专利名称：乳腺特异性人促红细胞生成素表达载体、转基因动物和利用其产生人促红细胞生成素的方法
技术领域：
本发明涉及乳腺特异性人促红细胞生成素表达载体、转基因动物和使用它们产生 人促红细胞生成素的方法。
背景技术：
促红细胞生成素(EP0)是人类红系造血的主要调节物，其是一种糖蛋白激素，在 肾脏内合成，肝脏也合成少量。EP0的分子量约为34000至38000道尔顿，在天冬酰胺24、38、和83具有3个N-连 接的糖，在丝氨酸126具有一个0-连接的糖。由于EP0对于生成红细胞是不可或缺的，因此已经在合成生产EP0，用于某些类型 的贫血患者——例如肾衰引起的贫血、继发于AZT治疗AIDS的贫血和癌症相关性贫血。由于EP0是一种治疗剂，因此一直寻求通过重组DNA技术在哺乳动物细胞培养物 中实现大量生产。采用细胞培养技术大规模生产EP0需要较高的生产成本和更多的专业知 识。此外，由于不能将新产生的EP0与培养基中所含的动物EP0完全分离，因此最终产 生的EP0的纯度和活性较低，结果造成采用上述方法的EPO(hEPO)与天然EP0蛋白相比由 于糖基化不同而具有较低的生理学活性。反之，使用转基因动物在体液中生产重组蛋白质的吸引力在于，与常规细胞培养 技术相比，分离和纯化靶蛋白的方法更加简单，且靶蛋白具有更好的长期活性。迄今为止，靶蛋白在转基因动物的乳腺组织中的表达水平比其他组织中更高。不过，根据目前的报道，使用乳腺特异性启动子的转基因动物的蛋白质生产效率 仍旧处于很低的水平。此外，已经报道了通过乳腺特异性载体进行基因异位表达。韩国待审申请公开文本No. 2001-81456公开了由小鼠乳腺分离的WAP启动子、含 有hEPO基因组基因的EP0转基因表达载体和转基因猪。韩国待审申请公开文本No. 10-2004-101793公开了乳腺中表达hEPO的转基因克 隆牛，其使用的是牛0酪蛋白启动子。尽管如此，这些转基因动物中的hEPO仍未实现商品化，也没有任何有关乳中hEPO 浓度及其活性的结果的记载。为了实现本发明，本发明人构建了可高效表达乳腺特异性hEPO的载体，由此使得 含有该表达载体的转基因动物能够产生具有更高生理学活性的hEPO。
发明内容
本发明的一个目的是提供可表达乳腺特异性hEPO蛋白的载体。本发明的另一个目的是提供插入该载体的转基因动物体细胞。本发明的另一个目的是提供插入该载体的转基因动物。
本发明的另一个目的是提供使用该载体生产转基因动物的方法。本发明的另一个目的是提供在转基因动物中生产hEPO的方法。技术方案在一个实施方式中，本发明提供载体，其表达乳腺特异性hEPO蛋白。在另一个实施方式中，本发明提供pBCl-hEPO-WPRE载体，其具有被鉴定为是编码 3酪蛋白启动子(其是乳腺特异性启动子)的序列的DNA序列；位于所述启动子3'-端 的编码hEPO的DNA序列；和编码WPRE的DNA序列。根据本发明的pBCl-hEPO-WPRE载体，所述编码hEPO的DNA序列可以具有，但不限 于，SEQ ID NO 1所示的序列。根据本发明的pBCl-hEPO-WPRE载体，所述编码0酪蛋白启动子的DNA序列可以 具有，但不限于，SEQ ID NO :2所示的序列。根据本发明的pBCl-hEPO-WPRE载体，所述编码WPRE的DNA序列可以具有，但不限 于，SEQ ID NO 3所示的序列。根据本发明，前述编码0酪蛋白启动子、hEPO和WPRE的DNA序列包括它们的等 价物，所述等价物在前述DNA序列中具有一或多个缺失、取代或添加。更具体地，本发明通过将hEPO基因(SEQ ID NO 1)插入含有山羊3酪蛋白启动 子的PBC1表达载体中而提供pBCl-hEPO表达载体，pBCl-hEPO表达载体可表达乳腺特异性 EP0。必要时，本发明的表达载体pBCl-hEPO可额外含有绝缘子(insulator)，WPRE (旱 獭肝炎病毒转录后调控元件)或新霉素抗性基因，这样可更易于构建转基因细胞系，使得 靶蛋白的表达量最大化，并保证表达水平的稳定性。绝缘子这一因子不仅促进与启动子邻近的调节物的作用，也有助于位置非依赖性 表达(position-ind印endent expression)。其允许在0酪蛋白启动子的调节下稳定地表 达靶蛋白。WPRE这一调节物通过促进mRNA的稳定化而提高靶蛋白的合成。其允许在0酪蛋 白启动子的调节下大量表达靶蛋白。WPRE具有SEQ IDN0:3所示的碱基序列。新霉素抗性基因对建立细胞系所用的G418试剂显示出抗性。其在建立动物细胞 系过程中能够作为有效的选择标记，所述细胞系在0酪蛋白启动子的调节下表达靶蛋白。 新霉素抗性基因具有SEQ ID NO :4所示的碱基序列。本发明提供1)含有 WPRE 的 pBCl-hEPO-WPRE 载体；和 2) pBCl/hEP0/NE0 载体，作 为额外含有这些调节物的表达载体的优选实例，其中pBCl-hEPO-WPRE载体含有新霉素抗
