每种微载体浓度的每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长。每次群体倍增的小时数的所有数据点通过单向ANOA的统计分析对于所有测试的条件没有显示hUTC生长动力学方面的显著差异(p＝0.277)。这个数据表明了hUTC以稳定的、一致的方式在微载体上扩增七次传代的能力。
实施例11 在连续旋转烧瓶培养中微载体上hUTC的扩增
这项研究的目标是在旋转烧瓶中连续地培养附着到商业微载体的人类脐组织来源的细胞(hUTC)多次群体倍增。在微载体上扩增hUTC多次群体倍增的能力将提供模型系统，来扩大到用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。评估了两种hUTC分离物，120304-分离的、扩增的和在研究条件下低温保存的，以及CNTO 2476-分离的、扩增的和在GMP条件下低温保存的。还评估了商业的微载体Cytodex 1或Hillex II。低温保存的细胞被解冻，用于立即接种旋转烧瓶培养物。细胞连续地培养多次传代，直到细胞达到大约群体倍增30。还在T225烧瓶中静态地培养hUTCs作为对照。
群体倍增12.8的低温保存的hUTC分离物120304能够被解冻，在Cytodex 1和Hillex II微载体上分别扩增到群体倍增28.6和28.7。每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长，与T烧瓶生长动力学一致。群体倍增22.6的低温保存的hUTC分离物CNTO 2476能够被解冻，在Cytodex 1和Hillex II微载体上分别扩增到群体倍增33.2和31.0。每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长，也与T烧瓶生长动力学一致。每次群体倍增的小时数的所有数据点通过单向ANOA的统计分析对于所有测试的条件没有显示hUTC生长动力学方面的显著差异(p＝0.988)。同样，对于所有测试的条件，在最终收获物时细胞表面蛋白表达保持一致。
这个数据展现了hUTC以维持细胞表面蛋白质表型的稳定的、一致的方式在微载体上扩增到大约30次群体倍增的能力。这个模型系统可以被扩大用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。
这项研究的目标是在旋转烧瓶中连续地培养附着到商业微载体的人类脐组织来源的细胞(hUTC)多次群体倍增。在微载体上扩增hUTC多次群体倍增的能力将提供模型系统，来扩大到用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。评估了两种hUTC分离物，120304分离的、扩增的和在研究条件下低温保存的，以及CNTO 2476，分离的、扩增的和在GMP条件下低温保存的。评估了商业的微载体Cytodex1或Hillex II。低温保存的细胞被解冻，用于立即接种旋转烧瓶培养物。细胞连续地培养多次传代，直到细胞达到群体倍增30。还在T225烧瓶中静态地培养hUTCs作为对照。
材料和方法
细胞。使用了低温保存的扩增的人类脐带组织细胞(hUTC)分离物12034群体倍增(PD)12和hUTC分离物CNTO 2476lot 25126078 PD 22。
生长培养基。Dulbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan UT)，青霉素/链霉素(P/S)(Gibco-Grand Island，NY)，β巯基乙醇(BME)(Sigma-St.Louis，MO)。
微载体。Cytodex 1(GE Health Sciences-Piscataway，NJ)微载体在PBS中水化至少3小时并高压灭菌。Cytodex 1微载体以3g/L的浓度使用。Hillex II(SoloHill Inc.-Ann Arbor，MI)微载体在去离子水中水化至少30分钟高压灭菌。Hillex II微载体以12g/L的浓度使用。
旋转烧瓶。使用100ml和500ml单一用途、一次性的旋转烧瓶(Corning，Inc.；Corning，NY)。
在100ml旋转烧瓶中的接种和培养。低温保存的hUTC小瓶被解冻，洗涤并重悬浮在生长培养基中。6.6×106hUTC添加到含有100ml培养基的100ml旋转烧瓶中的3000mg cytodex 1(5.0×103细胞每cm2)，置于37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。旋转盘设置为60rpm持续旋转。3.1×106个hUTC添加到含有100ml培养基的100ml旋转烧瓶中的1.2g的Hillex II(5.0×103个细胞每cm2)，并置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘置于5％CO2中。
