专利名称：：线粒体测序用26对pcr引物及基于该引物的分型方法
技术领域：
：本发明涉及一种核酸检测方法，特别是一种线粒体全部碱基序列分型及其测定方法，，具体而言是线粒体测序用26对PCR引物及基于该引物的分型方法。
背景技术：
：线粒体(mtDNA)碱基分型，目前最常用的是应用多聚酶链式反应(PCR)扩增出需要的DNA片断，将扩增产物进行直接测序，并根据片段的碱基序列与线粒体标准序列进行比对得到结果。对于PCR产物的直接测序可用PAGE结合银染，以及荧光标记序列仪自动分析系统。对线粒体的研究在国内还集中于线粒体特定高变区，目前国际上线粒体已完成了全部碱基序列测定并予以公布，但在生物医学研究及法医学应用实践中存在以下问题(1)已有的线粒体碱基序列测定方法没有统一的方案，需要人为选择。(2)这些线粒体碱基序列都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)测定而获得的资料，其中有些基因位点，在中国群体的基因频率分布较差，并不能反映出中国群体的线粒体序列特点。(3)国外公布的线粒体测定方法仍在改进，不同实验室之间无法达到结果的标准化。上述缺点限制了线粒体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。
发明内容本发明所要解决的技术问题是，提供适合中国群体的线粒体测序用PCR引物，以及基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法，该方法方便进行中国群体遗传学及法医学应用研究。线粒体是人类第二套基因组，mtDNA具有严格的母系遗传特点，线粒体DNA的突变率高于核DNA的510倍，因此，线粒体DNA与核DNA序列相比，可以在较短进化时期内积累更多的核苷酸变化的信息，在追踪民族起源方面有着其它遗传标记无法比拟的优势，为现代人类的起源、人类迁移规律和进化提供了大量的证据。另外，线粒体DNA全序列仅一万多个碱基，其多态性集中体现在D-环区，仅1100多个碱基，DNA序列测定较为简便，成为法医检案中一种新的检测手段。在法医学个体识别中，通过mtDNA序列分析可实现一定程度的认定作用，尤其在特定人群的个体识别中(空难、遗骸的鉴定)发挥重要作用。本发明提供了一种线粒体测序用26对PCR引物，选用的26对PCR引物覆盖了线粒体基因组全长(表l)，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2针对中国人群重新设计，对中国人群的分型具有针对性；引物24-1对应的扩增片段最小，为420bp;引物22对应的扩增片段最大，为1162bp;所有PCR片段大小适中，均适宜PCR扩增。表lPCR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明所选26对PCR引物已在西安交通大学卫生部法医学重点实验室应用于中华民族群体遗传资料调查，经数据处理证明，应用所提供的26对PCR引物扩增目的片段，通过直接测序的方法可以得到中国人群线粒体全碱基序列资料。另外在新设计引物区域，使用国外己有的线粒体序列测定方法无法获得中国人群稳定的实验结果，显示出中国人群存在独特的线粒体序列特点，根据本发明所述线粒体分型方法得到的结果，实验室已向GENEBANK数据库提交了中国人群线粒体全序列资料共6条(检索号DQ519035、DQ462234、DQ462233、DQ462232、DQ418488、DQ437577)。结果表明，本发明所提供的线粒体测序用PCR引物和基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法完全可以应用在法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面。本发明的另一个技术方案是:基于所述线粒体测序用26对PCR引物的分型方法，其特征在于，包括以下步骤选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成10(VMOL/L，作为母液，取出l(V1稀释到5pMOL/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20^L，含lx反应缓冲液，1.5mMOL/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25nMOL/L引物，200^iMOL/LdNTP，DNA20200ng;引物的PCR扩增基础参数为95'C变性30s，根据PCR引物不同确定退火温度进行30s，72。C延伸60s，共计35个循环；纯化PCR扩增产物；测序反应体系为1(^1，反应混合物中含纯化后的PCR扩增产物10ng、Big-DyeTerminatorReadyReactionmix(ver.3.1，美国应用生物系统公司)0.7|il，测序引物0,3pM;测序PCR条件为96'C变性10秒，50'C退火5秒，60'C延伸4分钟，共循环25次；纯化测序反应产物；纯化后的测序反应产物使用直接测序法检测；将26对PCR引物测序获得的碱基序列拼接得到样本线粒体全碱基序列，将样本碱基序列与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。本发明带来的技术优点是，利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法进行分型，所需仪器和设备及操作均可达到标准化，且方案成熟，适合应用于中国人群。本发明可以填补国内没有实用化的线粒体全序列检测技术和方案的空白，并在中国多个民族中获得满意的结果，利用这种技术制备的线粒体全序列分型试剂盒，可进行商业化生产并推广为国内各个实验室使用。该技术克服了需要人为选择线粒体碱基序列测定方法，对实验人员技术和经验要求较高的缺陷，可以应用于亲子鉴定、个体识别、线粒体遗传致病基因定位、易感基因的检出、发病的分子遗传机理研究、药物的设计及使用等方面，具有广泛的应用前景。