专利名称：：一种提取狂犬病病毒的方法
技术领域：
：本发明涉及利用生物技术提取狂犬病病毒的方法。技术背景目前狂犬病病毒疫苗的提取一般采用分子筛凝胶层析单一手段，存在以下缺陷1)不同批次间质量指标差异较大，对生物制品的稳定性影响较大。2)残余DNA的去除成为难题。3)残余宿主蛋白含量过高，临床表现副作用较大。4)原液制备后抗原含量浮动范围宽，后期成品配制造成一定障碍。5)影响了生物制品的产品质量，制约了工业化生产提取的规模。为此许多人尝试在分子筛层析中，对上样液性质，即病毒收获液浓縮倍数，进行调节；对上样体积进行调节；对平衡液进行选择，对平衡液盐浓度进行调节，对平衡液PH值进行控制；层析流速进行控制等手段。仅能轻微的改善结果，技术上没有突破。李福安等提到，狂犬病毒分子量大于病毒培养液中的杂蛋白分子量。病毒颗粒最先被洗脱下来，在样品蛋白浓度较小时，病毒与杂蛋白可以被分开。但当样品蛋白浓度大于40mg/mL，由于浓度过大使液体粘度增高，扩散速度降低，使正常的凝胶柱层析交换规律受阻，造成液流图形不规则，形成了扩散较大的区带，病毒尚未完全流出凝胶柱，后面的杂蛋白分子已追上来，致使纯化效果不佳。因此，单一用凝胶柱层析法纯化Vero细胞狂犬病疫苗，样品蛋白浓度应在40mg/mL以下。并且上样体积小于柱床体积的5%，由于蛋白浓度的限制产生了瓶颈，制约了生产规模。同时存在残余DNA超标的问题。张磊等提及，曾采用过硫酸鱼精蛋白直接结合残余细胞DNA的方法，将浓縮了30倍的疫苗原液经硫酸鱼精蛋白一琼脂糖凝胶层析，收获穿透峰后，再用pH3.5醋酸缓冲液洗脱，发现硫酸鱼精蛋白在结合DNA的同时也结合了部分病毒糖蛋白，造成了较大的活性损失，合并穿透峰和洗脱峰，pH调至中性。但是层析填料价格较贵，不能用于工业化生产，并且抗原损失较大需要进行回收处理，同时抗原的稳定性需要进行考察。总之在纯化过程中尽可能提高收率是纯化工艺需要解决的重要经济问题。
发明内容为克服上述诸多不足，本发明的目的在于提供一种用中空纤维超滤柱、离子交换层析、分子筛凝胶层析相结合和组合的方法提取狂犬病病毒。本发明的目的是这样实现的1、利用截留分子量为750KD或500KD的中空纤维超滤柱或超滤膜将病毒收获液进行浓縮和部分杂质去除；2、利用阴离子交换层析或分子筛凝胶层析对步骤1所得样品进行分离提纯；3、利用分子筛凝胶层析或阴离子交换层析对步骤2所得样品进行分离提纯。利用750KD或500KD中空纤维超滤柱对病毒收获液进行浓缩存在许多优点。病毒浓縮速度比传统的300KD或100KD膜包快，提高了处理效率。单位膜面积相对的处理量增加了许多，批处理量有所增加。从膜截留分子量的选择看，750KD比300KD杂质去除效果要好，并且抗原没有泄漏。离子交换层析与分子筛凝胶层组合后，生产流程更加合理化，批次稳定性好，HCP的去除效率更高，尤其对残余DNA的去除效果更佳。并且原液制备后抗原含量波动更小，对后续的成品的配制更加方便。本发明的创新之处在于，病毒的浓縮采用750KD或500KD截留分子量的中空纤维超滤柱，后期的提取工艺增加了离子交换层析步骤，减轻原有单一层析工艺负担，打破了生产的瓶颈，提高了产品质量，在去除残余DNA、HCP上尤其突出。下面结合实施例及附图进一步说明本发明。图1是电泳检测图谱。图2是离子交换层析图谱。图3是分子筛层析图谱。图4是残余DNA含量检测图谱。具体实施方式以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本实施例仅采用常规实验技术，这些均是本