从一个100ml旋转烧瓶到一个500ml旋转烧瓶的培养物的传代。从旋转盘上取下100ml旋转烧瓶，容许微载体沉淀。培养基上清液通过抽吸除去。具有粘附细胞的剩余的微载体堆重悬浮在20ml新鲜的生长培养基中。具有粘附细胞的微载体然后通过吸移管无菌地转移到含有480ml新鲜生长培养基和4.8g Hillex II微载体(6g最终的微载体内含物)或1.2g Cytodex 1(1.5g的最终微载体内含物)的一个500ml旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
从一个500ml旋转烧瓶到五个500ml旋转烧瓶的培养物的传代。
从旋转盘上取下500ml旋转烧瓶，容许微载体沉淀。培养基上清液通过抽吸除去。具有粘附细胞的剩余的微载体堆重悬浮在50ml新鲜的生长培养基中。具有粘附细胞的微载体的五个独立的10ml整分试样然后通过吸移管无菌地转移到各自含有490ml新鲜生长培养基和4.8g Hillex II(6g最终的微载体内含物)或1.2g Cytodex 1(1.5g的最终微载体内含物)的五个独立的500ml旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后置于设置到60rpm持续旋转的旋转盘上。旋转盘置于5％CO2、37℃组织培养孵化器中，孵育三到四天。
附着到Cytodex 1微载体的细胞的收获。从旋转盘上取下500ml旋转烧瓶，容许具有粘附细胞的微载体靠重力沉淀。培养基上清液通过抽吸除去。将500ml PBS添加到旋转烧瓶中，容许微载体靠重力沉淀。PBS上清液通过抽吸除去。500ml DMEM-低葡萄糖添加到旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后在旋转盘上以60rpm孵育20分钟。从旋转盘上取下旋转烧瓶，容许微载体靠重力沉淀。通过抽吸除去DMEM-低葡萄糖上清液。500ml的PBS添加到旋转烧瓶中。旋转烧瓶然后在旋转盘上以60rpm孵育20分钟。从旋转盘上取下旋转烧瓶，容许微载体靠重力沉淀。PBS上清液通过抽吸除去。向旋转烧瓶添加250ml TrypLE select。旋转烧瓶然后在旋转盘上以60rpm孵育10分钟。从旋转盘上取下旋转烧瓶，容许微载体靠重力沉淀。利用50ml的血清吸移管，微载体-TrypLE Select溶液通过上下地吸移～10次来搅拌，以从微载体上离解残余的粘附细胞。然后将250ml PBS添加到旋转烧瓶中，容许微载体靠重力沉淀。含有细胞的上清液通过重复的吸移来收集，转移到用5ml FBS预先加载的多个锥形管中，100μm的过滤单元插入到试管开口中。试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中。
附着到Hillex II微载体的细胞的收获。从旋转盘上取下500ml旋转烧瓶，容许具有粘附细胞的微载体靠重力沉淀。培养基上清液通过抽吸除去。将500ml PBS添加到旋转烧瓶中，容许微载体靠重力沉淀。向旋转烧瓶添加100ml TrypLE select。旋转烧瓶然后在旋转盘上以60rpm孵育10分钟。从旋转盘上取下旋转烧瓶，容许微载体靠重力沉淀。利用25ml的血清吸移管，微载体-TrypLE Select溶液通过上下地吸移～10次来搅拌，以从微载体上离解残余的粘附细胞。含有细胞的上清液通过重复的吸移来收集，转移到用5ml FBS预先加载的多个锥形管中，100μm的过滤单元插入到试管开口中。试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中。
生存力染色。1ml整分试样的培养基和微载体转移到15ml锥形管，容许微载体靠重力分离。通过抽吸来除去培养基，替换为1ml活/死染色溶液(Molecular Probes cat.no.L3224)，在37℃孵育15分钟。在孵育之后，20μl整分试样施加到玻璃显微镜载玻片上，通过荧光显微镜检查来观察。活的细胞染色为绿色。人工地分析显微镜视野来评估附着于微载体的活细胞的分布。评估至少三个显微镜视野，统计活细胞的近似的百分比。
培养中细胞计数-核释放分析。5ml(100ml旋转烧瓶)或10ml(500ml旋转烧瓶)整分试样的同质的微载体悬浮液从旋转烧瓶容器中获取，转移到15ml试管。容许微载体重力分离，通过抽吸除去上清液。微载体用10ml PBS洗涤一次，容许微载体重力分离，通过抽吸除去PBS上清液。微载体在核释放溶液(含有0.1％w/v结晶紫(Sigma-St.Louis，MO)的0.1M柠檬酸(Sigma-St.Louis，MO))中在37℃孵育1小时。在孵育之后，含有核释放溶液的100μl整分试样的微载体添加到100μl PBS中。10μl整分试样的这种溶液然后加载到血球计中，对释放的核计数。
