专利名称：：α-雄烷醇的制备及含量检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种甾体化合物的制备方法，尤其涉及a-雄烷醇的制备方法，本方面还涉及一种检测a-雄烷醇含量的质量控制方法，属于微生物发酵领域。
背景技术：
：a-雄烷醇是一种甾体化合物(又名5a-androst-16-en-3a-ol，3a-hydroxy-5a-androst-16-ene，16-[5a]androsten-3a-ol,androstenol)，未阉的公猪唾液、睾丸、肝中均含有该化合物，在人的血浆、腋汗及尿液中也有发现。a-雄烷醇的结构式力o下所示a-雄烷醇具有调节女性月经周期的功能，虽然该化合物是否具有引起女性性激动的性激素类作用目前还不能确定，但已有企业将a-雄烷醇开发成为一种商品——费洛蒙(pheromone),价值不菲。最近研究表明，a-雄烷醇还具有调节脑应激性的作用，具有抗失眠、抗抑郁、抗焦虑、抗癫痫等功能(RafalM.Kaminski,HerbertMarini，PavelI.Ortinski，StefanoVicini,MichaelA.Rogawski.ThePheromoneAndrostenol(5a-Androst-16-en-3a-ol)IsaNeurosteroidPositiveModulatorofGABAAReceptors.JournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics2006,317:694-703)。然而，目前并没有适合a-雄烷醇大规模工业化生产的方法，主要以化学合成方法少量制备该物质。化学合成法存在较大弊端，一是规模小、产量低，二是化学残留难以除去，三是生产成本高，这些因素导致了a-雄烷醇的价格高昂。因此寻找一种适合大规模工业化生产a-雄烷醇的技术和方法，成为a-雄烷醇研发的重中之重。迄今为止，除了化学合成法，国内外未见有其他生产a-雄烷醇方法的报道。块菌(tru迅e)在生物分类学上属于子嚢菌亚门(Ascomycotina)、块菌目(Tuberales)、块菌科(Tuberaceae)、块菌属(Tuber)。常见的块菌有黑孢块菌(r"6er柳e/awos/7on/w)、夏i夹菌(7i/Z)eraeW/vMw)、白i夹菌(7i^erwag"a加m)、印度》夹菌(r"Z)er/"Wcwm)和中国块菌(r"terW船"w)。1981年，曾有人从黑孢块菌的子实体中分离得到a-》,烷醇(R.Claus，H.O.Hoppen,H.Karg,Thesecretoftruffles:AsteroidalpheromoneExperimentia1981，37:1178),l旦之后一直未见a-雄烷醇与块菌的相关才艮道。目前，市场上的块菌主要来源于野生及半人工模拟栽培。野生的块菌资源相当有限，而且地域局限性和生长环境要求苛刻。半人工模拟栽培块菌，从接种到形成子实体需要7-9年，而且人工栽培过程的质量无法控制。物以稀为贵，素有"黑色钻石"之称的黑孢块菌在国际市场上价格高达1000多美元每公斤。综上所述，开发研究出一种廉价易行的生产a-雄烷醇的方法具有广阔的应用前景。
发明内容本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术所存在的不足，提供一种新的a-雄烷醇的制备方法，该方法切实可行、操作简单、周期短、质量可控、无毒性、成本低、易规模化工业生产，能够很好地解决目前化学合成a-雄烷醇产生的有机残留、规模小、产量低、成本高等一系列问题。本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种制备a-雄烷醇的方法，包括将块菌属(Tuber)菌林进行液体发酵，得到含有a-雄烷醇的发酵液或菌丝体。所述的块菌属(Tuber)优选为中国块菌(r"ters/"e"w)、印度块菌(rWer〖"Awm)、黑孑包》夹菌(Tl/6erme/(3wa9porwm)、白i夹菌(7!/6ermagwa化w)或夏》夹菌(r"Zerae^/vwm);这些块菌属菌抹都可从商业途径购买得到。所述的液体发酵依次包括以下步骤斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、液体发酵；其中所述的液体发酵包括摇瓶或生物反应器规模的发酵过程。上述各个步骤中所用到的培养基和培养条件可以是块菌属(Tuber)菌抹在进行液体发酵时所常用的培养基和培养条件。