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人员所熟悉的。或者按照试剂生产商所提供的说明书进行。实施例一1用截留分子量为750KD或500KD的中空纤维超滤柱对病毒收获液进行浓縮和部分杂质的去除首先用10mmol/LPBS-0.15MNaCl缓冲液(pH7.6)循环平衡中空纤维超滤柱IOL。将40L病毒收获液上样并浓縮处理，中空纤维超滤柱型号采用UFP-750-E6A，膜面积2800cm2，截留分子量为750000道尔顿。当病毒收获液浓缩至0.4L后，分别取样病毒浓縮液和过滤液10mL。然后用10mmol/LPBS-0.15MNaCl缓冲液(pH7.6)平衡液流加洗脱8L。将滤过的膜下液每隔0.4L收集一个样品，同时取病毒浓縮液样品10mL。将收集组分进行蛋白浓度检测显示，杂蛋白去除率达到了60%以上，如表一所示。对病毒浓縮液样品进行SDS-PAGE电泳，如图1所示。杂蛋白分子量主要分布在6.6、9.9、11.6、20.5万道尔顿四条主带，与理论存在一定矛盾。本发明包括的中空纤维超滤柱浓縮病毒和去除部分杂质步骤，由于膜板式超滤装置，截留面积有限，中空纤维超滤是在一支空心柱内装有许多的，中空纤维毛细管，两端相通，管的内径一般在lmm左右，有效面积可以达到1平方厘米，每一根纤维毛细管像一个微型透析袋，极大地增大了渗透的表面积，提高了超滤的速度。中空纤维超滤步骤中洗脱量太少，则留在浓縮液中的杂蛋白成分会较多，效率损失较大；同时对洗脱量的多少进行了优化，影响滤液中杂蛋白成分的含量。但有可能需要工序时间延长，配合后续层析工序合理协调它们之间的关系。中空纤维超滤的压力降，是指原液进口处压力与浓缩液出口处压力之差。压力降与样品供应量，流速及浓縮液排放量有密切关系。沿着水流方向膜表面的流速及压力是逐渐变化的。样品供应量，流速及浓縮液排量越大，则压力降越大，在实际应用中，尽量控制压力降值范围，正确的掌握和执行操作参数对超滤系统的长期和稳定运行是极为重要的，操作参数一般主要包括流速、压力、压力降、浓縮液排放量、回收比和温度等参数控制，本方法步骤中均对其进行了优化选择。例如步骤1所述经过优化后的条件，蛋白去除效果达到了60%以上。表一病毒浓縮过程中间样品蛋白浓度检测结果样品名称蛋白浓度病毒浓縮液(未洗脱前)723Pg/mL浓缩过程过滤液579Pg/mL洗脱过程过滤液1425Pg/mL洗脱过程过滤液2928Pg/mL洗脱过程过滤液31398Mg/mL洗脱过程过滤液4168卯g/mL洗脱过程过滤液52003Pg/mL洗脱过程过滤液61944Pg/mL洗脱过程过滤液71722Pg/mL洗脱过程过滤液81132Pg/mL洗脱过程过滤液9洗脱过程过滤液10896Pg/mL洗脱过程过滤液11746)^g/mL洗脱过程过滤液12685Pg/mL洗脱过程过滤液136024g/mL洗脱过程过滤液14532Pg/mL洗脱过程过滤液15489Pg/mL洗脱过程过滤液16402Pg/mL洗脱过程过滤液17320Mg/mL洗脱过程过滤液18304Pg/mL洗脱过程过滤液19295Hg/mL洗脱过程过滤液20280Pg/mL病毒浓縮液(洗脱后)28930Pg/mL还可以使用截留分子量为750KD或500KD的超滤膜对病毒收获液进行浓縮和部分杂质的去除。2、用阴离子交换凝胶高载量四价氨基琼脂糖(QSepHaroseXL)对步骤1所得样品进行提取准备50X130mmQSepHaroseXL层析柱，柱体积255mL。手动层析系统8823A设定0.5A，3057设定2cm/h，200mV。QSepHaroseXL离子交换层析在室温环境操作，层析胶第19次使用。用2MNaCl-0.5mol/LNaOH再生30min。用10mmol/LPBS-0.15MNaCl缓冲液(pH7.6)平衡层析柱至pH7.6。层析样品按照步骤1所述方法制备所得，样品编号为UF08。样品上样60mL，流速20mL/min。上样结束后，用1Ommol/LPBS-0.15MNaCl缓冲液(pH7.6)平衡层析柱，收集吸收峰。