专利名称：：与慢性乙型肝炎病程进展相关的cxcl10基因多态性及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及乙型肝炎病毒(HepatitisBvims,HBV)慢性感染者病程进展的个体易感性及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与HBV慢性感染者病程进展相关的易感基因CZO:70的基因型检测方法。本发明进一步涉及上述易感基因基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用。另外，本发明还涉及上述检测方法和易感基因在HBV慢性感染者病程进展的预警以及遗传咨询中的应用。
背景技术：
：HBV在世界范围内是最常见的导致急性或慢性肝炎的致病因子，特别是在一些亚洲和非洲国家。在HBV慢性感染期，HBV特异的CD8+T细胞免疫反应会引起肝损伤和募集非特异性T细胞。这种在y-干枕素(interferon-^,IFN-y)诱导下的对非特异性CD4+或CD8+T细胞的募集现象在产生爆发性肝炎的转基因小鼠中和人类急性乙肝的潜伏期都被证实。趋化因子配体10chemokine(C-X-Cmotif)ligand10,CXCi^0是HBV转基因小鼠和急性HBV感染的黑猩猩肝脏中诱导表达的效应基因。CXCL10通过与CXCL3结合激活T淋巴细胞和NK细胞。最近的研究表明，与非病毒性肝病患者相比，慢性乙肝患者肝脏中高表达CXCL10。Harvey等人的研究也表明，CXCL10在肝实质细胞中诱导表达，并且与慢性丙肝患者组织学严重程度及肝小叶炎症反应相关。越来越多的研究表明CXCLIO在HBV特异的T细胞或非特异炎症细胞的肝内募集、抗病毒或致病机制中起重要作用。而该基因的多态性可能改变其表达或结合活性，从而影响肝损伤和疾病严重程度。因而，我们假设CZCZJ0是HBV慢性感染者病程进展的候选易感基因，该基因内的遗传多态性能影响HBV慢性感染者的病程进展。
发明内容发明人首先对CXCX/0基因约4.2Kb的基因组区域进行测序，发掘了21个单核苷酸多态性位点(SingleNucleotidePolymorphisms,SNPs)，然后通过连锁不平衡分析，选择了其中2个标签SNPs进行了基因分型，最后通过标签SNP与疾病表型的遗传关联分析来考察该基因的多态性与乙肝严重程度的相关性。发明人通过基于医院的病例-对照研究，进行了大量的临床和实验室实验，以及大样本的统计分析，判明携带含-201A等位的基因型的男性HBV携带者病程进展更为迅速，更易导致肝损伤，最终发生更为严重的肝病。因此本发明鉴定了与乙肝病程进展相关的一种新的易感基因及易感基因型。3本发明还提供了一种检测与乙肝病程进展关联的易感位点CZCZ/OG-201A的方法，该方法为聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。本发明还提供了用于检测多态性位点G-201A的引物对。本发明进一歩提供了分别用于检测与乙肝病程进展关联的基因的G-201A位点的试剂盒，以及上述试剂盒在慢性乙肝病程进展预警中的应用。一、如上所述，本发明提供了一种检测与慢性乙肝病程进展关联的cro:70基因的G-201A位点的方法，该方法为PCR-RFLP，具体的说，包括了如下步骤1、对CXC丄70基因中与G-201A位点呈绝对连锁不平衡的C-1596T位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2、对PCR产物以限制性内切酶^k/I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明G-201A位点的基因型。二、另一方面，本发明还提供了与乙肝病程进展关联的易感基因型，即CXC丄70基因的-201八0和-201八八基因型为乙肝病程进展的易感基因型，并提供了一种通过检测CXC丄70基因的G-201A基因型來判定人群或个体对乙肝病程进展易感性的方法。该方法包括1、对CXa:/0基因中与G-201A位点呈绝对连锁不平衡的C-1596T位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2、对PCR产物以限制性内切酶I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明CXC丄川基因G-201A的基因型；3、当基因型表现为-201AG或-201AA时，则表明该个体病程进展更为迅速，更易导致肝损伤，最终发生更为严重的肝病。三、检测CYC"O基因G-201A位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5'-GCAGATACTGTCTCAGAACCTGGTA-3'反向引物5'-TGTCACCATCTCTCATTTTGATTGT-3'四、本发明进一步提供了检测与乙肝病程进展关联的CXCL/0基因的G-201A位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测G-201A位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，检测样品的G-201A位点的基因型试剂盒，含有PCR引物对(5'-GCAGATACTGTCTCAGAACCTGGTA-3'和5'-TGTCACCATCTCTCATTTTGATTGT-3')，dNTPs，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。本领域技术人员己知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStarTaq酶Kle加w片段，TthDNA聚合酶，VENTDNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。但为保证特异性扩增，除了引物和反应条件的优化外，应优选HotStarTaq酶。