专利名称：弓形虫多表位基因与霍乱毒素ctxa2/b亚基的融合基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合基因，尤其涉及一种弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B 亚基的融合基因(该基因是编码弓形虫多表位肽和霍乱毒素CTXA2/B亚基的核苷酸序 列)，及其在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
背景技术：
弓形虫(7bA^77as历a ^W7力7)是一种细胞内寄生原虫，其能引起人兽共患的 弓形虫病。弓形虫是单细胞生物，但其生活史的复杂性，形态的多样性，入侵宿主 的广泛性，造成其不同性质抗原的免疫性以及致病分子的机制均不相同。目前，弓 形虫病的治疗并无特效药物，研制廉价、安全、有效的弓形虫疫苗无疑是预防和控 制弓形虫病的最好途径。
动物和人体实验均表明，单一抗原成分为基础的疫苗，往往因为其含有的淋巴 细胞结合位点少、受机体主要组织相容性复合体(朋C)限制性比较大，对形态多变、 抗原成分复杂的虫体，难以形成有力攻击。选取某些强保护性抗原中含T淋巴细胞 和(或)B淋巴细胞表位构成的多表位疫苗，是新近发展起来的的疫苗研制趋势。
表位是组成蛋白质的抗原决定簇，是抗原分子表面决定该抗原特异性的特殊化学 基团，即抗原分子表面被抗体或T、 B淋巴细胞特异性结和的部位。 一个抗原可以含 有多个表位，而能够引起免疫应答的只是其中部分表位。而且表位与表位之间的剌激 能力并不相同。凡能够诱发强的免疫反应的表位叫做优势决定簇。如果把不同抗原的
多个优势决定簇组合到一起，能够对免疫机体形成多层次、多特异性免疫保护，远大 于单个抗原的保护力。
多表位基因在对抗原基因成分选择上具有广泛性，并且在具体操作上也因各种 先进的分子生物学手段和完善的基因工程技术而成为可能，因此，选取弓形虫多表 位基因作为诱导宿主免疫应答的主要靶点，具有高度的免疫原性和免疫保护性，此 为制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗奠定了基础。但经检索，关于弓形虫多表位基因 以及与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，及其它们在制备预防和治疗弓形虫病核酸 疫苗中的应用目前还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种弓形虫多表位基因与霍乱 毒素CTXA2/B亚基的融合基因及其制备方法，以及其在制备预防和治疗弓形虫病核酸 疫苗中的应用。
本发明所述弓形虫多表位基因，它具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；其所示
信息为
(a)序列特征
*长度225碱基对
*类型核酸
*链型双链
*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA
(C)假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源弓形虫(7bArop7aana ^ "力7J
(f) 序列描述SEQ ID NO. 1
atgacctgcc cagataaaaa atcgacagcc ggtccggata ctatgaaaag catgcagagg 60 gacgaggaca agggtcctgg agacgtcgtc attg鄉agc tgttcaatcg tataccggaa 120 acaagcgtag gtaacgttgg ttc幼ctgaa gatagtgggc ttacaggcgt caaagactcg 180 tcatccaagg gtattttgcc aaaattaact gagaacccgt ggcag 225
本发明所述的弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，它具有 SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；其所示信息为
(a) 序列特征
*长度740碱基对
*类型核酸
*链型双链
*拓扑结构线性
(b) 分子类型CDNA (C)假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源弓形虫(7b^ A^5ffla 与霍乱毒素(CAoJera towV )
(f) 序列描述SEQ ID NO. 2
atgacctgcccagataaaaaatcgacagccggtccggatactatgaaaagcatgcagagg60