性基因。通过将WPRE插入至本发明pBCl-hEPO载体内的EP0基因的3，端，然后将新霉素 抗性基因插入pBCl-hEPO-WPRE载体，以产生这些载体。本发明的表达载体pBCl/hEP0/NE0于2007年7月26日保藏于韩国生命工学研 究院生物学资源中心(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology Biology Resource Center)，保藏号为 KCTC 11159BP。必要时，本发明的表达载体可含有其他调节物，例如启动子、增强子选择标记基 因、非翻译区(5' -UTR)、3' -UTR、聚腺苷酸化信号、核糖体结合序列、可被插入至基因组特定位置内的碱基序列、或其位置上的内含子。利用所述表达载体，本发明还提供转基因体细胞。在本发明的一个实施方式中，转基因猪的体细胞于2007年7月26日保藏于韩国 生命工学研究院生物学资源中心，保藏号为KCTC 11160BP。在另一个实施方式中，本发明提供通过将使用所述表达载体产生的转基因体细胞 的核移植至去核卵而收集的受精卵。本发明还提供使用所述表达载体的转基因动物。可使用本发明的表达载体转化哺乳动物(例如猪、小鼠、牛、山羊、绵羊、马和狗)。使用本发明的表达载体产生转基因动物的方法基于常规的方法。例如，如果打算将小鼠用作转基因动物，则按照如下方法产生这样的动物自健康小鼠收集受精卵，将本发明的表达载体弓|入该受精卵。然后，使用输精管结 扎小鼠获得假孕小鼠，并将所述受精卵植入作为代孕母鼠的假孕小鼠的输卵管。然后从代 孕母鼠的后代中筛选转基因动物。如果打算使用猪做转基因动物，收集健康母猪的卵泡卵母细胞并培养于体外成熟 化培养基中。将本发明的表达载体插入所收集并培养的供者体细胞，选择插入了载体的体 细胞进行培养。从体外成熟化的卵细胞中取出核并以供者细胞填补该空间，随后以电融合 方式将供者细胞与卵细胞的细胞质融合，完成核移植用于体外培养。将分裂的受精卵植入 超排卵诱导的受孕猪后，自转基因小猪选择后代。随后，从转基因猪收集合适量的乳以分离和纯化靶蛋白，用于产生有用的蛋白 质(A. Gokana，J. J. Winchenn, A. Ben-Ghanem，A. Ahaded，J. P. Cartron，P. Lambin (1997) Chromatographic separation of recombinant humanerythropoietin isoforms,Journal of chromatography，791，109—118)。在另一个实施方式中，本发明提供hEPO的生产方法，其包括分离和纯化表达于转 基因动物的乳中的EP0的方法。可采用常规的方法来分离和纯化hEPO，包括过滤法或层析法。本发明的转基因动物与常规方法相比可以高得多的浓度表达乳腺特异性EP0。具 体地，这些动物在哺乳期间在腺泡细胞内表达靶蛋白。例如，通过本发明的表达载体pBCl/hEP0/NE0产生的转基因小鼠显示出 200，000-400，000IU/mL的高EP0表达水平。尽管由于胚胎早期死亡导致不容易表达EP0， 但本发明的转基因动物的EP0的表达水平可达到使用现有的乳腺特异性启动子的转基因 动物的乳中EP0的表达水平1000倍以上。此外，本发明的转基因动物产生的EP0与商品化的同类蛋白质相比显示出更好的 稳定性和更优越的生理学活性。例如，以本发明的表达载体pBCl/hEP0/NE0转化的小鼠所产生的EP0含有大量唾 液酸，并通过作用于红细胞前体而显示出更优越的蛋白质活性。此外，施用本发明的转基因动物产生的EP0可提高血液中血小板、红细胞、血红蛋 白和血细胞比容等的水平。因此，本发明的表达EP0的载体和转基因动物可有效用于产生与现有EP0相比显 示出更优越生理学活性的EP0。
图1显示了本发明的pBCl/hEPO/NEO表达载体的结构。图2显示了本发明的pBCl/hEPO/NEO表达载体的结构。图3显示的PCR结果证实了图2的pBCl/hEPO/NEO表达载体的结构元件。图4显示了参与乳腺、肝脏和CH0细胞的糖基化过程的小鼠基因的表达水平。图5显示了以本发明的hEPO表达载体转化的小鼠内的hEPO表达水平。图6显示了本发明的转基因小鼠的乳腺内的hEPO表达水平。图7是本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO的分析结果。图8显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO和肾衰患者血清的二维电泳 凝胶。图9显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO，包括重组人促红细胞生成素 a的寡糖分析结果。图10显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO的体外活性测定。图11显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO的体内活性测定。实施本发明的最佳方式参照以下实施例来描述本发明，这些实施例仅是示例性的，其不能被理解为是对 本发明的范围加以限制。实施例1 产生表达本发明的乳腺特异性hEPO的优化载体根据本发明产生了在乳腺中分泌hEPO的优化载体。