用10mmol/LPBS-0.25MNaCl缓冲液(pH7.6)洗脱收集吸收峰。用10mmol/LPBS-1.0MNaCl缓冲液(pH7.6)洗脱收集吸收峰。用2MNaCl-0.5mol/LNaOH再生30min。用10mmol/LPBS-0,15MNaCl缓冲液(pH7.6)平衡层析柱至pH7.6。将收集组分按照步骤4、6、8所述方法，分别进行蛋白浓度、残余DNA含量和抗原含量检测。结果如表二所示，层析图谱见图2，Vero细胞DNA残留量检测图谱见图4。离子交换层析(IonExchangeChromatograpHy简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。阴离子交换剂的电荷基团带正电，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。从而达到分离目的。本发明包括的离子交换层析步骤，对离子交换层析进行了以下的优化选择，包括离子交换剂的选择、离子本身的性质、缓冲液离子强度的选择、PH、温度、溶剂组成，上样体积等等参数。并通过通过优化选择后的条件，改变离子强度、pH等改变病毒颗粒与离子交换剂的结合力而达到分离的效果。例如步骤2所述经过优化后的条件之一，HCP去除率达到了95%以上，抗原回收率达到了80%以上，残余DNA去除了99.7%效果十分显著。表二QSepHaroseXL层析样品检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在本步骤中，阴离子交换凝胶还可以选择高流速四价氨基琼脂糖(QSepHaroseFF)或高流速二乙基氨基乙基琼脂糖(DEAESepHaroseFF)对样品进行提取，操作方法与参数与以上相同。3、用分子筛凝胶4%交联度高流速琼脂糖凝胶过滤(SepHarose4FF)对步骤2所得样品进行提取准备一根26X700mm层析柱，柱体积130mL。手动层析系统8823A设定0.5A，3057设定2cm/h，200mV。层析在室温环境操作。按照步骤2所述方法制备样品Q25-2，用10mmol/LPBS-0.15MNaCl缓冲液(pH7.6)平衡层析柱至pH7.6。将Q25-2样品上样60mL，流速8mL/min。上样结束后，用10mmol/LPBS-0.15MNaCl缓冲液(pH7.6)平衡层析柱，收集抗原吸收峰。将收集组分按照步骤4、5、6、8所述方法，分别进行蛋白浓度、残余DNA含量、抗原含量(ELISA)和效价检测(NIH)。结果如表三所示，层析图谱见图3,Vero细胞DNA残留量检测图谱见图4。本发明包括的分子筛凝胶层析步骤中，病毒颗粒最先被洗脱下来，离子交换后样品蛋白浓度较小时，病毒与杂蛋白可以被分开.但当样品病毒浓縮液蛋白浓度较大时。由于浓度过大使液体粘度增高.扩散速度降低，使正常的凝胶柱层析交换规律受阻，造成液流图形不规则，形成了扩散较大的区带，病毒尚未完全流出凝胶柱。后面的杂蛋白分子已追上来，致使纯化效果不佳。本发明包括采用四柱联用方式可以解决此类问题，并且可以实现分别清洗，提高生产效率，节约成本。例如步骤3所述经过优化的条件之一，HCP去除率达到了35%以上，抗原回收率达到了94%以上，残余DNA去除了90X，效果十分显著。表三SepHarose4FF层析样品检测结果样品编号体积(mL)蛋白浓度杂蛋白去除率抗原含量抗原回收率残余DNA含量Q25-260mL466Pg/mL-32.6IU/mL-小于lng/mLGF-4382mL219Mg/mL35.8%22.6IU/mL94.7%小于100pg/mL在本步骤中，分子筛凝胶还可以选择6%交联度高流速琼脂糖凝胶过滤(SepHarose6FF)对样品进行提取，操作方法与参数与以上相同。