gacgaggacaagggtcctggagacgtcgtcattgaggagctgttcaatcgtataccggaa120
acaagcgtaggtaacgttggttcaactgaagatagtgggcttacaggcgtcaaagaccgt180
tcatccaagggtattttgccaaaattaactgagaacccgtggC3gggt3Ccagtaatact240
tgcgatgaaa3肪cccaaagtctaggtgtaaaattccttgacgaataccaatctaaagtt300
aaaagacaatatttttcaggctatcaatctgatattgatacacataatagaattaaggat360
gaattatgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatg420
cacatggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcaga3t3cc3caac480
3t3CgCt33atataagstaittttcgtatacagaatctctagctggaaaaagag卿tggc540
tatcattacttttaagaatggtgcaatttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatat600
Elg3ttC3C33aaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttac660
tgaagctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgc720
aattagtatggcaaattaa740
本发明设计的弓形虫多表位基因所选取的基因片段为弓形虫速殖子、缓殖子的
T、 B细胞表位，作为诱导宿主免疫应答的主要耙点，具有高度的免疫原性和免疫保 护性。
具体地讲是从弓形虫基因组中优选了 5个高度保守的HLA识别多肽，并在各表位间用甘氨酸和脯氨酸分割以保证各表位基本独立。本发明设计的弓形虫多表位基因不 但包含了具有T、 B细胞刺激功能的保护性表位，还加入了CpG岛基序，有助于细胞 免疫功能的发挥和T、 B细胞间的协同作用。经过生物信息学分析，此多表位基因具 有高度的抗原性，为诱导高效的免疫应答打下了良好的基础。
本发明所述的弓形虫多表位基因由invitrogen公司一次性合成。 本发明所述的弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因是通过聚合 酶链反应(PCR)扩增获得的
首先，根据弓形虫多表位基因(MEG)与霍乱毒素基因(CTXA2/B)设计两对引物
为
MEG: Pl: 5， -CG GGATCC MGCTT ATG ACC TGC CC-3，
P2: 5， - GGTACC CTG CCA CGG GT-3，
CTXA2/B: P3: 5' - GGTACC AGT AAT ACT TGC GA-3'
P4: 5， -AC GAA TTC TTA ATT TGC CAT AC-3，
分别扩增弓形虫多表位基因MEG与霍乱毒素CTXA2/B基因片段。再以这两个基因为 模板，以P1和P4为引物进行第二次PCR反应得到MEG"CTXA2/B融合基因。
PCR反应条件为:94"C预变性5min, 9化,60s;551C, 30s， 72^C60s, 30个循环, 最后72iC延伸10min。扩增完毕，产物经1%琼脂糖电泳、EB染色后，紫外透射仪上观 察结果。用Qiagen公司胶回收试剂盒回收目的基因片断。
取上述纯化产物克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa公司产品)，转化DH5a细胞(常用载体 宿主细胞)，平板培养；提取并纯化质粒，扩增质粒并测序。
本发明所述弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因在制备具有免 疫原性的融合蛋白中的应用，进一步地在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
通过基因重组技术使所述融合基因在Hela细胞中进行表达，即获得具有免疫原性 的重组蛋白。
如将获得的弓形虫多表位与霍乱毒素A2/B亚基融合基因克隆到pVAXl (Novagen 公司)表达载体，脂质体Cellfectamine 2000介导重组真核表达质粒pVAXl-MEG转 染Hela细胞。表达蛋白的SDS-PAGE电泳和Western Blotting分析结果表明 pVAXl-MEG-CTXA2/B质粒瞬时转染的细胞在约40KDa处有一反应带，可以被鼠抗弓形 虫血清抗体识别，而其他各组和未经转染的Hela细胞则无条带显色，从而证实了表 达重组蛋白的抗原特异性。