图1为线粒体测序用26对PCR引物对应位点示意图。具体实施方式本发明线粒体测序用PCR引物见表1。本发明基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法，利用覆盖线粒体基因组全长的26对PCR引物扩增目的片段，直接测序检观!l，并进行分型。1.设计引物序列PCR引物序列设计参照Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)发布的线粒体标准序列，上下游引物序列见表l。线粒体DNA序列为环形，引物设计策略见图1。选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成100nMOL/L，作为母液，取出10pl稀释至U5^MOL/L，作为工作液。2.PCR扩增PCR反应体系总体积20p1，含lx反应缓冲液，1.5mMol/LMgCl2，0.5U丁aq酶，0.25liMol/L引物，200^Mol/LdNTP，DNA20200ng。使用PE9600扩增仪，PE9700扩增仪(美国应用生物系统公司)，其它类型扩增仪也可以得到较好的结果。目前各种方法提取的DNA模板，均适合线粒体碱基序列的扩增。本实验PCR反应所用试剂均为通用试剂，PCR产物的检测采用常规的方法。PCR扩增参数见表2。表2PCR扩增条件引物名称变性温度/时间退火温度/时间延伸温度/时间循环次数195。C30s54。C30s72。C60s35295'C30s56。C30s72。C60s35395。C30s56。C30s72。C60s35495。C30s54。C30s72。C60s3595。C30s56。C30s72。C60s35695。C30s54。C30s72。C60s35795。C30s55。C30s72。C60s35895'C30s55。C30s72。C60s35995。C30s56'C30s72。C60s351095'C30s54。C30s72。C60s35"95。C30s52。C30s72。C60s351295。C30s56。C30s72。C60s351395。C30s56。C30s72。C60s351495。C30s56。C30s72。C60s3515-195。C30s55'C30s72。C60s3515-295。C30s55。C30s72。C60s3515-395。C30s55。C30s72。C60s351795。C30s56'C30s72。C60s351895。C30s52'C30s72。C60s351995。C30s54。C30s72。C60s352095。C30s57。C30s72。C60s352195。C30s52。C30s72'C60s352295。C30s56。C30s72。C60s352395。C30s52。C30s72。C60s3524-195。C30s53。C30s72。C60s3524-295。C30s58。C30s72。C60s353.PCR扩增产物的纯化使用Multiscreen%PCRpurificationplate(美国密理博公司)纯化PCR扩增产物。4.mtDNA的测序反应反应体系为1(^1，反应混合物中含纯化后的PCR扩增产物10ng、Big-DyeTerminatorReadyReactionmix(ver.3.1)0,7pl，测序引物(使用相应的PCR引物，即相应工作液)0.3pM。测序反应使用PE9600扩增仪，PE9700扩增仪，PCR条件为变性96°C10秒，退火50'C5秒，延伸60。C4分钟，循环次数为25次。5.测序反应后产物的纯化使用酒精沉淀的方法纯化测序产物。6.mtDNA测序分析上样每个纯化后的测序产物使用10^1高纯度甲酰胺(Hi-DiFormamide)溶解，95。C变性10分钟后，立即放置于冰上,5分钟后将每个样本移至序列分析仪专用96孔上样板中。电泳检测将96孔上样板放入3730型DNA序列分析仪(美国应用生物系统公司)，仪器设定为标准测序程序(默认值)，上样电泳。电泳结束后，即得到电泳扫描结果。在其它类型DNA序列分析仪上操作也可获得同样的扫描结果。7.序列分析使用SequenceAnalysis5.1软件(美国应用生物系统公司)处理电泳扫描结果，得到碱基序列文件。将26对PCR引物测序获得的碱基序列文件拼接起来即可得到样本线粒体全碱基序列文件。将样本碱基序列与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。综上所述，利用本发明所述的26对PCR引物将线粒体全碱基序列分段扩增，直接测序检测，拼接获得的碱基序列文件即可得到线粒体全碱基序列文件，与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。权利要求1、线粒体测序用26对PCR引物，包括引物11FCTCCTCAAAGCAATACACTG3′结合位点6111RTGCTAAATCCACCTTCGACC3′结合位点1411引物22FCGATCAACCTCACCACCTCT3′结合位点12452RTGGACAACCAGCTATCACCA3′结合位点2007引物33FGGACTAACCCCTATACCTTCTGC3′结合位点18543RGGCAGGTCAATTTCACTGGT3′结合位点2669引物44FAAATCTTACCCCGCCTGTTT3′结合位点24994RAGGAATGCCATTGCGATTAG3′结合位点3346引物55FTACTTCACAAAGCGCCTTCC3′结合位点31695RATGAAGAATAGGGCGAAGGG3′结合位点3961引物66FTGGCTCCTTTAACCTCTCCA3′结合位点37966RAAGGATTATGGATGCGGTTG3′结合位点4854引物77FACTAATTAATCCCCTGGCCC3′结合位点44857RCCTGGGGTGGGTTTTGTATG3′结合位点5420引物88FCTAACCGGCTTTTTGCCC3′结合位点52558RACCTAGAAGGTTGCCTGGCT3′结合位点6031引物99