专利名称：：外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法
技术领域：
：本发明涉及外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法，属于农业生物
技术领域：
。(二)
背景技术：
生物入侵往往会对一个国家或地区的经济安全、生态安全、社会安全构成威胁。我国每年因生物入侵造成的直接经济损失达数千亿元，其中紫茎泽兰、松材线虫等13种外来物种，每年给农、林、牧、渔业生产造成的经济损失就达574亿元。当前，外来入侵我国的烟粉虱(B型)在广大地区暴发成灾，它是国际科技界有史以来唯一冠以"超级害虫"称谓的世界性入侵昆虫，它不仅直接吸取植物汁液、分泌蜜露影响植物光合作用，而且可传播110多种病毒病，每年给被入侵地区的农业生产造成巨大的经济损失；此外，它还能竞争取代土著烟粉虱或其他土著昆虫，影响生态系统。深入研究外来入侵物种的灾变机制及其防控技术是科学应对生物入侵这一世界性难题的基础与关键。目前，针对一种农业害虫而召开的国际会议并不多，而国际烟粉虱大会迄今为止已召开了4次。近年来，内共生菌对B型烟粉虱的影响及其机制成为了国内外烟粉虱灾变机制研究的热点问题之一，这对于利用内共生菌控制烟粉虱(B型)种群具有重要的潜在价值。由于内共生菌不能体外大量培养，同时烟粉虱成虫与伪蛹个体较小(<lmm)，这成为内共生菌与烟粉虱互作研究及其利用技术的瓶颈。正是由于上述技术瓶颈的存在，长期以来，国内外对烟粉虱内共生菌的研究均采用抗生素处理的方法证实内共生菌对宿主烟粉虱的适合度影响。这种方法存在多种缺点，例如1)抗生素抑制而不能根除目的内共生菌，而且是抑制所有的内共生菌，从而不能确定具体某个内共生菌的生物学功能；2)不能将目的内共生菌转入烟粉虱种群，因而阻碍了对内共生菌潜在利用价值的研究。实验过程中，使用固定棒固定其他昆虫的方法对于微型昆虫不合适，因为微型昆虫个体容易滑动；双面胶固定其他昆虫的方法对于微型昆虫不合适，因为双面胶容易粘住这些昆虫导致其死亡。因此，如何将外源内共生菌及时有效的转染到烟粉虱体内，是当前内共生菌与烟粉虱互作及其利用研究中迫切需要解决的问题。此外，目前国内外进行烟粉虱其他试验如RNAi注射试验时，采用麻痹后的烟粉虱成虫，而烟粉虱成虫苏醒快，不好固定，且固定后的烟粉虱成虫容易死亡，这也是影响对烟粉虱进行实验过程中需要解决的问题。(三)
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供了一种将外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法。本发明中外源内共生菌向烟粉虱水平转染的技术体系是将米蛾(Cwcyrac印/w/om-c")内共生菌沃尔巴氏体(Wo/kK^&)离体纯化后，利用显微注射技术转染到烟粉虱体内，生物学研究表明该内共生菌能够垂直传播。名词注释SPG缓冲液为218mM蔗糖，3.8mMKH2P04，7.2mMK2HP04，4.9mML-谷氨基酸，混合配置的缓冲液，pH=7.2。一种将外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法，包括外源内共生菌沃尔巴氏体(『0/6aCWa)的制备、烟粉虱伪蛹受体的制备、注射、注射后烟粉虱伪蛹受体的培养，其特征在于，烟粉虱伪蛹受体的制备具体步骤如下将双面胶一面贴在洁净的载玻片上，在双面胶的边缘切除约lmm的胶纸，露出lmm的胶面；采集烟粉虱伪蛹并背部向上固定在该胶面上，即得烟粉虱伪蛹受体。优选的，所述外源内共生菌沃尔巴氏体(『0/^cW")的制备具体步骤如下-将米蛾的卵利用SPG缓冲液漂洗4-8次；在灭菌管中，使用SPG缓冲液将米蛾的卵进行匀浆，300g离心5-10min,将上清液转移到干净的0.2mL灭菌管中，12000g离心10-20min，除去上清液，用SPG缓冲液将沉淀悬浮并在300g离心5min，取上清夜，即为纯化的内共生菌，将纯化的内共生菌在室温下保存备用。