由于表位多肽分子小，免疫原性较弱，且为直链结构，三维空间结构与完整蛋 白不同；在体内半衰期短，难以刺激机体产生有效的免疫应答。研究证实，霍乱毒 素(CT)经基因融合技术与不相关抗原形成偶联蛋白或融合蛋白时的免疫佐剂作用 大大增强。本发明采用弓形虫多表位基因与A,毒性亚基缺失的霍乱毒素(CT)基因 联合构建一种融合基因的方案，不仅能有效增强多表位基因的免疫原性，还能尽量 减轻霍乱毒素(CT)的毒副作用，从而增强机体的免疫作用。
利用本发明的融合基因通过现有基因工程方法可以构建弓形虫核酸疫苗，用于弓形 虫的预防和治疗。
实验证实:利用本发明的融合基因通过现有基因工程方法构建的重组融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗BRD509/pVAX1-MEG-CTXA2/B实验组小鼠特异性IgG、IgA抗体水平 及脾细胞增殖活性和NK细胞活性均有显著提高，与BRD509、 BRD509/pVAXl对照组及无 CTXA2/B基因佐剂实验组相比均有显著提高(P〈0.05)，提示该重组融合基因构建的减 毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗口服免疫后可激发小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫反应。免 疫鼠抗攻击感染实验显示对照组的小鼠包括BRD509和BRD509/pVAXl 口服免疫组小鼠都 于攻击感染后6天内死亡。实验组中携带CTXA2/B基因佐剂的BRD509/pVAXl-MEG "CTXAyB 口服免疫组较BRD509/pVAX1-MEG 口服免疫组的生存时间大大延长(p<0.05), 而且到16天仍有40%的生存率。表明本发明的融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌口 服疫苗可有效地保护小鼠抵抗弓形虫速殖子的攻击，是一种理想的弓形虫口服疫苗。
图1.融合基因重组质粒pVAXl-MEG"CTXA2/B的构建及鉴定 其中Ml.核酸(DNA)分子量标准(Marker)
1. 融合基因重组质粒pVAXl-MEG"CTXA2/B EcoRI单酶切产物
2. 融合基因重组质粒pVAXl-MEG~CTXA2/B HindDI/ EcoRI双酶切产物
3. MEG的PCR产物
4. CTXA2/B的PCR产物
M2.核酸(DNA)分子量标准(Marker). 图2.融合基因真核表达产物的Western-blotting分析 其中M.蛋白分子量标准(Marker)
1. 融合基因在Hela细胞中的表达
2. 无转染Hela细胞。 图3.免疫鼠血清IgG抗体测定。 图4.免疫鼠血清IgA抗体測定。
图5.MTT法免疫鼠脾淋巴细胞增殖活性的測定。 图6.免疫鼠NK细胞杀伤活性的测定。 图7.免疫鼠抗弓形虫感染的生存曲线。
具体实施例方式
实施例l弓形虫多表位抗原基因片段的获得 1.弓形虫多表位抗原基因选择和设计
从弓形虫速殖子期特异性抗原SAGl及速殖子缓殖子两期共有抗原ROP2、 GRAl及 GRA4中选取含T和(或)B细胞表位的共5个抗原片段，分别是相当于弓形虫速殖子表面 抗原SAGl的59-67位氨基酸的肽片段和246-256位氨基酸的肽片段；相当于弓形虫棒 状体ROP2的199-216位氨基酸的肽片段；相当于弓形虫致密颗粒蛋白GRAl的176-186 位氨基酸的肽片段；相当于弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的235-245位氨基酸的肽片段； 此外为了进一步提高本研究中复合多肽的免疫原活性，加入了 CpG基序。借助甘氨酸和 脯氨酸接头将表位肽连在一起。多基因序列命名为MEG。
弓形虫多表位基因的来源见下表 Code Source Contained epitopes~
SAG1-I TCPDKKSTA SAGl(59-67) T- and B-cell epitopes
SAGl-II ILPKLTENPWQSAGl(246-256) T- and B-cell epitopesGRA1 DTMKSMQRDED GRA1(176-186) T- and B-cell印itope
R0P2 PGDWIEELFNRIPETSV ROP2(199-216) T-cell epitope GRA4 SGLTGVKDSSS GRA4(235-245) T- and B-cell印itope