优选的，所述的培养基和培养条件分别如下(1)斜面菌种培养培养基葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；培养条件培养温度为15-40。C。(2)—级液体种子培养培养基葡萄糖10-500克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾l-40克/升、pH值2-9;培养条件培养温度15-40。C，摇床转速为50-300转/分钟。(3)二级液体种子培养培养基同一级液体种子培养基；培养条件同一级液体种子培养。(4)液体发酵培养基蔗糖10-1000克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏1-100克/升，硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氬钾l-40克/升、pH值2-9;摇瓶中的发酵条件发酵温度15-4(TC，摇床转速为50-300转/分钟；生物反应器中的发酵条件发酵温度为15-40。C、pH值2-9、搅拌转速为50-1500转/分钟、通气速率为0.01-100升/分钟。为了使微生物发酵朝着更有利于a-雄烷醇生物合成的方向发展，本发明以黑孢块菌作为上述各个菌抹的代表，对其各个阶段的培养基和培养条件进行了优化，最终发现，当各个培养阶段分别采用以下培养基和培养条件时，相比于其它的培养基和培养条件，发酵产物中a-雄烷醇的含量有了明显的提高(1)斜面菌种培养培养基葡萄糖20克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；培养条件培养温度为30。C。(2)—级、二级液体种子培养培养基葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁l克/升、磷酸二氢钾2克/升、pH值7;培养条件培养温度30。C,摇床转速为150转/分钟。(3)液体发酵培养基蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升，硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升；pH值为7;摇瓶中的发酵条件发酵温度30。C,摇床转速为150转/分钟。生物反应器中的发酵条件发酵温度30。C，搅拌转速为600-800转/分钟，通气速率为1.0-50升/分钟。块菌作为一种高等真菌具有可培养性，通过控制培养条件，块菌的菌丝体能够在营养成份丰富的培养基迅速生长。因此，采用发酵的方法，利用廉价的培养基在摇瓶和生物反应器中培养块菌菌丝体，具有周期短、成本低、操作简单、易培养、能够按照需求人为的控制原料供应量等众多优势。本发明利用微生物代谢工程的原理，可以有针对性地对块菌菌丝体的生长进行代谢调控，使发酵朝着有利于ot-雄烷醇生成的方向发展。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种从上述发酵液或菌丝体中检测a-雄烷醇含量的方法。本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的一种从上述发酵液或菌丝体中检测a-雄烷醇含量的方法，包括(1)收集样品将发酵产物离心，分别收集上清液和菌丝体沉淀；(2)制备待测样品(A)发酵液待测样品的制备将发酵上清液通过固相萃取小柱，用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，浓缩，得发酵液4寺测样品；(B)菌丝体待测样品的制备将菌丝体蒸馏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品；(3)检测待测样品使用气相色语-氢火焰离子检测器或离子阱/四极杆质语检测器检测，色谱柱为极性或非极性毛细管柱或填充柱；采用程序升温；通过对比相同色谱条件下a-雄烷醇对照品出峰时间和离子碎片信息对样品中a-雄烷醇进行定性，通过内标法或外标法对待测样品中a-雄烷醇的含量进行定量。优选的，步骤(l)中将发酵产物在8000-15000转/分钟的条件下离心；更优选为在10000转/分钟的转速下离心。步骤(2)中所述的发酵液待测样品优选按照以下步骤制备依次用乙醇、去离子水对ds固相萃取小柱进行预处理；将发酵上清液通过ds固相萃取小柱；分别以水和60%丙酮水溶液进行淋洗，再以丙酮进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，作为发酵液4寺测样品；步骤(2)中所述的菌丝体待测样品优选按照以下步骤制备将菌丝体进行蒸馏(为了达到更好的提取效果，优选采用图l所示的装置进行蒸馏)，控制温度在80-150摄氏度；用乙酸乙酯富集蒸镏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品；步骤(3)中所述的检测优选按照以下条件进行汽化室温度在160。