1)产生 pBCl-hEPO 载体为了产生本发明的乳腺特异性表达载体，使用具有山羊0酪蛋白启动子的 pBCl(Invitrogen)，在其限制性酶 Xhol 位置克隆 hEPO 基因组 DNA(SEQ ID N0:1)。2)产生 pBCl-hEPO-WPRE 载体为了增加hEPO的表达量，将WPRE(旱獭肝炎病毒转录后调控元件)基因插入 pBCl-hEPO载体。已经发现WPRE作为调控物发挥作用，以确保mRNA更加稳定并最终合成更 多的蛋白质。为了确保EP0和mRNA能够同时转录，将WPRE连接于hEPO的直接后方，然后将调 控物插入pBCl-hEPO载体的Xhol限制性酶切位点。通过使用正向引物5' -ACCAGGTTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC-3' (SEQ ID NO 5) 和反向引物 5' -CTCGAGGAGCCCGAGGCGAAACAGGCG-3‘ (SEQ ID NO :6)从肝炎病毒扩增出 0. 6kb的PCR(聚合酶链反应)产物而获得WPRE，然后将其克隆到pGEM T-easy载体内。使 用限制性酶(SalI，XhoI)切割所述0. 6kb的WPRE以便为插入位点做准备。将以Xhol切割 的pBCl-hEPO连接于预先构建的载体以产生pBCl-hEPO-WPRE载体(23975bp)。3)产生 pBCl/hEPO/NEO 载体为了高效选择含有能够在乳腺特异性0酪蛋白启动子调节下最大化产生hEPO的 载体的细胞，克隆了新霉素抗性基因。新霉素抗性基因可抵抗G418，通过使用正向引物5' -GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCA C-3' (SEQ ID NO :7)和反向引物 5' -CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3 ‘ (SEQ ID NO:8)从pEGFP-Nl载体(Clontech，Catalog#6085-l)扩增出1. 9kb的PCR产物而获得该基因， 然后将其克隆入pGEM T-easy载体。使用限制性酶(NotI，PvuI)切割克隆入T-载体的1. 9kb的新霉素抗性基因，以便 为插入位点做准备。此外，以限制性酶(NotI，PvuI)切割pBCl-hEPO-WPRE载体的氨苄青霉 素抗性基因位点，以便为载体位点做准备。通过连接上述插入片段和载体位点，将WPRE和新霉素抗性基因插入pBCl-hEPO载 体,产生pBCl/hEPO/NEO载体。图1显示了如此获得的本发明的表达载体的结构。最终在乳腺特异性启动子即3 酪蛋白启动子的调节下表达hEPO。通过使用pBCl-5 ‘ +WPRE-R弓丨物对和hEP03+WPRE_R弓丨物对进行PCR获得的3kb 和1. 5kb的PCR产物，本发明人等已证实准确产生了 pBCl/hEP0/NE0载体(图2和3)。本发明的表达载体pBCl/hEP0/NE0于2007年7月26日保藏于韩国生命工学研究 院，保藏号为KCTC 11159BP。随着WPRE调控物的引入，可以使用表达载体pBCl/hEP0/NE0以使得EP0的表达水 平最大化。此外，在建立动物细胞系的过程中，新霉素抗性基因可用作高效的选择标记。实施例2 产生表达hEPO的转基因动物并分析所表达的hEPO进行以下实验确认本发明的表达乳腺特异性hEPO的转基因小鼠所表达的hEPO的 生理学活性和稳定性谱。1)参与小鼠乳腺内糖基化的基因的表达谱分析已经发现糖基化作为翻译后修饰的一部分在增强蛋白质功能方面发挥主要作用。 在原核生物(包括大肠杆菌)、酵母、动物细胞和小鼠中发现了不同的糖基化表达谱。经历过与人类类似的演化阶段的实验动物所产生的糖基化程度被认为与人体内 的情况类似。因此，在体内研究中鉴定了小鼠的乳腺和肝脏以及CH0细胞系中参与重组 hEPO糖基化的糖基转移酶的表达(图4)，其中CH0细胞系已经被有效用于产生EP0。首先，在分离到来自小鼠体内的乳腺、肝脏和CH0细胞系的总RNA之后，使用3种 糖基转移酶(GnT-V、GnT-III和Fuc_TIV)的引物对(表1)进行RT_PCR(反转录酶-聚合 酶链反应)。表 1 如图4所示，测试结果表明，相比于肝脏和CH0细胞系，两种糖基转移酶(GnT-III 和GnT-V)在乳腺中高度表达。在Fuc-T中也检测到相同的趋势，其在乳腺中的表达高于CH0细胞系。这证明，就 生理学活性而言，来自乳腺的重组hEPO优于现有的CH0细胞系的EP0产物。2)产生转基因小鼠在实施例1所构建的乳腺特异性0酪蛋白启动子的调节下，使用23kb的表达 EP0(Macrogen Co.韩国)的pBCl/hEPO/NEO表达载体(图1)通过显微注射的方式产生了