2. 弓形虫多表位抗原基因的生物信息学分析
用DNAstar软件对弓形虫多表位基因所编码氨基酸蛋白的二级结构、结构域、跨膜 区域、亲水性及蛋白质骨架区的柔韧性进行预测分析。
3. 弓形虫多表位抗原基因的合成
由irwitrogen生物技术有限公司一次性合成，其序列如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列。
实施例2 MEG-CTXA2/B融合基因的获得 引物设计与合成
MEG: PI: 5' -CG GGATCC AAGCTT ATG ACC TGC CC_3，
P2: 5' - GGTACC CTG CCA CGG GT-3， CTXA2/B: P3: 5, - GGTACC AGT MT ACT TGC GA-3，
P4: 5' -AC GAA TTC TTA ATT TGC CAT AC-3， 由invitrogen生物技术有限公司合成，
1) 以PI和P2, P3和P4为引物，MEG和CTX基因序列为模板，扩增MEG和CTXAJB 基因。PCR扩增体系为IOX不含Mg" buffer扩增缓冲液5l4, MgCl2(25mM) 4(4, dNTPs(lOraM) 上下游引物各1W，上述MEG和CTXA2/B基因各lri， TaqDNA聚合 酶(5u/W) 0. ,加灭菌水至50ri 。
反应条件94"预变性5min, 94t:, 60s: 55"C, 30s; 72X:, 60s; 30个循环，最 后72C延伸10min。扩增完毕，产物经1%琼脂糖电泳、EB染色后，紫外透射仪上观察 结果。用Qiagen公司胶回收试剂盒回收目的基因片断，
2) 以回收的MEG和CTXA2/B为模板，以Pl和P4为引物进行PCR反应 PCR扩增体系为10X不含Mg"buffer扩增缓冲液，MgCl2(25mM) , dNTPs (10mM)
1W,上下游引物各1W，上述MEG和CTXA2/B基因各2W, TaqDNA聚合酶(5u/ri〉0. 5|4, 加灭菌水至5(￥1。
反应条件94。C预变性5min, 94°C, 60s: 55卩，30s; 72°C， 60s; 30个循环，最 后72'C延伸10min。扩增完毕，产物经1%琼脂糖电泳、EB染色后，紫外透射仪上观察 结果。用Qiagen公司胶回收试剂盒回收目的片断。
3) PCR产物的克隆和序列分析
采用TA克隆方法克隆PCR产物，并将克隆转化菌株送公司进行测序。
实施例3重组融合基因表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达 1.重组质粒的构建
将融合基因扩增(PCR)产物经1.0%琼脂糖电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T 连接，转化大肠杆菌DH5a,提取质粒，分别用HindlII/EcoRI双酶切，1.0%琼脂糖凝 胶电泳鉴定。将含目的基因的pMD-18T载体及表达载体pVAXl(购自Invitrogen公司)双酶切， 酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠 杆菌DH5a感受态，用Omega公司质粒提取试剂盒提取重组质粒，进行酶切、PCR鉴定 和测序分析，见图l。
2.脂质体Cellfectamine 2000介导重组真核表达质粒pVAXl-MEG"CTXA2/B转染 Hela细胞
(1) 转染前一天，胰酶消化生长状态良好的Hela细胞，显微镜下计数，按1 3X105 细胞/孔传至24孔板，以使次日转染时，细胞达到90 95%丰度。每孔加入0.5ml完全 培养基。
(2) 转染在无血清无抗生素的1640培养基中进行，反应体系如下
A,液取pVAXl-MEG-CTXA2/B质粒DNA 5 n 1 (0. 8 1. 0 y g)，与50n 1无血清无抗 生素的1640培养基混合(实验组)；
&液取pVAXl (-)质粒DNA 5ix 1 (0.8 1. On g)，与50ix 1无血清无抗生素的1640 培养基混合(对照组)；
B液取Cellfectamine 2000 2 u 1与50P 1无血清无抗生素的DMEM培养基混合， 室温孵育5分钟；
将A液与B液轻轻混合，轻弹管壁混匀，室温下放置不超过5分钟，以形成DNA-脂质体复合物。
(3) 同时，用无血淸无抗生素的1640培养基洗细胞3次，每孔再加入100ii 1的无血 清无抗生素的1640培养基。
(4) 复合物形成后，将其加入孔内，注意不要直接加到细胞面上，将培养板前后轻轻 晃动使分布均匀。37汇孵育4~6小时，期间每隔半小时轻晃24孔板，让cellfectamine 均匀分布.