C以上，程序升温的初温在80。C以上，末温在220。C以上，升温时间不超过l小时；进样方式为分流或不分流方式，体积l-20微升，流速l-5毫升/分钟；氬火焰离子检测器的温度在250摄氏度以上；质谱所采用的电离方式为EI电离，扫描离子质荷比范围为50-650，a-力,烷醇特4正石卒片离子质荷比为241、259。按照上述方法对本发明所制备的块菌发酵液或菌丝体中的a-雄烷醇含量进行检测，其结果为每升块菌发酵液中a-雄烷醇含量达到0.1-50毫克；块菌菌丝体(干重计)中a-i,烷醇含量达到0.1-10毫克/100毫克菌丝体。当然，上述检测方法中，供试样品可用其他的预处理方法进行处理，如对样品衍生化等；对供试样品进行分析时，也可采用其它的检测方法，如用气相色谱-碳同位素燃烧质谱联用、气相色谱-电子捕获检测器联用、液相色谱-质谱联用、液相色谱-荧光检测器联用等。本发明采用块菌液体发酵方法生产a-雄烷醇，至少从两方面解决了a-雄烷醇产业化的难题。一是，液体发酵技术应用于块菌，从根本上解决了现有块菌资源稀缺。二是，液体发酵技术属于绿色技术，避免了化学合成导致有机残留、规模小、产量低、成本高等不利因素。同时作为一种绿色安全的大规模生产方式有着无可比拟的巨大优势，利用块菌发酵法生产a-雄烷醇具有成本低、周期短、操作简单、易培养、质量可控、可以有效的防止化学残留等优势。本发明方法在很大程度给a-雄烷醇的大规模工业化生产提供了一种新思路，改换了现有的a-雄烷醇的生产模式。图1用于制备本发明菌丝体待测样品的蒸镏装置。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验材料1、块菌菌种中国块菌(r^ers/"e"se)、印度块菌(Tw&r/"Awm)、黑孢块菌(r^erwe/awas/wn^w)、白^丸菌(7Y^erwag"flrt/w)、夏》夹菌(7W)eraest/vwm),均/人四川省纟帛阳市食用菌研究所购买。实施例1采用的菌种黑孑包i夹菌(7w^erme/awospon/m)。1、斜面菌种培养本实施例中所采用的斜面菌种培养基配方为葡萄糖20克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；灭菌条件为121°C、20分钟。培养温度为30。C,培养时间为7天；2、一级液体种子培养一级液体种子、二级液体种子培养基的配方均为葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升，硫酸镁l克/升、磷酸二氢钾2克/升、pH值7.0。将斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中即可进行一级液体种子培养。培养温度30。C,摇床转速为150转/分钟，培养时间为7天；3、二级液体种子培养二级液体种子的培养基配方和一级液体种子培养基的配方相同，培养温度30。C,摇床转速为150转/分钟，培养时间为3天；4、摇瓶中的液体发酵培养基的配方为蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升，硫酸镁2克/升、磷酸二氲钾2克/升、pH值7.0;发酵温度与步骤l相同，摇床转速为150转/分钟，培养时间与步骤l相同。接种量按体积比计为10%,装液量为每500毫升摇瓶装200毫升液体。5、01-力#烷醇的测定(1)、将步骤4中所获得的黑孢块菌(r"Zjwwe/a"(wjwn^)发酵液离心(10000转/分钟、20分钟、4°C)，取10毫升上清液用于a-雄烷醇的测定；先用4毫升乙醇、再用4毫升去离子水对ds固相萃取小柱(北京艾杰尔科技有限公司，填料200毫克/容量3毫升)进行预处理，再将10毫升上述发酵液通过预处理好的固相萃取小柱，之后分别用2毫升去离子水，2毫升60。/。的丙酮溶液进行淋洗，淋洗后用氮气吹干固相萃取小柱，接着用l毫升的丙酮进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干洗脱液，再用50微升的丙酮溶解残留，保存于4。C的冰箱中作为发酵液供试样品。(2)、取步骤4所得新鲜黑孢块菌(rwZ)^me/fl"o^onwz)菌丝体100克于2升的蒸馏瓶中并加入少量碎瓷片，加入去离子水l升，蒸馏瓶上端连接挥发油提取器，提取器上端连接冷凝管冷水回流(图1)。