在PCR产物的RFLP分析中，该试剂盒可含有JftaI及其缓冲液，该基因片段的^"I酶切图谱等。使用方法说明如下1、PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25pi反应体系为10ng基因组DNA，2^tM引物，2.5mMdNTP，0.6UTaKaRaEXTaqDNA聚合酶以及10XEXTaqBuffer(含Mg2+)。95。C15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94°C30s和72°C30s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从63。C开始每个循环降0.5。C，第二阶段扩增的退火温度则固定在57。C，最后的72'C延伸时间为7min。特异性的PCR产物(499bp)以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。2、RFLP分析对经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，按照如下反应体系和条件进行限制性内切酶的切割消化10的反应体系为3|dlPCR产物DNA,4单位限制性内切酶^wI,10x缓冲液1^和双蒸馏水。限制性酶切反应终止后，将样品进行3%琼脂糖凝胶电泳，从而进行基因型判定。其中，基因型区分的依据是，499bp的PCR产物以；aaI限制性内切酶消化后，-1596TT(即-201AA)纯合子被切割为两条片段，长度分别为174bp和325bp;而纯合子-1596C/C(即-201GG)则因为没有酶切位点而在消化后只出现499bp—个条带；-1596C/T(即-201A/G)杂合子经消化后，不同长度的该三个片段均出现。五、本发明还提供了与乙肝病程进展关联的基因G-201A基因型的检测方法及其在HBV慢性感染人群预警中的应用。例如，由于本发明证实了基因的G-201A基因型与乙肝的病程进展存在关联，因此，在HBV慢性感染人群的预警中，就需要对所咨询的对象进行CZC丄70基因G-201A基因型进行分析，以判断该对象是否携带有易感基因型-201AG或-201AA(表现为病程进展更为迅速，更易导致肝损伤，最终发生更为严重的肝病)。对具有基因型-201AG或-201AA的个体，则可对之进行科学的干预，例如建议及早进行治疗性预防等，这样可以针对性地降低这些易感人群的乙肝病程迅速进展的发生风险。具体实施例方式实施例1该实施例设计并合成了一套引物对，并且在该引物对的基础上，设计了一种检测与乙肝病程进展关联的CXCXW基因的G-201A基因型的方法。1、基因组DNA的提取采取本领域酚/氯仿法提取外周血白细胞的基因组DNA。1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4'C2000rpm离心20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0.1。/。Triton-X100(体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50MmTris-Cl-10mMEDTA,pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10%SDS至终浓度为0.5%,混匀；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200吗/ml，混匀，55°C3小时或37。C过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入等体积平衡酚，倒转混匀，4000rpm离心IO分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)转移上层水相，重复酚抽提一次；8)转移上层水相，加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，倒转混匀，4000rpm离心10分钟；9)转移上层水相，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇混匀；10)置液氮冷冻10分钟或-20。C60分钟后，4000rpm离心10分钟；11)以70%乙醇洗涤沉淀12次，吹干或真空抽干；12)以0.5mlTE(10mMTris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测260/280nmOD比值。2、PCR扩增用本发明提供的扩增与G-201A位点绝对连锁不平衡的C-1596T所在区域的引物对，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25pd反应体系为10ng基因组DNA，2引物，2.5mMdNTP，0.6UTaKaRaEXTaqDNA聚合酶以及10XEXTaqBuffer(含Mg2+)。950C15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94°C30s和72°C30s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从63。C开始每个循环降0.5。C，第二阶段扩增的退火温度则固定在57°<:，最后的72'C延伸时间为7min。特异性的PCR产物(499bp)以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。对经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物，按照如下反应体系和条件进行限制性内切酶的切割消化lO)al的反应体系为3MlPCR产物DNA,4单位限制性内切酶;aa1,10x缓冲液1^1,和双蒸馏水。