FGAGGCCTAACCCCTGTCTTT3′结合位点58559RATTCCGAAGCCTGGTAGGAT3′结合位点6642引物1010FCTCTTCGTCTGATCCGTCCT3′结合位点646910RAGCGAAGGCTTCTCAAATCA3′结合位点7315引物1111FACGCCAAAATCCATTTCACT3′结合位点714811RCGGGAATTGCATCTGTTTTT3′结合位点8095引物1212FACGAGTACACCGACTACGGC3′结合位点793712RTGGGTGGTTGGTGTAAATGA3′结合位点8797引物1313FTTTCCCCCTCTATTGATCCC3′结合位点862113RGTGGCCTTGGTATGTGCTTT3′结合位点9397引物1414FCCCACCAATCACATGCCTAT3′结合位点923014RTGTAGCCGTTGAGTTGTGGT3′结合位点10130引物1717FTCACTCTCACTGCCCAAGAA3′结合位点1131417RGGAGAATGGGGGATAGGTGT3′结合位点12076引物1818FTATCACTCTCCTACTTACAG3′结合位点1194818RAGAAGGTTATAATTCCTACG3′结合位点12772引物1919FAAACAACCCAGCTCTCCCTAA3′结合位点1257119RTCGATGATGTGGTCTTTGGA3′结合位点13507引物2020FACATCTGTACCCACGCCTTC3′结合位点1333820RAGAGGGGTCAGGGTTCATTC3′结合位点14268引物2121FGCATAATTAAACTTTACTTC3′结合位点1400021RAGAATATTGAGGCGCCATTG3′结合位点14998引物2222FTGAAACTTCGGCTCACTCCT3′结合位点1485622RAGCTTTGGGTGCTAATGGTG3′结合位点15978引物2323FTCATTGGACAAGTAGCATCC3′结合位点1581123RGAGTGGTTAATAGGGTGATAG3′结合位点5其特征在于，还包括引物15-115-1FCTTCTATTGATGAGGGTCTT3′结合位点999115-1RGGTGTTGAGGGTTATGAGA3′结合位点10622引物15-215-2FAAGGATTAGACTGAACCGAA3′结合位点1040415-2RCTGATTGTGAGGGGTAGGA3′结合位点10992引物15-315-3FCAACCACCCACAGCCTAA3′结合位点1085715-3RTTGAGAATGAGTGTGAGGCG3′结合位点11512引物24-124-1FCATTATCCCGCACAAGAGTG3′结合位点1641924-1RTGGAAAGTGGCTGTGCAGACAT3′结合位点250引物24-224-2FCTTTGATTCCTGCCTCATCC3′结合位点13224-2RTAGAAAGGCTAGGACCAAACCT3′结合位点652该26对PCR引物覆盖了线粒体基因组全长，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2对中国人群的分型具有针对性。2、根据权利要求1所述用于线粒体测序的26对PCR引物，其特征在于，所述26对PCR引物中，引物24-l对应的扩增片段最小，为420bp;引物22对应的扩增片段最大，为1162bp;并且所有PCR引物片段大小适中，均适宜PCR扩增。3、基于权利要求1所述线粒体测序用26对PCR引物的分型方法，其特征在于，包括以下步骤选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成100pMOL/L，作为母液，取出10n1稀释到5^iMOL/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20pL，含lx反应缓冲液，1.5mMOL/LMgcl2，0.5UTaq酶，0.25^iMOL/L引物，200pMOL/LdNTP，DNA20200ng;引物的PCR扩增基础参数为95。C变性30s,根据PCR引物不同确定退火温度进行30s，72'C延伸60s，共计35个循环；纯化PCR扩增产物；测序反应体系为10pl，反应混合物中含纯化后的PCR扩增产物10ng、Big-DyeTerminatorReadyReactionmix(ver.3.1)0.7pl，测序引物0.3nM;观!j序PCR条件为96'C变性10秒，50。C退火5秒，6(TC延伸4分钟，共循环25次；纯化测序反应产物；纯化后的测序反应产物使用直接测序法检测；将26对PCR引物测序获得的碱基序列拼接得到样本线粒体全碱基序列，将样本碱基序列与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。全文摘要本发明涉及一种核酸检测方法，特别是公开了一种线粒体全部碱基序列分型及其测定方法，具体而言是线粒体测序用26对PCR引物及基于该引物的分型方法。本发明选用的26对PCR引物覆盖了线粒体基因组全长，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2针对中国人群重新设计，对中国人群的分型具有针对性；引物24-1对应的扩增片段最小，为420bp；引物22对应的扩增片段最大，为1162bp；所有PCR片段大小适中，均适宜PCR扩增。本发明的26对PCR引物已在申请人的实验室应用于中华民族群体遗传资料调查，已向GENEBANK数据库提交了中国人群线粒体全序列资料。结果表明，本发明完全可以应用在法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等领域。文档编号C12N15/11GK101270390SQ20081001797公开日2008年9月24日申请日期2008年4月15日优先权日2008年4月15日发明者刘清波,张洪波,李生斌,丽杨,赖江华申请人:西安交通大学