转基因小鼠。我们使用了转基因小鼠BDF1 (C587BL/6DBA)。将pBCl/hEPO/NEO注射至738个受 精卵后，700个卵被转移至30只代孕母鼠内。通过PCR和基因组Southern印迹法(表2和 图5B)从数周后出生的总共85只存活小鼠中鉴定到9只转基因小鼠。使用正向引物(5‘ -CTCCTTGGCAGAAGGAAGCC-3 ‘ ；SEQ ID N0:19)和反向引物 (5' -CAGCCATGGAAAGGACGTCA-3 ‘ ；SEQ ID NO :20)进行 PCR 来核实 TG。所得 PCR 产物大 小估计为600bp。使用hEPO基因组DNA作为探针(包括SEQ ID NO 1在内的整个2. 3kb基因)进 行Southern印迹。图5B显示了 PCR和Southern印迹的结果，包括鉴定到EP0基因的品系6和品系 37，它们是表达乳腺特异性EP0的转基因小鼠内的两个代表性品系。基于图5B的结果，注 意到10至30个拷贝的EP0基因被插入至染色体内，并通过生殖细胞而遗传至下一代中。表 2 3)鉴定转基因小鼠内的乳腺特异性EP0我们鉴定了本发明的转基因小鼠是否能够表达乳腺特异性EP0基因。从品系6和37的转基因小鼠的各种组织如乳腺、脑、肾脏、心脏、脾脏、肝脏、子宫 和肺提取RNA。然后采用本领域已知的常规方法进行RT-PCR和Northern印迹分析。为了检测EPO cDNA，使用hEPO-特异性正向引物(SEQ ID NO :21)和hEPO-特异 性反向引物(SEQ ID NO 22)进行RT-PCR反应。5' -GTAGAAGTCTGGCAGGGCCT-3‘ (SEQ ID NO 21)5' -TCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3‘ (SEQ ID NO 22)使用EP0全基因组DNA作为2. 3kb的探针进行Northern印迹分析，该探针与 Southern印迹分析所使用的探针相同。如图5C所示，RT-PCR的结果显示在乳腺观察到更高的EP0水平，而肾脏的水平极 低。如图5D所示，Northern印迹分析发现，EP0基因特异性表达于乳腺，而在其他任何组织 中均未观察到(在该图中，B 脑，H 心脏，S 脾脏，L 肝脏，U 子宫和Lu 肺)。为了检测EP0蛋白的表达和表达的细胞，使用抗人抗体(AB-286_NA，R&D system) 作为EP0抗体在转基因动物的各种组织上进行免疫组化(图6)。在妊娠第16天的对照小 鼠的乳腺中没有检测到EP0水平，如图6A所示。与此不同的是，在妊娠第16天的转基因小 鼠(图6B)和分娩后5天的转基因小鼠(图6C)的乳腺腺泡细胞中能够检测到EP0水平。 在分娩后16天(图6D)，在退化的乳腺腺泡细胞中没有检测到EP0的表达水平。如图6所示，在本发明的hEPO转基因小鼠哺乳期乳腺腺泡细胞内特异性检测到了 EP0水平。4) EP0水平和稳定性谱的分析为了研究转基因小鼠乳腺的乳中所含的EP0水平，使用抗人抗体(AB-286-NA，R&D system)作为EP0抗体进行常规的免疫印迹方法，如图7所示。图7A是在转基因小鼠的乳上的免疫印迹的结果；泳道1和2代表阳性对照的 GST-标记的EP0抗体(5ng和10ng)；泳道3代表对照小鼠组的乳；泳道4和5分别代表品 系6和37的各转基因小鼠的乳内的EP0水平。如图7A所示，我们在本发明的转基因小鼠的乳中鉴定到了一种分子量为34KDa的 蛋白质，占总蛋白的0.7至1.4%。为了确定来自转基因小鼠的乳的EP0的糖基化模式，使用N-糖苷酶F或N-糖苷 酶-F和0-糖苷酶进行免疫印迹。如图7B所示，泳道1是来自乳的EP0 ；泳道2是以N-糖苷酶-F消化后的EP0片 段；而泳道3是以N-糖苷酶-F和0-糖苷酶消化后的EP0片段。图7B显示，3个N-糖基化位点和0-糖基化位点被消化后，最终鉴定EP0的分子量 为18KDa，证实了正确的后修饰。
为了确定hEPO转基因小鼠的乳内的EP0水平，使用ELISA试剂盒(人促红细胞生 成素ELISA，#01630, Stem Cell Technology)进行定量测定。在1至5天的哺乳期内，EP0 水平的范围在200，000至400，000IU/mL(表3)。表3 定量分析转基因小鼠乳中的EP0 为了确定EP0的稳定性，使用在转基因小鼠的乳内检测到的hEPO和肾衰患者血液 样品进行二维分析。根据二维分析(图8)发现，与血液样品中的EP0相比，来自转基因小鼠的EP0的 电荷和大小更具异质性。通常，由于蛋白质末端含有许多糖链例如唾液酸，PI值倾向于降低。如图8所示，与对照和肾衰患者的血清相比，从品系6和37的转基因小鼠的乳产 生的重组hEPO因其富含唾液酸的结构而更加偏酸性。相反，从对照和肾衰患者收集到的血 液是非唾液酸化的(asialic)。糖链例如唾液酸可影响蛋白质的结构和功能。