限制性酶切反应终止后，将样品进行3%琼脂糖凝胶电泳，从而进行基因型判定。其中，基因型区分的依据是,499bp的PCR产物以力aI限制性内切酶消化后，-1596TT(即-201AA)纯合子被切割为两条片段，长度分别为174bp和325bp:而纯合子-1596C/C(即-201GG)则因为没有酶切位点而在消化后只出现499bp—个条带-1596C/T(即-201A/G)杂合子经消化后，不同长度的该三个片段均出现。实施例2该实施例用实施例1建立起来的方法，对1147例慢性进展期乙肝患者，1253例无症状HBV携带者的CXC丄/0基因的G-201A基因型进行了分析。1、试验对象本研究包括了1147例慢性进展期乙肝患者，1253例无症状HBV携带者(从2001年2月至2006年3月分别收集于北京市传染病医院[613份]和重庆市西南医院[1787份])。所有HBV感染者均是HBsAg和抗-HBcIgG阳性至少12个月。所有携带者在研究期间均通过肝功能检査、血清标志物检测、超声波/计算机断层扫描成像、其中376例(15.7%)进行了肝组织活检。所有受试者没有HCV、HDV和HIV共感染的血清学证据。在收集组织标本或血样的同时，每个研究对象均签署知情同意书并提供详细的临床和社会人口学资料。2、CXC丄川基因G-201A位点基因型的确定基因G-201A位点基因型的频率分布如表1所示。在总体人群中，与-201GG基因型携带者相比，-201AG或AA基因型携带者病程进展更为迅速，更易导致肝损伤，最终发生更为严重的肝病，比数比(Oddsratio,OR)为1.50[95%置信区间(95%CI)=1.20-1.87;P<0.001，见表l]。在北京和重庆这两个独立人群中的结果相似(见表l)。基于性别的分层分析表明，上述关联只存在于男性中，OR值为1.53[95%置信区间(95%CI)=1.19-1.98;P=0.001，见表2]。上述关联在经过多重检验校正后仍然具有显著性意义。因此，用本发明的方法解析了CICZJO基因G-201A位点基因型与HBV携带者病程进展的易感性之间的相关性。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。7无症状和有症状HBV携带者中CXCXJ0基因G-201A位点基因型的分布无症状HBV携带者有症状HBV携带者-^^^^抬基因型n0.(%)no.(o/0)_P值注OR,比值比(oddsratio);CI,置信区间(confidenceinterval)'按显形模型分析，GG为参考组。数据经过logistic回归分析，并进行了年龄、性别和饮酒状态的校正。表2不同性别人群的进展性肝损伤风险与CXCXM基因G-201A位点之间的关联<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注OR,比值比(oddsratio);CI，置信区间(confidenceinterval)*按显形模型分析，GG为参考组。数据经过logistic回归分析，并进行了年龄、性别和饮酒状态的一交正。参考文献1.DengG,ZhouG，ZhangR，ZhaiY,ZhaoW，YanZ,DengC,YuanX,XuB,DongX,ZhangX,ZhangX,YaoZ，ShenY，QiangB,WangY，HeF.RegulatorypolymorphismsinthepromoterofCXCLIOgeneanddiseaseprogressioninmalehepatitisBvimscarriers.GWraenfeTO/og,=283=330241(85.4)255(77.7)O駕1.73(1.03-2.93)40(14.2)70(21.4)1(0.4)3(0.9)0.0750.116n=970w=817793(82.4)619(76.5)0.0041.45(U3-.87)165(17.1)178(22.0)5(0.5)12(1.5)0.0910.125n=1253m=11471034(83.0)874(76.9)<0.0011.50(1.20-1.87)205(16.5)248(21.8)6(0.5)15(1.3)0.0870.122北京人群重庆人群总体人群G/GG/AA/AAalleleAalleleGAAkAGAA2008;Inpress.2.LeeWM.HepatitisBvirusinfection.NEnglJMed1997;337:1733-1745.3.LaiCL，RatziuV,YuenMF,etal.ViralhepatitisB.Lancet2003;362:2089-2094.4.CoursagetP,YvonnetB,ChotardJ,etal.Age-andsex-relatedstudyofhepatitisBviruschroniccarrierstateininfantsfromanendemicarea(Senegal).JMedVirol1987;22:1-5.5.MainiMK,BoniC,LeeCK，etal.Theroleofvirus-specificCD8(+)cellsinliverdamageandviralcontrolduringpersistenthepatitisBvirusinfection,JExpMed2000;191:1269-1280.6.AndoK,MoriyamaT,GuidottiLQetal.MechanismsofclassIrestrictedimmunopathology.Atransgenicmousemodeloffulminanthepatitis.JExpMed1993;178:1541-1554.7.WebsterGJ,ReignatS,MainiMK，etal.IncubationphaseofacutehepatitisBinman:dynamicofcellularimmunemechanisms.Hepatology2000;32:1117-1124.8.KakimiK,LaneTE,