优选的，所述的注射步骤具体如下.-取直径小于20iam的针头；在IM300注射仪上将制得的外源内共生菌沃尔巴氏体分别注射入制得的烟粉風伪蛹受体内，得水平转染后的烟粉虱伪蛹。优选的，所述注射后烟粉虱伪蛹受体的培养的具体歩骤如下将水平转染后的烟粉虱伪蛹放于恒温27'C、湿度(RH)60%-80%的气候培养箱中；培养24小时，然后采集羽化成虫；更优选的，外源内共生菌沃尔巴氏体(『0//7&)的制备步骤中，所述的室温保存时间为0-5小时。一种内共生菌沃尔巴氏体(恥/k/c/n'")在防治烟粉虱中的应用。上述步骤中，除特殊说明外，均采用本领域常规技术。通过本发明方法可得到含有外源内共生菌沃尔巴氏体(^W6ac/7/a)的烟粉虱，并可以建立后代种群，该种群可以垂直传播。本发明首次选择烟粉虱的伪蛹作为注射的受体，解决了长期以来使用成虫作为注射虫态不易注射的缺点；首次创立了微型昆虫的伪蛹固定方法，克服了使用固定棒虫体容易滑动的问题和双面胶容易粘住成虫的缺点，使得注射后的虫体成活率和外源内共生菌感染率大大提高。本方法简单、快捷，构建的体系能够满足沃尔巴氏体(『0/ZwcW")与烟粉虱互作机制研究的需求，为利用沃尔巴氏体(肠/^c/7/")以及其他内共生菌控制烟粉虱种群或利用RNAi技术研究烟粉虱种群提供了良好的技术平台。(四)图1是带有双面胶未黏附烟粉虱伪蛹的载玻片；图2是黏附有烟粉虱伪蛹的载玻片侧视图；其中1、载玻片，2、双面胶，3、烟粉虱伪蛹，4、双面胶纸面，5、双面胶胶条。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护内容不仅限于此。实施例1:一种将外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法，包括外源内共生菌沃尔巴氏体(『0/k/A/")的制备、烟粉虱伪蛹受体的制备、注射、注射后烟粉虱伪蛹受体的培养，具体步骤如下以米蛾的卵为共生菌沃尔巴氏体(『o/6ac/'a)的供体，将30|aL米蛾的卵放在200uL灭菌管中，用100uL的SPG缓冲液(218mM蔗糖，3.8mMKH2P04，7.2mMK2HP04，4.9mML-谷氨基酸，pH7.2)漂洗4次；在0.2mL的灭菌管中，使用100uL的SPG缓冲液将卵进行匀浆，300g离心5min将上清液转移到新的管(0.2mL)中12000g离心10min'离心后上清液去除，将沉淀使用SPG缓冲液重新悬浮；将悬浮液300g离心5min，取上清液，室温保存用于注射使用；5h内注射；烟粉虱伪蛹受体的制备，具体步骤如下-将双面胶一面贴在洁净的载玻片上，在双面胶的边缘切除约lmm的胶纸，露出lmm的胶面；采集烟粉虱伪蛹并背部向上固定在该胶面上，即得烟粉虱伪蛹受体。如图2所示;使用拉针器(NarishigePN—30,NarishigeScientificInstrumentLab.，Tokyo,Japan)将拉针(TW100F4，WorldPrecisionInstruments,Inc.,SarasotaFL)拉出针头，磨针使针头小于20pm;在IM300注射仪(NarishigeScientificInstrumentLab.，Tokyo,Japan)上进行注射；将注射后个体放于保湿的培养皿中，并放置在恒温27'C、湿度(RH)60%-80%的气候培养箱中；培养24小时，然后采集羽化成虫；使用这种方法获得的蛹的羽化率比改进前方法提高了55.5%(表1)。表l不同固定方法得到的蛹的羽化率比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>内共生菌的检测，具体歩骤如下恒温27。