(5) 将转染液移去，用无血清无抗生素的1640培养基洗细胞1次，换为1640完全培 养基2ral， 371C, 5% C0i培养48小时。
(6) 瞬时转染
转染48小时后，分别收集实验组(重组质粒pVAXl-MEG-CTXA2/B的Hela细胞)和对 照组(pVAXl空质粒转染的Hela细胞)，即为瞬时转染的细胞。首先吸去培养上清，用 灭菌PBS漂洗细胞2次，用胰酶消化细胞，加入4mlPBS,每两孔收集到一个无菌10ml 离心管中，800rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用400 u 1 PBS重悬，移至灭菌EP管中， 加100ul 2XSDS-凝胶加样缓冲液，混匀，IOO'C煮沸IO分钟，裂解细胞，-7(TC冻存 样品，备用。
(7) 上样行SDS-PAGE凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜，进行Western-Blotting 分析。 一抗采用鼠抗弓形虫血清抗体对表达蛋白进行抗原性测定。见图2
实施例4重组融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗的构建 将1 P 1待转化质粒pVAXl-MEG-CTXA2/B加至100 u 1减毒鼠伤寒沙门氏菌 S.BRD509感受态，温和混匀后，将混合物移至预冷的无菌电转化杯中，电转化条件 电压2500V,电容25nF,放电时间5ms。向转化混合物中加入600 u 1 LB培养基，37 'C温和振荡培养30分钟，取100ul涂板，37'C培养过夜。挑取转化克隆，提取质粒，酶切和PCR鉴定。取阳性菌落分别接种到2ml LK培养 基中，过夜振荡培养，次日按1:100比例加入到100ralLA培养基中，继续震荡培养到 ODeoo为0. 8，然后用NS洗涤和沉淀菌体，调整浓度为1-5X 109cfu。
pVAXl和pVAXl-MEG质粒同时转化减毒鼠伤寒沙门氏菌S. BRD509感受态，作为对照。
实施例5动物实验
将SPF级BALB/c鼠随机分成4组，每组10只，分别为BRD509对照组、BRD509/pVAXl 和BRD509/pVAX1-MEG和BRD509/pVAX1-MEG~CTXA2/B免疫组。免疫前4h小鼠禁水禁食， 在口服100 u 1 10%NaHCO3 30min后，将在LA培养基中过夜培养到l为0.8的重组沙 门氏菌菌液离心并重悬于NS中，每只小鼠经胃灌入200ul K)9cfu的菌液。每2周免 疫l次，共3次。分别于每次免疫前和免疫后2周、4周尾静脉或眼底取血分离血清， 用梯度稀释ELISA法测定免疫鼠血清IgG及IgA抗体水平。免疫后4周取鼠脾脏分离脾 细胞，MTT法进行脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性测定。免疫后6周，每只免疫小鼠经 腹腔注射0.1mll07ml弓形虫RH株速殖子，每组5只，观察小鼠抗攻击感染的存活时 间。
检测结果如图3-6所示。
重组融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗BRD509/pVAX1-MEG"CTXA2/B实验组小鼠特 异性IgG、 IgA抗体水平及脾细胞增殖活性和NK细胞活性均有显著提髙，与BRD509、 BRD509/pVAXl对照组及无CTXA2/B基因佐剂实验组相比均有显著提高(P<0. 05),提示 该重组融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗口服免疫后可激发小鼠产生很强的体 液免疫和细胞免疫反应。
免疫鼠抗攻击感染实验显示对照组的小鼠包括BRD509和BRD509/pVAXl口服免疫组 小鼠都于攻击感染后6天内死亡。实验组中携带CTXA2/B基因佐剂的BRD509/pVAXl-MEG -CTXA2/B 口服免疫组较BRD509/pVAXl-MEG 口服免疫组的生存时间大大延长(p〈0.05), 而且到16天仍有40%的生存率。以上结果表明该弓形虫融合基因构建的减毒鼠伤寒沙 门氏菌口服疫苗可有效地保护小鼠抵抗弓形虫速殖子的攻击，是一种理想的弓形虫口服 疫苗。序列表
〈110>山东大学
<120>弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因及应用
〈141> 2008-4-30
<160> 2
<210〉 1
<211> 225
〈212〉 cDNA
<213>弓形虫(7bvroA/a5ffla J <221>弓形虫多表位基因 <222> (1)…(225) <400〉 1
atgacctgcc cagataaaaa atcgacagcc ggtccggata ctatgaaaag catgcagagg 60 gacgaggaca agggtcctgg agacgtcgtc attgaggagc tgttcaatcg tataccggaa 120 acaagcgtag gtaacgttgg ttcaactgaa gatagtgggc ttacaggcgt caaagactcg 180 tcatccaagg gtattttgcc aaaattaact gagaacccgt ggcag 225
<210> 2 <211> 740 <212> cDNA
〈221>弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因 <222〉 (1)…(740) <400〉 2
atgacctgcccagataaaaaatcgacagccggtccgg由ctatgaaaagcatgcagagg60