唾液酸化的EP0可作用于红细胞前体细胞因而具有生理学活性，而非唾液酸化 的EP0(asialic EP0)通过结合于肝脏受体而分泌至尿液中(ParekhRB，et al. (1989) N-glycosylation and in vitro enzymatic activity of humanrecombinant tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovaryeelIs and a murine cell line. Biochemistry 28:7670-7679 ；Tam RC,et al. (1991)Comparisons of human,rat and mouse erythropoietins by isoelectric focusing :differences between serum and urinary erythropoietins. Br J Haematol 79:504—511)。因此，预期本发明的表达EP0的转基因小鼠产生的hEPO通过作用于红细胞前体而 表现出生理学活性。5)从转基因小鼠的乳中分离hEPO将3mL收集自本发明的转基因小鼠的乳悬浮于20mL的10mM Tris缓冲液(pH 6. 8)中，并以滤膜过滤。使用1，OOOrnL的10mM Tris缓冲液(pH6. 8)对滤过物4°C过夜透 析，两次。将透析的悬液冷却并4，OOOrpm离心30分钟以除去沉淀。通过pM-100滤膜(Amicon)过滤大约20mL上清液，然后将所得过滤物悬浮于 300mL的10mM Tris缓冲液(pH 6. 8)。以3mL/min的流速将所述悬液注射至以10mM Tris缓冲液(PH 6. 8)预平衡的DEAE葡聚糖凝胶柱(20 X 15cm，床体积40)。以500mL的10mM Tris缓冲液(pH 6. 8)洗涤柱，以便使用10mM Tris缓冲液(含0至325mM NaCl)进行梯度 洗脱(各分段体积3mL，流速21mL/h)。以pM-10膜过滤所有如此收集的含EPO的洗脱级份，以含有0. 15MNaCl的10mM Tris缓冲液(pH 7. 2)洗涤3次，并浓缩至3mL。将溶液注射至以10mM Tris缓冲液(pH 7. 2)预平衡的S印hadex G-100柱(2F x 100cm)，以24mL/h的流速溶解，级份体积为3mL。回收所有含EPO的洗脱级份，pM-10膜过滤，并以含0. 15M NaCl的10mM Tris缓 冲液(pH 7.5)稀释。对稀释产物进行如下免疫纯化。①为了自稀释产物分离IgG，收集腹水液，使用G蛋白琼脂糖亲和系统进行纯化。将腹水液稀释于5 倍组合缓冲液(0. 1M NaH2P04，0. 15M NaCl, 5mMEDTA, pH 7. 0)， 使之缓慢流入A蛋白琼脂糖柱并以相同缓冲液洗涤。洗涤后的腹水液稀释于洗脱缓冲液 (0. 1M甘氨酸/HC1，0.01%叠氮化钠，pH2.7)。洗脱液被洗脱至含有等量中性缓冲液(1M 扑化，0.01%叠氮化钠411 9)的管中。进行12%SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶电泳)并以考马斯亮蓝(CBB)鉴定。该抗体溶液在3L PBS溶液中透析6次共3天，随 后定量备用O②制备免疫亲和柱将50mg如此纯化的IgG在碳酸氢盐缓冲液(0. 1M NaHC03，0. 5MNaCl, pH 8. 3)中 透析过夜，4°C。以ImM盐酸洗涤经CNBr活化的3gS印harose 4B (Pharmacia)数次。将大 约12mL的凝胶倒入柱中，以碳酸氢盐缓冲液洗涤以达到平衡。任何将IgG加入柱中并缓慢 搅拌过夜。所得溶液中加入1M乙醇胺溶液(pH 8. 8)，室温下搅拌3小时，并中和未反应的 官能团。最后，以30mL碳酸缓冲液洗涤溶液3次，随后以30mL的0. 1M盐酸甘氨酸溶液(pH 2. 5)洗涤一次。向洗涤溶液中加入含有0. 2% NaN3的PBS缓冲液，4°C储存备用。③免疫纯化以含有0. 15M NaCl (pH 7. 5)的10mM Tris缓冲液预处理柱以达到平衡。轻柔搅动 20mL的稀释样品过夜，4°C，并吸附至凝胶。将凝胶倒入柱内，然后也以缓冲液预处理柱，并 以0. 1M醋酸盐缓冲液(pH 4. 5)洗涤，流速为60mL/h。以30mL 0. 1M盐酸甘氨酸溶液(pH 2.5)洗脱出结合于凝胶的EPO。立即将1M Tris溶液(pH 9)加入至洗脱的级份内并在短 时间内滴定至pH 7. 5。此后，以pM-10膜(Amicon)过滤洗脱级份，得到hEPO。6)促红细胞生成素的寡糖的结构分析通过HPLC分析在本发明的转基因小鼠的乳内鉴定的hEPO的寡糖结构，使用牛血 清胎球蛋白(Glycosciences)和商品化的重组人促红细胞生成素a (LG Life Sciences) 作为糖蛋白对照。如图9所示，A是牛血清胎球蛋白，B是来自转基因小鼠的hEPO，C是重组人促红 细胞生成素a。证实了来自转基因小鼠的乳中的EP0与来自CH0细胞的重组人促红细胞生 成素a具有相似的单、二和三酸性寡糖，但前者比后者具有更多的四酸性寡糖。这证实，当EP0在转基因小鼠内通过糖基化酶表达时，通常发生翻译后修饰，这提 示乳腺产生的EP0可被容易地用作药用产物(图4)。表4:人血清内和转基因小鼠乳内的EP0的N-连接电荷分析(N-linkedcharge analysis)