C，湿度(RH)60%-80%的气候培养箱中，将羽化的成虫饲养于寄主植物上的微虫笼中；利用优化的技术体系(表2)进行生物学研究，并对成虫(表3)其后代(表4)进行内共生菌的检测。表2经过不同的处理方法后的存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>通过大量试验，我们发现羽化率的高低估计是与注射蛹的龄期大小、注射针的针头直径以及培养温度有关，蛹的龄期越大，注射后的羽化率越高；针头的直径越小，注射后的羽化率越高；适宜温度能够提供羽化率。因此，烟粉虱蛹的显微注射的基本最适条件为，针头尽量小(《20um);注射蛹最好选择伪蛹(特征为出现红眼的，个体较大)；培养温度最好恒定在20-25'C,变化比较小。沃尔巴氏体注射时间注射蛹数羽化率饲养率(『o化acWa)检测率2007.4.93432,4%(11/34)81.8%(9/11)27.2%(3/11)2007.4.104015%(6/40)66.7%(4/6)0(0/6)2007.4.171032.9%(3/103)66.70/《2/3)100%(1/1)2007.4.184621.7%(10/46)70o/o(7/10)30%(3/10)2007.4.199814.3%(14/98)57.1%(8/14)14.3%(2/14)2007.4.20303.3%(/30)100%(1/1)0(0/1)2007.4.303823.7%(9/38)44.4%(4/9)75%(3/4;)2007.5.3333.0%(1/33)100%(1/1)100%(1/1)2007.5.92222.7%(5/22)60%(3/5)40%(2/5)2007.5.14603.3%(2/60)50%(1/2)50%(1/2)通过上述表格，可以看出羽化率在2.9%-32.4%之间，大部分在20%左右，平均羽化率为14.3%。沃尔巴氏体(Ffo/k/cWa)平均检测率为43.7%。通过本试验可以看出，经过注射的蛹的羽化率与沃尔巴氏体(『0/6"c/7/a)的检测率具有一定规律性的。表4F。产生成虫的数量及成虫沃尔巴氏体(^b你"c/i/fl)感染率饲养寿生Wol有后代蛹羽化数(率)Wol有检测数(感曰期命物无数无染率)(天)型10.102B+5750(87.71%)+10/10(100%)10.1015B+10296(94.12%)+9/10(90%;)10.106B+1511(73.33%)+8/10(80%)通过上述表格，可以看出后代具有较高的感染率80%-100%，这说明该技术能够满足内共生菌向烟粉虱水平转染的研究。权利要求1、一种外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法，包括外源内共生菌沃尔巴氏体的制备、烟粉虱伪蛹受体的制备、注射、注射后烟粉虱伪蛹受体的培养，其特征在于，烟粉虱伪蛹受体的制备具体步骤如下将双面胶一面贴在洁净的载玻片上，在双面胶的边缘切除1mm的胶纸，露出1mm的胶面；采集烟粉虱伪蛹并背部向上固定在该胶面上，即得烟粉虱伪蛹受体。全文摘要一种将外源内共生菌水平转染烟粉虱的方法，属于农业生物
技术领域：
。制备方法包括外源内共生菌沃尔巴氏体(Wolbachia)的纯化，烟粉虱受体的采集与固定，外源内共生菌沃尔巴氏体(Wolbachia)向烟粉虱受体的水平转染，注射个体的采集与饲养，以及内共生菌的检测。本发明简单、快捷，能够成功将外源内共生菌转染到烟粉虱个体中，并且烟粉虱后代具有较高的感染率。文档编号C12N15/87GK101220377SQ200810014040公开日2008年7月16日申请日期2008年1月23日优先权日2008年1月23日发明者斌丛,刘国霞,华方,栋褚,陶云荔申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心