gacgaggacaagggtcctggagacgtcgtcetttgaggagctgttcaatcgtataccggaa120
acaagcgtaggtaacgttggttcaactgaag自gtgggcttac鄉cgtcaaagaccgt180
tcatccaagggtattttgcc幼aattaactgagaacccgtggcagggtaccagtaatact240
tgcgatg肪3tctaggtgtaaaattccttgacgaataccaatctaaagtt300
aaaagacaatatttttcaggcteitcaatctgatattgstacac3t幼tagaattaaggat360
gaattatgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatg420
cacatggaacacctcaaaataLttactgatttgtgtgc￡igasceicaaatat480
atacgctaaatttcgtatacagaatctctagctgg犯ei犯gag卿tggc540
tatcattactttt幼g犯tggtgcaatttttc肪gtsg幼gtaccaggtagtc犯catat600
agattcac幼aa幼犯gcgattgaaaggatg幼ggataccctgaggattgcatatcttac660
tg犯gcta犯gtcgaaaagttatgtgtatgacgcctcatgcgattgccgc720
aattsgtatggc犯att犯740
权利要求
1. 一种弓形虫多表位基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其序列是atgacctgcc cagataaaaa atcgacagcc ggtccggata ctatgaaaag catgcagagg 60gacgaggaca agggtcctgg agacgtcgtc attgaggagc tgttcaatcg tataccggaa 120acaagcgtag gtaacgttgg ttcaactgaa gatagtgggc ttacaggcgt caaagactcg 180tcatccaagg gtattttgcc aaaattaact gagaacccgt ggcag 225
2. —种弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，它具有SEQID N0.2所示的核苷酸序列；其序列是atgacctgcccagataaaaaatcgacagccggtccggatactatgaaaagcatgc卿gg60gacgaggaca3gggtCCtggagacgtcgtcattgaggagctgttcaatcgtataccggaa120acaagcgtaggtaacgttggttcaactgaagatagtgggcttacaggcgtcaaagaccgt180tcatccaagggtattttgccgagaacccgtggcagggtaccagtaatact240tgcgatgaaaaaacccaaagtctaggtgtaaaattccttgacgaataccaatctaaagtt300aaaagacaatatttttcaggctatcaatctgat3ttg3tacacataatagaattaaggat360gaattatgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatg420cacatggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcaga3t3cc3caacacacaaatat480atacgctaaatataagatattttcgtatacagaatctctagctggaaaaagagagstggc540tatcattacttttaagaatggtgcaatttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatat600agattcacaaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttac660tgaagctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgc720aattagtatggcaaattaa740
3.权利要求2所述弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因在制备预 防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种弓形虫多表位基因及其与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，同时还公布了所述基因在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。利用本发明所述融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗可有效地保护小鼠抵抗弓形虫速殖子的攻击，是一种理想的弓形虫口服疫苗。
文档编号C12N15/30GK101302524SQ20081001575
公开日2008年11月12日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者华 丛, 丛海滋, 古钦民, 周怀瑜, 瑛 李, 泉 袁, 赵群力 申请人:山东大学