培养中细胞计数-TrypLE分析。5ml(100ml旋转烧瓶)或10ml(500ml旋转烧瓶)整分试样的同质的微载体悬浮液从旋转烧瓶容器中获取，转移到15ml试管。容许微载体重力分离，通过抽吸除去上清液。微载体用10ml PBS洗涤一次，容许微载体重力分离，通过抽吸除去PBS上清液。微载体在TrypLE Select中在37℃孵育十分钟。在孵育之后，添加5ml的PBS，容许微载体重力分离。含有细胞的上清液通过重复吸移来收集，转移到预先用1ml FBS加载的多个锥形管中。试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中，整分试样用于利用Guava PCA仪器(Guava Technologies，Haywood，CA)测定细胞计数。
静态T-烧瓶培养。低温保存的hUTC小瓶被解冻，洗涤并重悬浮在生长培养基中。使用US2004877012A中声明的方法在T225中静态地培养细胞多次传代。
流式细胞术。使用US2004877012A中声明的方法，利用Becton-Dickinson FACSCalibur仪器(Becton Dickinson，San Jose，CA)通过流式细胞术分析收获的hUTC来确定细胞表面标志物分布。所有抗体购自BD PharMingen(San Diego，CA)。
结果 表46.hUTC分离物120304在Cytodex 1微载体上的连续培养。
120304-Cytodex 1 表47.hUTC分离物120304在Hillex II微载体上的连续培养。
120304-Hillex II 表48.hUTC分离物CNTO 2476在Cytodex 1微载体上的连续培养。
CNTO 2476-Cytodex 1 表49.hUTC分离物CNTO 2476在Hillex II微载体上的连续培养。
CNTO 2476-Hillex II 表50.hUTC分离物120304在T225烧瓶中的连续培养。
120304-T225烧瓶 表51.通过流式细胞术分析的在微载体和T-烧瓶中扩增的hUTC的细胞表面蛋白表达的比较。
群体倍增12.8的低温保存的hUTC分离物120304能够被解冻，在Cytodex 1和Hillex II微载体上分别扩增到群体倍增28.6和28.7。每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长，与T烧瓶生长动力学一致。群体倍增22.6的低温保存的hUTC分离物CNTO 2476能够被解冻，在Cytodex 1和Hillex II微载体上分别扩增到群体倍增33.2和31.0。每次群体倍增的小时数在传代与传代之间是一致的，表明了稳定的对数性生长，也与T烧瓶生长动力学一致。每次群体倍增的小时数的所有数据点通过单向ANOA的统计分析对于所有测试的条件没有显示hUTC生长动力学方面的显著差异(p＝0.988)。同样，对于所有测试的条件，在最终收获时细胞表面蛋白表达保持一致。这个数据展现了hUTC以维持细胞表面蛋白质表型的稳定的、一致的方式在微载体上扩增到大约30次群体倍增的能力。这个模型系统可以被扩大用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。
实施例12 在3L生物反应器中Cytodex 1微载体上hUTC的扩增
这项研究的目标是在小试规模生物反应器中扩增附着到Cytodex 1微载体的人类脐组织来源的细胞(hUTC)多次群体倍增。在小试规模生物反应器中在cytodex 1上扩增hUTC多次群体倍增的能力将提供模型的生物处理系统，来扩大到用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。在500ml旋转烧瓶中在Cytodex 1微载体上扩增到大约70％汇合的hUTC分离物CNTO 2476被用于接种含有另外的培养基和Cytodex 1微载体的3L生物反应器。细胞在生物反应器培养六天，在第3天采集整分试样来计算运行中期细胞计数。
hUTC在六天内实现了大约三次群体倍增。通过CO2空气覆盖而不用鼓泡，系统的pH值被成功地维持在7.0。通过氧气空气覆盖而不用鼓泡，系统的DO被成功地维持在40％。培养物从第0天到第3天的增殖指示了稳定的指数生长。从第4天到第6天所见的降低的增殖速率很可能由于培养基中提高的细胞群对营养物(即，葡萄糖)的耗尽。
这个数据展现了hUTC在小试规模生物反应器中在Cytodex 1上扩增的能力。这个模型的生物加工系统可以被扩大，用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。
这项研究的目标是在小试规模生物反应器中扩增附着到Cytodex 1微载体的人类脐组织来源的细胞(hUTC)多次群体倍增。在小试规模生物反应器中在Cytodex 1上扩增hUTC多次群体倍增的能力将提供模型的生物处理系统，来扩大到用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。在500ml旋转烧瓶中在Cytodex 1微载体上扩增到大约70％汇合的hUTC分离物CNTO 2476被用于接种含有另外的培养基和Cytodex 1微载体的3L生物反应器。细胞在生物反应器培养六天，在第3天采集整分试样来计算运行中期细胞计数。材料和方法