4、效力检定(ELISA法)利用武汉生物制品研究所的狂犬病效力检测试剂盒对样品抗原含量进行检测。将样品稀释液用蒸馏水2倍稀释成工作浓度(并将牛白按0.5—1%加入)。首先将板条各孔加样品稀释液(若需要检测原倍样品，可不加第一列)，100ul/孔，设D12为空白对照，将自8备的标准品加入A1孔，100lil/孔，再倍比稀释(稀释每孔时应换枪头)，稀释最后一孔时弃多余的100ul液体。样品按同意稀释度稀释(如一律稀释2倍)，并做复孔。将酶标板置湿盒内，37'C温育1小时。剩余的板条及试剂请保存于-2(TC备用。将浓縮的洗涤液用蒸馏水30倍稀释成工作浓度，取出酶标板甩干，将洗涤液加满各孔，倾出，甩干，洗板6次。取酶结合物加入各孔(空白对照孔不加酶结合物)，100ul/孔或2滴，置湿盒内，37'C温育0.5小时。取出酶标板，倾出液体，甩干，同上法洗板10次。将底物A、B各一滴加入各孔中，置湿盒内IO分钟。将终止液加入各孔，50ul/孔或l滴，终止反应。空白孔无色，而标准品孔显蓝色，并呈梯度递减则结果成立。加终止液后，以空白孔调零，在酶标仪上测定450nm处各孔A值。通过计算对结果进行分析。将自备标准品稀释度相对应的国际单位及对应A值分别取对数值，以稀释度对数为横坐标，以A值对数为纵坐标作图，在图中找出样品对应的A值对数,其对应的横坐标值的反对数即为该稀释度样品的对应国际单位值。打开计算机，进入Microsoft选择Excel表，输入数据，插入稀释度，选定A、B两条，按E键头选其他函数(F),选L0G10,确定，圈定数据，拉相应的表格数，算出L0G10。再选定A、B制图表选散点图/完成，点图上三角点按右键，添加趋势图/选项/显示公式(E)，显示R平均值/确定。将样品的A值取对数后带入标准品的直线方程中进行计算，所得X值即为该稀释度样品相当于标准样品的稀释度的对数值。将该值乘以样品的稀释倍数(若为负值则先反对数,乘以稀释倍数后再取log值)后代入公式计算出Y值，样品的国际单位(E-NIH)-(所得Y值X标准品国际单位+从直线方程得出的标准品原倍的A值)X0.9272+0.6105。5、效力测定法(NIH法)首先进行攻击毒株的制备。攻击毒株(CVS)由国家药品检定机构提供。启开冻干毒种，稀释成1(T悬液，用体重ll13g小鼠，脑内接种0.03mL，连续传23代。收脑时应选择45日有典型狂犬病症状小鼠。将鼠脑研磨并加入适量含正常马血清或小牛血清蒸馏水，制成20%悬液，经1000r/min沉淀IO分钟，经用体重1820g小鼠10只做病毒滴定及无菌试验，符合要求后，方可做攻击毒用。分装小管，-6(TC保存。参考疫苗由国家药品检定机构制备、分发。用待检疫苗对小鼠进行免疫处理。取同批异常毒性试验合格疫苗，用PH7.6、0.07mol/L的PBS做5倍系列稀释，一般采用三个稀释度以上进行免疫，1:5、1:25、1:125等的稀释度。同时，参考疫苗作l:25、1:125、1:625等稀释度，选用体重1214g小鼠，每个稀释度至少免疫16只，每只腹腔接种0.5mL，间隔l周后再免疫一次，免疫时将疫苗保存于冰浴中，各组小鼠应在同样条件下饲养，并预留40只同批小鼠作待测攻击病毒用。用攻击毒株(CVS)对小鼠进行攻击。在小鼠第1次免疫后14天，用预先测定每0.03mL含5100LD5(,的病毒量脑内攻击0.03mL/只。病毒测定用1、10—1、10—2、10—3，每稀释度不少于8只，疫苗免疫组小鼠，每个稀释度为16只，所有小鼠自攻击之日起观察14天。攻击后最初4日内死亡的小鼠不作统计，第5日后死亡和呈现典型狂犬病症状的小鼠进行计算统计。对结果进行计算。先测定各免疫组的ED5。值。疫苗效力的计算按照公式计算。