从冷凝管上端加少量去离子水平衡挥发油提取器后，加入2毫升乙酸乙酯萃取挥发油，加热至沸腾保持2小时后结束，取乙酸乙酯部分于2毫升容量瓶中并定容至刻度，保存于4。C的水箱中作为菌丝体供试样品。(3)、供试样品用气相色谱进行检测进样量1微升，分流比l:10，进样器温度270°C。用HP-1毛细管柱(美国安捷伦科技，长30米，内径0.25毫米，液膜厚度0.25微米)或者相似极性柱分离；程序升温条件100。C保持2分钟，然后以10。C/分钟的速度升到180。C并保持16分钟，最后以40。C/分钟的速度升到300。C并保持2分钟；高纯氮气作为载气，流速恒流1.0毫升/分钟；；险测器温度30(TC。根据与同样条件下a-雄烷醇对照品的出峰时间确定a-雄烷醇后，根据两者的峰面积比与浓度比得出样品中a-雄烷醇的浓度，通过外标法得出原发酵液及菌丝体中a-雄烷醇的浓度。(4)、检测结果本实施例所制备的黑孢块菌(r"6erwe/fl"cw/;om附)发酵液中，a-雄烷醇产量为19.7毫克/升；制备的黑孢块菌(7^erwe/""w;oram)菌丝体中，a-雄烷醇产量为18.0毫克/升。实施例2将中国块菌(rw6er、印度块菌(rWer/"&ww)、黑孢块菌(r"6erwe/flwas/7onww)、白i夹菌(rw/er附agwa/ww)禾口夏块菌(rw6eraesrivww)分另ll在不同共见冲莫下进行液体发酵。发酵培养基成分及培养条件见表l。斜面菌种培养，一级液体种子培养和二级液体种子培养同实施例l。a-雄烷醇含量的检测方法同实施例l。所得块菌发酵液及菌丝体中a-雄烷醇的产量见表2所示。表l.不同发酵规模的培养基成分及培养条件发酵规模蔗糖(克/升)蛋白胨(克/升)酵母膏(克/升)疏酸镁(克/升)磷酸二氢钾(克/升)装液量PH溶氧转速(转/升)通气速率(升/分钟)500毫升摇瓶401010200毫升6.5-150-5升生物反应器40151510103.5升7.050%7001.050升生物反应器1002020101040升7.050%80025200升生物反应器10030151010160升7.080%6005010表2.不同发酵规模条件下CX-雄烷醇产量的比较(毫克/升)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3改变黑孢块菌(rw6erme/朋w/wram)斜面菌种培养基主要成分的浓度及培养温度(见表3)，考察其对黑孢块菌液体发酵生产a-雄烷醇的影响。一级液体种子培养，二级液体种子培养和液体发酵同实施例l。a-雄烷醇含量的检测方法同实施例l。所得黑孢块菌(7^6erwe/awos/7orww)发酵液及菌丝体中a-雄烷醇的产量如表3所示。表3.斜面菌种培养对黑孢块菌液体发酵生产a-雄烷醇的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从试验结果可以看出，当黑孢块菌(7^e,'附e/朋仍/om附)斜面菌种培养采用培养条件2时，相比于其它4组培养条件，所得到的菌丝体或发酵液中的a-雄烷醇产量均有了显著地增加。实施例4改变黑孢块菌(ri^erme/mKwpon/m)—级液体种子培养基主要成分的浓度及培养条件(见表4)，考察其对黑孢块菌液体发酵生产a-雄烷醇的影响。斜面菌种培养，二级液体种子培养和液体发酵同实施例l。a-雄烷醇含量的检测方法同实施例l。所得黑孢块菌(rw6erme/a,wsponiw)发酵液及菌丝体中ci-雄烷醇的产量如表4所示。表4.一级液体种子培养对黑孢块菌液体发酵生产a-雄烷醇的影响<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>从试验结果可以看出，当黑孢块菌(7^erwe/朋05^orwm)—级液体种子培养采用培养条件2时，相比于其它4组培养条件，所得到的菌丝体或发酵液中的a-雄烷醇产量有了明显地-提高。实施例5改变黑孢块菌(r"Z)wwe/a"as;ora,w)二级液体种子培养基主要成分及培养条件(见表5)，考察其对黑孢块菌液体发酵生产a-雄烷醇的影响。斜面菌种培养，一级液体种子培养和液体发酵同实施例i。a-雄烷醇含量的检测方法同实施例1。所得黑孢块菌(r"Zerwe/a"(w;wn/m)发酵液及菌丝体中a-雄烷醇的产量如表5所示。表5.二级液体种子培养对黑孢块菌液体发酵生产a-雄烷醇的影响<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从试验结果可以看出，当黑孢块菌(rwZ)erwe/a"oy;oram)二级液体种子培养采用培养条件2时，相比于其它4组培养条件，所得到的菌丝体或发酵液中的a-雄烷醇立S女7曰"Stl丄扭古乂主吓jj^ii;a》o乳同o实施例6在装液量为200毫升的500毫升摇瓶中，改变黑孢块菌(3^^/-附^""0^0^"0液体发酵培养基成分及培养条件(见表6)生产a-雄烷醇。