细胞。使用了低温保存的扩增的人类脐带组织细胞(hUTC)分离物CNTO 2476 lot 25126078 PD 7。
生长培养基。Dulbecco′s改良的Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖没有酚红(Gibco-Grand Island，NY)，15％胎牛血清(FBS)(HyClone-Logan，UT)，4.0mM GlutaMAX(Gibco-Grand Island， NY)。
收获试剂。1×TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)，10×TrypLE Select(Gibco-Grand Island，NY)。
微载体。Cytodex 1(GE Health Sciences-Piscataway，NJ)微载体在PBS中水化至少3小时并高压灭菌。Cytodex 1微载体在3g/L的浓度使用。
生物反应器。具有B-DCU控制器(Sartorius BBI，Bethlehem，PA)的3L夹套生物反应器(Applikon，Inc.，Foster City，CA)。
生物反应器接种。从500ml旋转烧瓶产生的、具有大约70％汇合的附着细胞的1.5g微载体无菌地转移到含有7.5g Cytodex 1和大约2L生长培养基的3L生物反应器中。然后添加其他生长培养基得到最终体积3L。
生物反应器设置。生物反应器叶轮为65PRM。pH设置点是7.0，用CO2添加来控制。溶解氧(DO)被容许从100％降到40％DO设置点，通过氧添加来维持。空气覆盖被设置为25-150ccm，不使用鼓泡。
附着到Cytodex 1微载体的细胞的收获。生物反应器叶轮被关闭，容许具有粘附细胞的微载体靠重力沉淀。培养基上清液通过位于沉淀的微载体上方的滴管来泵出。将3L PBS泵入生物反应器中，容许微载体靠重力沉淀。PBS上清液通过位于沉淀的微载体上方的滴管来泵出。3L的DMEM-低葡萄糖泵入到生物反应器中。打开生物反应器叶轮为65rpm 30分钟。然后叶轮被关闭，容许微载体靠重力沉淀。DMEM-低葡萄糖上清液通过位于沉淀的微载体上方的滴管来泵出。然后将3L的PBS泵入到生物反应器中。打开生物反应器叶轮为65rpm 20分钟。然后叶轮被关闭，容许微载体靠重力沉淀。PBS上清液通过位于沉淀的微载体上方的滴管来泵出。然后将1L的1×TrypLEselect和50ml的10×TrypLE select泵入生物反应器。打开生物反应器叶轮为65rpm 20分钟。叶轮被关闭，容许微载体靠重力沉淀。含有细胞的上清液通过位于沉淀的微载体上的滴管泵出到用少量FBS预先加载的转移容器。然后将1.5L PBS泵入生物反应器来重悬浮任何剩余的细胞。含有细胞的上清液通过位于沉淀的微载体上的滴管泵出到用FBS预先加载的转移容器。所有的含细胞上清液转移到多个500ml锥形管中。试管以300rcf离心5分钟，倒出上清液，细胞重悬浮在生长培养基中，为细胞计数获取整分试样。
培养中细胞计数-核释放分析。从旋转烧瓶容器获取同质的微载体悬浮液的整分试样，转移到15ml试管中。容许微载体重力分离，通过抽吸除去上清液。微载体用10ml PBS洗涤一次，容许微载体重力分离，通过抽吸除去PBS上清液。微载体在核释放溶液(含有0.1％w/v结晶紫(Sigma-St.Louis，MO)的0.1M柠檬酸(Sigma-St.Louis，MO))中在37℃孵育1小时。在孵育之后，将含有核释放溶液的100μl整分试样的微载体添加到100μl PBS中。然后将这种溶液的10μl整分试样装入血球计中，对释放的核计数。
结果 表52.hUTC分离物CNTO 2476在Cytodex 1微载体上的连续培养。
在Cytodex 1上的CNTO 2476
以70％汇合附着到1.5g的Cytodex 1上的hUTC分离物CNTO 2476被用于接种3L生物反应器。通过CO2空气覆盖而不用鼓泡，系统的pH值被成功地维持在7.0。通过氧气空气覆盖而不用鼓泡，系统的DO被成功地维持在40％。hUTC在六天内实现了大约三次群体倍增。培养物从第0天到第3天的增殖指示出稳定的对数生长。从第4天到第6天所见的降低的增殖速率很可能由于培养基中提高的细胞群对营养物(即，葡萄糖)的耗尽。
这个数据展现了hUTC在小试规模生物反应器中在Cytodex 1上扩增的能力。这个模型的生物加工系统可以被扩大，用于细胞治疗应用的hUTC的大规模生产。
权利要求
1.一种培养贴壁依赖产后细胞的方法，包括，
提供至少一种贴壁依赖产后细胞；
提供用于生长所述产后细胞的细胞生长培养基；
提供至少一种用于所述贴壁依赖产后细胞的附着的载体颗粒；和