疫苗效力=(待测疫苗的ED5fl)/(参考疫苗的EDS)X(待测疫苗niL/剂)/(参考疫苗mL/剂)X国家参考疫苗效价(IU)6、样品蛋白质含量测定(Lowery法)采用经典的蛋白质的含量测定方法Lowery法。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。首先配制标准蛋白质溶液的，取蛋白国家标准品一支，用水定量稀释至每lmL含lmg，作为IC备液。量取贮备液2.5mL置25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为每lmL含100Ug的标准蛋白质溶液。然后量取一定体积供试品(含蛋白质50Pg左右)置试管内。同样称取标准蛋白质溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、l.OmL分别置于试管中，并包括空白对照。分别加水至lmL,加碱性铜溶液5mL，摇匀，室温放置10分钟，快速加入酚试剂0.5mL，摇匀，室温放置30分钟，显色后，波长在650nm处测定吸光度。。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品蛋白质含量。蛋白质含量"g/ml)=_测宗结粜X稀释倍教取样量7、非还原性10%SDS-PAGE电泳对杂蛋白分析由于病毒颗粒性质关系，仅能对样品中杂蛋白分子量进行分析。首先制备10%SDS-PAGE分离胶，然后将样品15000r/min离心10min,取上清液.然后取40"上清液，加入10ul五倍上样缓冲液后混匀，上样15ug样品，当样品在浓縮胶中时，调节电压使电流为10-12mA。当溴酚兰前沿进入分离胶后，调节电压使电流20-30mA。继续电泳至溴酚兰前沿接近分离胶底部3-5mm时，将胶放入考马斯亮兰染色液中染色30min,经过脱色处理后，利用分析软件进行分析处理。8、残余DNA含量的检测首先进行样品的DNA提纯。将待检样品用0.5mL注射用水复溶。取2^蛋白酶K溶液4.5jli1于每个样品对应的离心管内。取10mg/mLRNase酶2pl于每个样品对应的离心管内。取Tris-HclEDTA(pH8.0)缓冲液lOpl于每个样品对应的离心管内。取12.5%SDS10W于每个样品对应的离心管内。取500pl样品于每个样品对应的离心管内，用封口膜封口后将样品混匀，放在泡沫板上。将样品放在37'C恒温水浴锅水浴1小时。取出样品将样品放在5CTC恒温水浴锅水浴3小时。取出后加Tris饱和酚500nl，用旋涡混合器混合lmin左右，混匀，放入离心机中以12500r/min，离心15min。离心后取其上清置入相对应的2mL离心管内，注意吸取时不要吸取到杂蛋白。取4MLiC150nl于每个样品对应的离心管内。取冷无水乙醇lmL于每个样品对应的离心管内，用封口膜将管口封好，用手混匀，放在-2(TC冰箱内过夜。然后进行标记探针。取DNA标准品9pl置入0.5mL离心管中，取灭菌注射用水15pl于每个样品对应的离心管内，用封口膜封好管口，煮沸10分钟。取出立即冰浴5分钟后，从冰浴中取出，放入离心机中离心。从-2(TC冰箱中取出地高辛引物(DIG匿HighPrime)1#瓶，取地高辛引物(DIG-HighPrime)6^1(使地高辛引物与标记探针液混合液比为1:4)置入冰浴后的离心管中，混匀，用封口膜封好口，放在泡沫板上在37'C水浴中过夜。然后探针终止取0.5M(pH8.0)EDTA3ulpl、4MLiC13^1、冷无水乙醇150pl加入标准DNA管中，混匀，用封口膜封好管口，放入-2(TC冰箱中，过夜。将样品管和探针管放入离心机中，以12500r/min，离心15min，离心后将样品和探针上清液小心倾于一废液缸内。在每个离心管中加70%冷乙醇15(^1复洗，将样品管和探针管放入离心机中，12500r/min,离心5min。