WielandS，etal.Blockingchemokineresponsivetogamma-2/interferon(IFN)-gammainducibleproteinandmonokineinducedbyIFN-gammaactivityinvivoreducesthepathogeneticbutnottheantiviralpotentialofhepatitisBvirus-specificcytotoxicTlymphocytes.JExpMed2001;194:1755-1766.9.WielandS,ThimmeR,PurcellRH,etal.GenomicanalysisofthehostresponsetohepatitisBvimsinfection.ProcNatlAcadSciUSA2004;101:6669-6674.10.DufourJH,DziejmanM，LiuMT,etal.IFN-gamma-inducibleprotein10(IP-10;CXCL10)-deficientmicerevealaroleforIP-10ineffectorTcellgenerationandtrafficking.JImmunol2002;168:3195-3204.11.LiuL，CallahanMK，HuangD，etal.ChemokinereceptorCXCR3:anunexpectedenigma.CurrTopDevBiol2005;68:149-181.12.PatzwahlR,MeierV，RamadoriG,etal.Enhancedexpressionofinterferon-regulatedgenesintheliverofpatientswithchronichepatitisCvirusinfection:detectionbysuppression-subtractivehybridization.JVirol2001;75:1332-1338.13.DengG,ZhouG,ZhaiY,etal.AssociationofestrogenreceptoralphapolymorphismswithsusceptibilitytochronichepatitisBvirusinfection*Hepatology2004;40:318-326.14.ZhaiY,ZhouG，DengG，etal.EstrogenreceptoralphapolymorphismsassociatedwithsusceptibilitytohepatocellularcarcinomainhepatitisBviruscarriers.Gastroenterology2006;130:2001-2009.序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>与慢性乙型肝炎病程进展相关的CXCXM基因多态性及其检测方法<160>2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1GCAGATACTGTCTCAGAACCTGGTA25<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2TGTCACCATCTCTCATTTTGATTGT2权利要求1、一种通过检测CXCL10基因的G-201A位点来判定慢性乙型肝炎患者病程进展的方法。其特征在于当某一慢性乙型肝炎患者的CXCL10基因的G-201A位点表现为-201AG或-201AA基因型时，则表明该患者病程进展更为迅速，更易导致肝损伤，最终发生更为严重的肝病。2、一种检测CICiJO基因的G-201A位点的基因型的方法。该方法为PCR-RFLP法，即聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，其特征在于包括以下方面(1)对包含与G-201A位点呈绝对连锁不平衡状态的C-1596T位点的CATX70基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物见序列表中序列l;反向引物见序列表中序列2。(2)对包含与G-201A位点呈绝对连锁不平衡的C-1596T位点的C义C丄川基因区域，以所设计引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增。(3)对PCR产物以限制性内切酶I进行切割，并以琼脂糖凝胶电泳分析内切酶消化产物的带型，以此判明G-201A位点的基因型。3、一种与慢性乙型肝炎病程进展关联的CXOJ0基因的G-201A位点的检测试剂盒，包括扩增用基因特异性引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种，以及用于测序的试剂中的一种或多种。4、如权利要求1-3任一项所述的方法或其试剂盒在乙型肝炎慢性感染人群疾病严重程度的预警以及遗传咨询中的应用。全文摘要本发明涉及与慢性乙型肝炎病程进展相关的易感基因CXCL10的G-201A位点的检测方法。所述方法为PCR-RFLP法(即聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法)。本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及其应用。另外，本发明将基因的G-201A位点与慢性乙型肝炎病程进展的发生风险联系起来，确定了CXCL10是慢性乙型肝炎病程进展的一个新型易感基因，为乙型肝炎慢性感染人群疾病严重程度的预警提供了新的遗传咨询内容。文档编号C12Q1/68GK101519685SQ20081000647公开日2009年9月2日申请日期2008年2月29日优先权日2008年2月29日发明者周钢桥,灏杨,芸翟,贺福初申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所