7)转基因小鼠的乳内的hEPO活性7-A)转基因小鼠的乳内的体外hEPO活性进行以下实验来研究本发明的转基因小鼠的乳中的体外hEPO活性。已经发现EP0通过结合EP0受体(EP0R)而活化转录因子STAT5。为此，我们构建 了含有STAT5的BCL-XL荧光素酶表达载体以便以稳定方式在MCF-7细胞系(人乳腺癌细 胞系)中表达EP0R。以含有转基因小鼠的rhEPO的乳蛋白质(Ong，10ng，lOOng，1 ii g)处理MCF-7细胞 (2X 105/35mm 板)16 小时。作为阴性对照，以lug普通乳蛋白质处理MCF-7细胞(2X 105/35mm板)。以重组 人促红细胞生成素a (10IU,100IU)处理的细胞作为阳性对照。16小时后，使用微孔板光度 计(Perkin Elmer)测定荧光素酶活性，如图10所示。从图10可看出，当以不同浓度的来自转基因小鼠的乳的EP0处理MCF-7细胞时， 观察到荧光素酶活性呈剂量依赖方式的升高。由于以重组人促红细胞生成素a处理也观察到这种荧光素酶活性升高，我们发 现来自本发明的转基因小鼠的乳中的hEPO的体外活性更佳。7-B)转基因小鼠乳内的EP0的体内生理学活性为了研究本发明的转基因小鼠乳内的EP0的体内生理学活性，将来自转基因小鼠 的乳的EP0注射于对照小鼠(200ng/kg，一次静脉注射)，在不同时间间隔收集各血液样品。 图11给出了血液测试结果。如图11所示，当将来自本发明的转基因动物的乳的EP0加给对照小鼠时，观察到 血小板、RBC、血红蛋白和血细胞比容呈时间依赖方式升高。由于以重组人促红细胞生成素a处理也观察到这种生理学活性升高，我们发现 来自本发明的转基因小鼠的乳中的EP0的体内活性更佳。实施例3 使用体细胞通过引入 本发明的EP0表达载体而产生转基因猪使用体细胞通过引入实施例1的本发明的表达载体pBCl/hEP0/NE0而产生了转基 因猪。A)制备培养基
使用NCSU 23培养基进行卵泡卵的体外成熟化。将1L来自Baxter (Baxter Healthcare Co.，U. S. A.)的水用 0. 2 u m 滤膜(Gelman Sci.，U. S. A.)过滤，将 pH 调整至 7. 2-7. 3，然后将过滤物注入50mL的组织培养瓶(Falcon, U. S. A.)，每瓶45mL, 4°C储存，可
用两周。使用含有10%猪卵泡液、0. lmg/mL 半胱氨酸、0. 01iig/mL EGFUOIU/mL eCG 和 10IU/mL hCG的NCSU 23制备体外成熟化培养基。使用含有0. 4% BSA的NCSU 23制备体 外培养基。自卵泡(直径2-7mm)收集猪卵泡液，1，900 X g离心3次，经0. 2 y m滤膜过滤后储 存于-20°C备用。B)收集猪卵泡卵母细胞本实施例使用的是青春期前小母猪的卵巢，小猪在屠宰场被屠宰后立即就地取出 卵巢，转移至含有生理盐水(30-35°C )的保温瓶中，其中补充了青霉素G(100单位/mL)和 链霉素(100 u g/nL)，并在3-4小时内送至实验室。获取不成熟的卵泡卵母细胞之前先将卵 巢周围的脂肪和结缔组织去除并以生理盐水洗涤3-4次。使用带有18-G针头的20mL注射 器从卵丘-卵母细胞复合体(直径2-7mm)吸取卵母细胞。收集卵母细胞所使用的培养基是TALP-HEPES，含有0. lmg/mL PVA (Prather, R. S. , et al. 1995. In vitro development of embryos from sinclairminiature pigs :A preliminary report. Theriogenology,43 :1001_1007)o将吸出的猪卵泡液静置5-10分钟。用5mL移液器吸取沉淀的溶液底部，置于60-mm 培养皿内。在40X倍倒置显微镜(Olympus Co.，Japan)下收集卵母细胞并以体外成熟化 NCSU 23洗涤4-5次进行选择。仅选择具有至少两层卵母细胞和细胞质非常均勻的卵母细 胞用于以下实施例。C)猪卵泡卵母细胞的体外成熟将用于体外成熟化的500 u L猪卵母细胞置于4孔皿(Nunc，Denmark)中培养18 小时，以诱导达到平衡。将100-150个具有至少两层卵母细胞和细胞质非常均勻的卵母细胞置于补充了 激素的体外成熟化培养基中，在湿化(98-99%)的含有5%0)2的0)2孵箱内39°C培养 20-22小时。将这些卵母细胞在无激素培养基内培养20-22小时。卵母细胞共培养40-44 小时。D)构建用于引入并靶向表达hEPO的基因的载体基于实施例1所述的方法构建表达hEPO的pBCl/hEP0/NE0表达载体。E)制备体细胞供者细胞和建立细胞系收集妊娠期30天的猪胎儿用于本实验。除了头、肢体和肠道，将所有其他组织切片并在补充了 0.05%胰蛋白酶(Gibco， USA)和EDTA(Sigma，USA)的D-PBS内放置3分钟。将这些碎片离心以去除胰蛋白酶和EDTA。将分离的细胞置于DMEM内，其中补充了 10%胎牛血清(FBS)，然后接种于25cm3培 养瓶(Falcon，USA)内，培养于C02孵箱内。