吸出乙醇，注意留管底白色物质，离心帽打开，室温风干一段时间。将DNA标准品进行稀释处理。取标准DNA做7个稀释度，依次由100ng，10ng，lng,100pg，10pg，lpg和O.lpg共7管。根据DNA标准品的DNA含量在标100ng管中加入适量TE稀释DNA标准品含量至100ng。从100ng管中取5^1液体加入10ng管中，在以下每个稀释度管中均加45plTE缓冲依次倍比稀释至0.1pg。将DNA标准品管、探针及样品管上各扎一孔，放入沸水中煮沸10min。取出，立即冰浴，放入冰箱中。进行抽滤、点膜及DNA固定。取出真空泵、点样板，用螺丝拧紧点样板，将点样板左侧用管子连接到真空泵的进气口中，管道中连接一个三角瓶。取一培养皿，放入适量水，将剪好的尼龙膜放入平皿中用水润湿后，用平头镊子夹取尼龙膜放在点样板上。剪取适当大小的封口膜盖在点样板上暴露部位，防止漏气。打开真空泵，将膜吸在点样板上。取样品适量点于尼龙膜上，第二排起点样品，注意要一滴一滴点在尼龙膜上，枪头接近尼龙膜，但不要接触尼龙膜。取等体积DNA标准品按浓度从高到低的顺序点在尼龙膜上，第一排和最后一排点阳性。用剪刀将尼龙膜左上角剪掉一角，用铅笔在尼龙膜上标记好样品范围。用平头镊子将尼龙膜夹起放在滤纸中。将尼龙膜放在紫外灯下固定15min。然后进行杂交处理。从-2(TC试剂盒中取杂交液7#瓶，(杂交液需在37t:水浴锅中预热5分钟)倒入烧杯中，向烧杯中加64mL无菌水及一磁力搅拌棒，将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌，待溶解后，即为预杂交液。用吸管取10mL预杂交液于平皿中，将剪好的尼龙膜放入平皿中，将平皿放入混旋仪中，设定58'C放置30min。用镊子取出尼龙膜，将平皿中的预杂交液倒掉，在平皿中用吸管加入lOmL预杂交液，将探针液全部加入平皿中，混匀，用镊子将尼龙膜放入平皿中，将平皿放入旋混仪中，58t:过夜。洗膜处理。另取一新的平皿，加入稀释好的2XSSC液体适量，将尼龙膜从旋混仪中取出放入盛有2XSSC液体的平皿中，放在脱色摇床上，室温洗涤5min，将液体倒掉，另加入2XSSC液体于平皿中，再洗5min。将尼龙膜取出放在平皿上，将2XSSC液倒掉，加入配好的0.5XSSC液体将膜放在平皿中，放入旋混仪中，58。C洗涤10min10r/pm，洗涤2次，中间换一次液体。平衡处理。将膜取出，液体倒掉，用已配制好的BufferI润洗平皿，将BufferI倒入平皿，将膜放入平皿中，放在脱色摇床上，室温平衡5min。封闭处理。取封闭液6#瓶4000|^1，倒入一容器内，加Bufferl至40mL，即二者体积比为1:9。也就是将封闭液作IOX稀释。将膜取出，液体倒掉，在平皿上加入已稀释好的封闭液，将膜浸入平皿中，将平皿放在摇床上，用报纸盖好，封闭30min。抗体结合，将膜取出，液体倒掉，取12mL已稀释好的封闭液加入平皿中，取抗体5pl(抗体应为3pl，样品多可多取些)加入平皿中，混匀，将膜浸入，放在脱色摇床上，盖张报纸，室温一小时。注意V抗体V已稀释封闭液=1:4。洗膜，另取一平皿，倒入40mLBufferl，取40^1吐温20加入平皿中，混匀，适量放入平皿中，洗涤两次，每次15分钟(V吐温20:VBufferI=1:1000)。将BufferIII倒入平皿中，将膜浸入，放在摇床上，室温平衡5min。取出显色剂5#瓶，取显色剂45(^1放入平皿内，再加12mLBuffer111，混匀，将膜放入平皿中，要轻拿轻放，尽量不要摇动，避光，静置放12小时。终止显色。加TE缓冲液终止显色5分钟。用镊子将膜取出，液体倒掉，用灭菌水润洗平皿，在平皿中倒入适量水，将膜放入平皿中，轻轻洗涤后将水倒掉，将尼龙膜放在滤纸上尽量把水吸干。