在存在所述生长培养基的情况下在允许所述细胞的附着和生长的条件下使所述贴壁依赖细胞与所述载体颗粒接触，
从而培养所述贴壁依赖产后细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞是脐来源的细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞是胎盘来源的细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述载体颗粒含有生物学活性试剂。
5.权利要求1的方法，其进一步包括与所述贴壁依赖产后细胞共同培养的第二细胞类型。
6.权利要求1的方法，其中所述载体颗粒是微载体。
7.权利要求6的方法，其中所述微载体由选自胶原蛋白、葡聚糖、纤维素、玻璃、陶瓷、金属、聚苯乙烯、聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯和透明质酸钠的材料组成。
8.权利要求6的方法，其中所述微载体是无蛋白的。
9.权利要求6的方法，其中所述微载体包被有聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明质酸钠、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、N-异丙基丙烯酰胺、玻连蛋白或胶原蛋白。
10.权利要求6的方法，其中所述微载体包含有网纹的或血浆包被的表面。
11.权利要求6的方法，其中所述微载体具有微电流或是顺磁性的。
12.权利要求1的方法，其中所述载体颗粒是多孔的微载体。
13.权利要求12的方法，其中所述多孔的微载体由选自胶原蛋白、葡聚糖、纤维素、玻璃、陶瓷、金属、聚苯乙烯、聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯和透明质酸钠的材料组成。
14.权利要求12的方法，其中所述多孔的微载体是无蛋白的。
15.权利要求12的方法，其中所述多孔的微载体包被有聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯、透明质酸钠、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、N-异丙基丙烯酰胺、玻连蛋白或胶原蛋白。
16.权利要求1121的方法，其中所述多孔的微载体包含有网纹的或血浆包被的表面。
17.权利要求1的方法，其中对于一种或更多种标记物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ，所述细胞表型上相同于在静态培养物中生长的细胞。
18.权利要求17的方法，其中对于标记物CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD117、CD141、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的每一种，所述细胞表型上相同于在静态培养物中生长的细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞的表型包括CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
20.权利要求1的方法，其在约二十天内产生至少约五次群体倍增。
21.权利要求1的方法，其中所述群体的倍增时间低于约100小时。
22.权利要求21的方法，其中所述群体的倍增时间低于约70小时。
23.权利要求1的方法，其中允许所述贴壁依赖产后细胞的附着和生长的条件包括约37℃的温度。
24.权利要求23的方法，其中条件进一步包括旋转烧瓶或生物反应器。
25.权利要求1的方法，其中所述细胞生长培养基包含约7％到约15％的血清浓度。
26.包含根据权利要求1的方法生长的产后来源的细胞的组合物。
27.权利要求26的组合物，其中所述细胞的表型包括CD10+、CD13+、CD31-、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD117-、CD141-、PDGFr-α+、HLA-A+、HLA-B+、HLA-C+、HLA-DR-、HLA-DP-和HLA-DQ-。
28.包含权利要求26的细胞的生物反应器。
29.包含权利要求26的细胞的用于细胞治疗的组合物。
30.包含根据权利要求6的方法生长的人类脐组织来源的细胞的组合物。
全文摘要
本发明提供了用于培养中的哺乳动物细胞的生长和扩增的组合物和方法。特别是，提供了利用表面例如微载体珠子的产后来源的细胞体外生长和扩增的方法。
文档编号C12N5/074GK101611139SQ200780049422
公开日2009年12月23日 申请日期2007年11月13日 优先权日2006年11月13日
发明者A·M·哈蒙, L·S·K·洪, A·J·金, A·戈西夫斯卡 申请人:伊西康公司