斜面菌种培养，一级液体种子培养和二级液体种子培养同实施例1。a-雄烷醇含量的检测方法同实施例1。所得黑孢块菌(r^erme/a"ayporww)发酵液及菌丝体中a-雄烷醇的产量如表6所示。表6.发酵条件对黑孢块菌发酵生产a-雄烷醇产量的影响(毫克/升)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从试-睑结果可以看出，当黑孢块菌(Ji^erwe/a"(wporaw)采用发酵条件2时，相比于其它4组发酵条件，所得到的菌丝体或发酵液中的a-雄烷醇产量有了明显提升。实施例7将中国块菌(7^ferw'"e/we)、印度块菌(7i,6erZ"c/Z冊z)、黑孢块菌(rWerwe^zw05p0rwm)、白土炎菌(r"i)er附ag"fi^M附)禾口夏i夹菌(rwZerfles&v"w附)分另l]在200升生4勿反应器中进行液体发酵。在发酵温度为30。C的条件下，改变发酵培养基成分及培养条件(见表7)。斜面菌种培养，一级液体种子培养和二级液体种子培养同实施例l。a-雄烷醇含量的检测方法同实施例l。所得块菌发酵液及菌丝体中a-雄烷醇的产量见表8所示。表7.200升生物反应器的培养基成分及培养条件发酵条件蔗糖(克/升)蛋白胨(先z升)酵母膏(克/升)硫酸镁(克/升)磷酸二氢钾(克z升)装液量r补、、'/PH溶氧(%)转速通气速率沐'分钟)条件l50101405.55050030条件2100301510101607.08060050条件3400503020201406.08070070条件4700706030301208.08080090条件5100010010040401209.0901000100表8.200升生物反应器不同发酵条件对a-雄烷醇产量的影响(毫克/fj^发酵条件黑孢块菌中国块菌印度块菌白块菌夏块菌菌丝体发酵液菌丝体发酵液菌丝体发酵液菌丝体发酵液菌丝体发酵液条件l6.15.84.23.64.73.83.63.44.14.6条件217.620.218.919.219.517.619.917.716.117.9条件310.18.69.88.210.49.88.99.37.88.5条件47.56.24.24.66.25.35.65.03.54.9条件53.22.31.21.92.31.71.11.62.02.8/人试验结果可以看出，将中国块菌(r"6erW"ewe)、印度块菌(71^erz>u//wm)、黑孑包》夹菌(rw6erme/a"as/on/m)、白》丸菌(7I/Z)erm(3g"atom)禾口夏》丸菌(rw6eraes"vwm)分别在200升生物反应器中进行液体发酵，当发酵培养基的成分和发酵条件采用条件2时，所得到的菌丝体或发酵液中的a-雄烷醇产量相比于其它4组发酵条件有显著提高。1权利要求1、一种制备α-雄烷醇的方法，其特征在于将块菌属(Tuber)菌株进行液体发酵，得到含有α-雄烷醇的发酵液或菌丝体。2、按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述的块菌属选自中国块菌(rw6erw'"e"se)、印度i夹菌(r"6er/wt//wm)、黑孑包》夹菌(r"6erme/awas/WMW)、白i夹菌(7^6erwag"W謂)或夏块菌(rw6erae幼V扁)。3、按照权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的方法依次包括以下步骤斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、液体发酵。4、按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的斜面菌种培养按照以下条件进行(1)培养基葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾l-40克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；优选的，所述斜面菌种培养基为葡萄糖20克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；(2)培养条件培养温度为15-40。C，优选为30。C。