取出尼龙膜，放入塑料袋中，用封口机将尼龙膜封在塑料袋内，保存。实施例二1、利用截留分子量为750KD或500KD的超滤膜对病毒收获液进行浓縮和部分杂质的去除操作过程与参数与实施例一步骤l相同，故略。2、用分子筛凝胶6%交联度高流速琼脂糖凝胶过滤(SepHarose6FF)对步骤1所得样品进行提取准备实施例一所说的一根层析柱或将该层析柱裁成四根串联成四联柱,则每根层析柱为26X175mm，每根柱体积32.5mL。最好是采用成四根串联成四联柱。余下操作过程与实施例一步骤3相同，故略。3、用阴离子交换凝胶高流速四价氨基琼脂糖(QSepHaroseFF)对步骤2所得样品进行提取操作过程与实施例一步骤2相同，故略。图1的附图标记说明M:Marker1:病毒浓縮液(未洗脱前)，2:病毒浓縮液样品(第1次洗脱)，3:病毒浓縮液样品(第2次洗脱)，4:病毒浓縮液样品(第3次洗脱)，5:病毒浓縮液样品(第5次洗脱)，6:病毒浓縮液样品(第7次洗脱)，7:病毒浓缩液样品(第9次洗脱)，8:病毒浓縮液样品(第10次洗脱)，9:病毒浓縮液样品(第12次洗脱)，10:病毒浓縮液样品(第14次洗脱)，11:病毒浓縮液样品(第16次洗脱)，12:病毒浓縮液样品(第18次洗脱)，13:病毒浓縮液样品(第20次洗脱)，14:病毒浓縮液(洗脱后)。权利要求1.一种提取狂犬病病毒的方法，其特征是(1)、利用截留分子量为750KD或500KD的中空纤维超滤柱或超滤膜将病毒收获液进行浓缩和部分杂质去除；(2)、利用阴离子交换层析或分子筛凝胶层析对步骤(1)所得样品进行分离提纯；(3)、利用分子筛凝胶层析或阴离子交换层析对步骤(2)所得样品进行分离提纯。2、按照权利要求1所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是在利用阴离子交换层析进行分离提纯时，离子交换凝胶类型选择高载量四价氨基琼脂糖阴离子凝胶、高流速四价氮基琼脂糖阴离子凝胶或高流速二乙基氨基乙基琼脂糖阴离子凝胶中的一个。3、按照权利要求1或2所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是利用分子筛凝胶层析进行分离提纯时，凝胶类型选择用分子筛凝胶4%交联度高流速琼脂糖凝胶过滤或6%交联度高流速琼脂糖凝胶过滤。4、按照权利要求1或2所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是当利用分子筛凝胶层析对步骤(l)所得样品进行分离提纯时，准备一根层析柱或将该层析柱裁成四根串联成四联柱。5、按照权利要求3所述的提取狂犬病病毒的方法，其特征是当利用分子筛凝胶层析对步骤(l)所得样品进行分离提纯时，准备一根层析柱或将该层析柱裁成四根串联成四联柱。全文摘要本发明提供了一种提取狂犬病病毒的方法，所要解决的问题是狂犬病病毒疫苗的提取采用分子筛凝胶层析单一手段，存在以下缺陷不同批次间质量指标差异较大；残余DNA的去除成为难题；残余宿主蛋白含量过高，临床表现副作用较大。本发明的要点是利用截留分子量为750KD或500KD的中空纤维超滤柱或超滤膜将病毒收获液进行浓缩和部分杂质去除；利用阴离子交换层析或分子筛凝胶层析对样品进行分离提纯；利用分子筛凝胶层析或阴离子交换层析对步骤(2)所得样品进行分离提纯。本发明的特点是具有生产能力大，产品质量高，批次稳定性好，对残余DNA、HCP去除表现尤为突出，减少了疫苗的安全隐患。文档编号C12R1/93GK101270350SQ20081001053公开日2008年9月24日申请日期2008年3月5日优先权日2008年3月5日发明者伟刘,译张,静徐,伟李,艳李,胡金东申请人:辽宁依生生物制药有限公司