培养12小时后，去除没有沉积在底部的组织切片。给培养物更换新鲜的DMEM+10% FBS 并培养 3-5 天。供者细胞在培养瓶内生长超过80%时以胰蛋白酶(0.05% )和EDTA处理使之漂 浮，然后将细胞按照1/3-1/4传代10次。将传代培养的供者细胞冷冻在补充了 10% DMS0的DMEM中储存。进行核转移时， 将供者细胞在38-39°C解冻，去除冻存剂。将细胞在补充了 10% FBS的DMEM内传代一次。 培养细胞2-3天达到汇合，收集单层细胞。用于本实验的供者细胞处于细胞分裂周期的GO 或G1期。F)将外来基因引入津立的体细胞将实施例1制备的并储存于-20°C的pBCl/hEPO/NEO DNA解冻。还使用了冷冻的 Effectene转染试剂(Qiagen)。将这两种材料置于各管内，其中的DNA水平为2 y g/mL，同 时避免它们混合。将Qiagen试剂盒内的8 u L增强物缓慢加入至各管。加入缓冲液EC以确保总量(DNA+增强物+缓冲液EC)为150 y L，震荡1秒，并在 室温放置2-5分钟。DNA-增强物复合物内各加入25 ii L的Effectene，随后移液至室温放 置5-10分钟。此外，以D-PBS洗涤E节所制备的并在培养皿中生长至50% -80%汇合的成纤维 细胞2或3次，10分钟，铺板，每板4mL无FBS的DMEM，置于孵箱内。10分钟后每管加入lmL无FBS的DMEM，用加样器充分混合。将细胞置于含有4mL 成纤维细胞和DMEM的培养皿中，转染后将细胞再次置于孵箱内12-18小时。此后，以D-PBS 洗涤细胞，然后更换为含有10% FBS的DMEM。G)选择引入EP0的体细胞系EP0、传代培养和冷冻保存从上述F)段的转染日期后72小时，使用600-800 u g/mL的G418对新霉素抗性细 胞进行为期约2周的选择。所选的成纤维细胞沉淀于底部，用于传代培养。更具体地，从待分离的细胞的瓶中去除培养基。向瓶中加入1. 5mL的0. 25%胰蛋 白酶+EDTA，然后置于孵箱内大约3-5分钟。当显微镜下大约70%的细胞分开时，将细胞从 孵箱内取出，并使用移液器分离。将细胞转移至含有10mL D-PBS的15mL管中，1500rpm离 心3分钟。去除上清液后，向沉淀中加入约3mL的10% FBS+DMEM+G418以充分分散。将分 散的沉淀加入至瓶中，置于孵箱内培养。为了冻存细胞，将细胞离心获得沉淀。向沉淀加入lmL DMS0并充分分散。将沉淀 置于冻存管内，在-70°C低温冰箱内存放24小时，然后储存于_196°C液氮罐内。含有本发明的pBCl/hEPO/NEO的猪体细胞于2007年7月26日保藏于韩国生命工 学研究院的生物学资源中心，保藏号为KCTC11160BP。H)用于核转移的冷冻体细胞供者细胞的处理1.解冻将细胞从冰箱内取出，在37°C水浴内解冻。解冻的细胞转移至含有10mL D-PBS的15mL的管中，1500rpm离心3分钟。去除上清液后，向沉淀内加入3mL的10% FBS+DMEM+G418，并充分分散。将分散的沉淀加入至瓶中，置于孵箱内培养。2.制备供者核通常在4孔板内处理供者细胞。为了分离细胞，去除培养基，然后 以200 y L的胰蛋白酶+EDTA在培养皿中铺板，然后置于孵箱内大约3_5分钟。当显微镜下 大约70%的细胞分开时，将细胞从孵箱内取出，并使用200 yL移液器分离。将细胞置于含 有约3mL用于供者的培养基的培养皿中以便分散。将细胞置于孵箱内备用。
I)核转移为了核转移，使用毛细管(直径1mm Aarishige，Japan)制备了各种用于保持、去 核和注射的加样器。保持移液器的外径为150-180 ym，而去核和注射移液器的外径被调整 至30-40 ym。所制备的移液器以PVP涂层处理备用。将体外成熟的受者细胞质置于补充了 0. 透明质酸酶(Sigma，USA)的D-PBS中 以便去除卵丘细胞，并以PVA-TALP-HEPES洗涤3_4次。仅在补充了 . 05M蔗糖(Sigma，USA)和0. 4% BSA的培养基中选择出那些具有优 质细胞质和可见第一极体的卵母细胞。通过从含有0. 4% BSA的NCSU-23培养基的小滴吸出30%的细胞质而实现去核， 所述NCSU-23培养基还含有7. 5 ii g/mL细胞松弛素B (Sigma, USA)和0. 05M蔗糖。将供者细胞加入至去核的卵母细胞的无细胞质空间内以使得细胞质可与卵母细 胞附着，所述供者细胞的细胞周期已经被诱导至GO或G1期。以IVC培养基(含有0.4% BSA的NCSU-23)处理含有供者细胞的卵母细胞，然后进行电融合。.1)重构胚胎的融合和卵母细胞活化使用电细胞操纵器(BTX，USA)进行克隆的胚胎和细胞质的供者细胞之间的融合。 将重构的胚胎在活化培养基中预孵育，所述活化培养基含有0. 28M甘露醇溶液(Sigma， USA)，并补充了 0. ImM CaCl2 (Sigma, USA)和 0. ImM MgCl2 (Sigma, USA)。在培养基中平衡 2-3分钟。