5、按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的一级液体种子培养或二级液体种子培养按照以下条件进行(1)培养基葡萄糖10-500克/升、蛋白胨l-100克/升、酵母膏l-100克/升，硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾l-40克/升；pH值2-9;优选的，所述的一级液体种子培养或二级液体种子的培养基为葡萄糖50克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁l克/升、磷酸二氢钾2克/升、pH值7;(2)培养条件培养温度15-40。C，摇床转速为50-300转/分钟；优选的，所述一级液体种子培养或二级液体种子培养条件为培养温度30。C,摇床转速为150转/分钟。6、按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液体发酵按照以下条件进行(1)发酵培养基蔗糖10-1000克/升、蛋白胨l-100克/升、酵母膏l-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾l-40克/升、pH值2-9;优选的，所述发酵培养基为蔗糖100克/升、蛋白胨20克/升、酵母膏30克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾2克/升，pH值为7;(2)发酵条件摇瓶发酵温度15-40。C,摇床转速为50-300转/分钟；优选的，所述摇瓶发酵条件为发酵温度30。C，摇床转速为150转/分钟；生物反应器发酵温度为15-40。C，搅拌转速为50-1500转/分钟，通气速率为0.01-100升/分钟；优选的，所述生物反应器发酵条件为发酵温度30。C，搅拌转速为600-800转/分钟，通气速率为1.0-50升/分钟。7、由权利要求l-6任何一项方法所制备得到的含有a-雄烷醇的发酵液或菌丝体。8、检测由权利要求7所制备的发酵液或菌丝体中a-雄烷醇含量的方法，包括(1)收集样品将发酵产物离心，分别收集上清液和菌丝体沉淀；(2)制备待测样品(A)发酵液待测样品的制备将发酵上清液通过固相萃取小柱，用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，浓缩，得发酵液待测样品；(B)菌丝体待测样品的制备将菌丝体蒸镏回流提取，用有机溶剂富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品；(3)检测待测样品使用气相色谱-氢火焰离子检测器或离子阱/四极杆质谱检测器检测，色谱柱为极性或非极性毛细管柱或填充柱；采用程序升温；通过对比相同色谱条件下a-雄烷醇对照品出峰时间和离子碎片信息对样品中a-雄烷醇进行定性，通过内标法或外标法对待测样品中a-雄烷醇的含量进行定量。9、按照权利要求8的方法，其特征在于步骤(1)中将发酵产物在8000-15000转/分钟的转速下离心；步骤(2)中所述的发酵液待测样品按照以下步骤制备依次用乙醇、去离子水对C18固相萃取小柱进行预处理；将发酵上清液通过预处理的C18固相萃取小柱；依次以水和60%丙酮水溶液进行淋洗，再用丙酮进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，作为发酵液待测样品；步骤(2)中所述的菌丝体待测样品按照以下步骤制备将菌丝体进行蒸馏回流提取，控制温度在80-150摄氏度；用乙酸乙酯富集蒸馏液中的非极性成分，得菌丝体待测样品。10、按照权利要求8的方法，其特征在于步骤(3)中所述的检测按照以下条件进行汽化室温度在160。C以上，程序升温的初温在80。C以上，末温在220。C以上，升温时间不超过l小时；进样方式为分流或不分流方式，体积l-20微升，流速l-5毫升/分钟；氢火焰离子检测器的温度在250摄氏度以上；质谱所采用的电离方式为EI电离，扫描离子质荷比范围为50-650,a-雄烷醇特征碎片离子质荷比为241、259。全文摘要本发明公开了一种制备α-雄烷醇的方法，该方法包括将块菌属菌株进行液体发酵，得到含有α-雄烷醇的发酵液或菌丝体。本发明还公开了一种检测上述发酵液或菌丝体中α-雄烷醇含量的方法。本发明利用块菌液体发酵生产α-雄烷醇，与化学合成相比，具有成本低、周期短、操作简单、质量可控、可以有效防止化学残留等优点。文档编号C12P33/00GK101492707SQ200810000570公开日2009年7月29日申请日期2008年1月22日优先权日2008年1月22日发明者刘瑞桑,李冬生,汤亚杰,冠王申请人:湖北工业大学