使用电细胞操纵器将电刺激输送至具有两根平行导线电极的小室。重构的卵母细 胞和细胞质分别连接尖头正极(+)和负极(_)。将卵母细胞暴露于150V下的电脉冲，随后 为50 y sec的两次脉冲。注入体细胞后，将卵母细胞活化并随后在含有细胞松弛素B的培 养基中培养4小时或者是在含有0. 4% BSA的培养基中体外培养。K)处理受者猪为了移植克隆的胚胎，给怀胎30-40天的受者肌肉施用PGF2CI以诱导流产。24小 时后同时给受者施用PGF2 a和PMSG。72小时后给怀胎的母猪肌肉施用hCG以诱导超排卵。 48小时后将克隆的胚胎移植给受者。L)胚胎转移和妊娠诊断为了产生克隆猪，以手术方法将重构的胚胎转移至同步化的养母中。给经过激素 处理同步化的受者从耳静脉施用克他命和甲苯噻嗪以诱导全身麻醉。使用剃刀去除麻醉受 者腹正中线周围的毛。腹正中线消毒后切开大约10-15cm的切口，暴露子宫以确认卵巢表 面或卵母细胞的红体(corpushemorrhagicum)。然后，将克隆的胚胎注入输卵管壶腹。为了 确认克隆的胚胎在一些受者体内的发育，在胚胎转移后7天手术切开腹部以评估胚胎发育 情况。还在胚胎转移27-30天后采用超声波扫描来核实妊娠。进行了 PCR和基因组Southern 印迹以确认表达乳腺特异性EP0的转基因小猪。有益效果本发明的表达hEPO的转基因动物与常规方法相比以高得多的浓度表达乳腺特异 性 EP0。此外，本发明的转基因动物产生的hEPO与商品化的同类蛋白质相比具有更好的 稳定性和优越的生理学活性。
此外，施用本发明的转基因动物产生的hEPO升高了血液中的血小板、红细胞、血 红蛋白和血细胞比容。因此，本发明的表达hEPO的载体和转基因动物可有效用于产生与现有EP0相比具 有优越生理学活性的EP0。[微生物保藏证明]国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际表格原始保藏的收据按照细则7.1出具保藏人CH0_A制药株式会社Acetechno Tower 1层55-7, Moonrae-dong 3-ga, Yeongdeungpo-ku, H"/K 150-090韩国 表格BP/4(KCTC 表 I7) 单页国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际表格原始保藏的收据按照细则7.1出具保藏人CH0_A制药株式会社Acetechno Tower 1层55-7, Moonrae-dong 3-ga, Yeongdeungpo-ku,首尔 150-090 韩国 表格BP/4(KCTC 表 I7) 单页
权利要求
pBC1-hEPO-WPRE载体，其包含编码作为乳腺特异性启动子的β酪蛋白启动子的DNA序列、位于所述启动子3′端的编码人促红细胞生成素(hEPO)的DNA序列、和位于所述hEPO基因3′端的编码旱獭肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)的DNA序列。
2.权利要求1的载体，其中所述编码人hEPO的DNA序列是SEQIDNO :1。
3.权利要求1的载体，其中所述编码0酪蛋白启动子的DNA序列是SEQID NO :2。
4.权利要求1的载体，其中所述编码WPRE的DNA序列是SEQIDN0 :3。
5.pBCl/hEP0/NE0载体，其在权利要求1的载体中还包含作为选择标记的新霉素抗性 基因。
6.权利要求5的载体，其中所述编码新霉素抗性基因的DNA序列是SEQID NO :4。
7.权利要求6的载体，其保藏号为KCTC11159BP。
8.非人类动物的体细胞，其通过引入权利要求1-7任一项的表达载体而被转化。
9.权利要求8的猪体细胞，其携带pBCl/hEPO/NEO，且其保藏号为KCTC11160BP。
10.胚胎，其通过将通过引入权利要求1-7任一项的表达载体而转化的非人类动物体 细胞的核转移至非人类动物的去核卵内而产生。
11.转基因非人类动物，其通过引入权利要求1-7任一项的表达载体而被转化。
12.权利要求11的转基因动物，其中所述动物选自猪、小鼠、牛、山羊、绵羊、马和狗。
13.产生人促红细胞生成素(hEPO)的方法，其包括从权利要求11的转基因动物所产生 的乳中分离并纯化所表达的EP0。
14.权利要求13的方法，其中所述动物选自猪、小鼠、牛、山羊、绵羊、马和狗。
全文摘要
本发明提供乳腺特异性人促红细胞生成素(hEPO)表达载体、转基因动物和使用它们产生人促红细胞生成素的方法。本发明的表达hEPO的转基因动物与常规方法相比以高得多的浓度表达乳腺特异性EPO。本发明的转基因动物产生的hEPO与商品化的同类蛋白质相比显示出更好的稳定性和更优越的生理学活性。因此，本发明的表达hEPO的转基因动物可有效地用于产生比现有EPO显示出更优越生理学活性的EPO。
文档编号C12N15/09GK101855352SQ200780100189
公开日2010年10月6日 申请日期2007年8月8日 优先权日2007年8月8日
发明者金珍会 申请人:Cho-A制药株式会社