人对氧磷酶3基因表达载体的构建及其应用的制作方法

专利名称：人对氧磷酶3基因表达载体的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药技术领域。二. 背景技术对氧磷酶3 (PON3)是对氧磷酶基因家族发现最晚，研究最少的成员。人 PON3基因cDNA全长1075 bp,其中编码区长1065 bp，编码354个氨基酸。基 因表达产物PON3是分子量约40kDa的糖蛋白，是一种钙离子依赖性酯酶，具 有芳香酯酶活性、内酯酶活性及抗氧化功能[Lu H Q, W a/.及'oc/iew Wwm^o, 2005， 70: 019-1025]。人PON3主要由肝细胞合成分泌入血，在血清中98%与HDL结合， 但血清中PON3的含量仅为PON1的1/50。实验证明，PON3不仅有抑制HDL 和LDL氧化修饰的作用，而且有更强的抗氧化能力，纯化的兔血清PON3在体 外保护LDL抗铜离子诱导的氧化修饰的能力比PONl强100倍[DraganovDI, 5WCA训，2000, 275: 33435-33442],因此目前大部分的研究集中在PON3降低体内 的氧化压力，防治动脉粥样硬化方面。已有的研究表明，氧化压力和脂质超氧化物的升高是多种肝脏疾病的共同病 理机制，氧化压力升高导致活性自由基增加是肝损伤的重要致病因素，因此抗氧 化治疗可应用于肝损伤防治。我们曾发现肌肉电转移介导外源hPONlQ基因 的表达与分泌，有效降低了肝脏的氧化压力，对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤 有很好的保护作用[秦浚川等，专利申请号200610097968.6]。由于PON3表现出比 PON1更强的抗氧化作用，且文献未见PON3应用于肝脏疾病预防的相关报道， 我们研究了用转基因表达来提高血清PON3的活性以降低氧化压力，保护肝脏， 这可能是一种新的防治肝损伤的途径。四氯化碳单次注射诱导小鼠急性肝损伤是一种广泛使用的筛选和评价保肝 护肝药物的模型，本发明同时建立了多次隔日注射四氯化碳诱导亚急性肝损伤模型用于评估电转移hPON3抗肝损伤的效果，此模型与急性肝损伤模型相比更接 近于临床肝脏疾病的发生过程，因此更具有实际意义。我国是肝脏疾病高发国家，病毒性肝炎、酒精及药物中毒性肝病等引起的肝 损伤以及随之而来的慢性肝纤维化、肝功能衰竭等，己成为最常见疾病之一。传 统的保肝药物包括抗氧化剂、内源性保护因子、抗胆汁淤积药物和部分植物药等。 但是它们大多具有作用时间短、起效较慢、需长期多次用药等缺点，利用基因治 疗的方法导入护肝基因药物并使之长期高效表达以预防和治疗肝脏疾病己成为 一种有良好应用前景的策略。作为基因转移的方法之一，电刺激可介导裸露质粒DNA在多种细胞和组织 中的高效表达。与病毒载体相比，此技术具有生物安全性好、实验步骤简单、节 约成本等诸多优点。骨骼肌组织细胞数量庞大，易于进行各种操作，组成细胞多 为成熟的多核肌细胞且更新非常缓慢，供血丰富，蛋白合成能力强，细胞表达的 蛋白质能正常分泌进入血液循环，这些特征决定了其可作为理想的基因转移的靶 组织[McMahon JM, et al. Biodrugs, 2004， 18: 155-165]。有报道证明，电刺激介导下外源 基因在骨骼肌组织中的表达水平比传统非病毒载体转移方法提高2-4个数量级， 基因最长可持续表达9个月以上。我们应用成都仪器厂生产的YC-2型程控刺激 器，接上不锈钢针状电极，摸索了适当的电刺激参数，达到了较好的电转移效果。 三.发明内容本发明需要解决的问题是构建重组人对氧磷酶3基因的哺乳动物细胞表达 载体，利用电刺激介导的方法将其转入小鼠骨骼肌组织高效表达并通过自身N 端信号肽持续分泌以提高血清PON3的活性，从而作为新型基因药物对抗由四氯 化碳诱导的肝细胞损伤以有效地保护肝脏。本发明的技术方案包括1.重组人对氧磷酶基因3哺乳动物细胞表达载体 pCI-hPON3的设计与构建。2.电刺激介导pCI-hPON3在小鼠骨骼肌中的高效表 达与分泌。3.重组人PON3作为基因药物可提高血清hPON3水平，应用于防治 肝损伤。1. pCI-hPON3的设计与构建pCI-hPON3质粒的构建流程如附图1所示。以pMD18T-hPON3为模板，用 引物l， 2经PCR法扩增1065bp的全长hPON3基因序列，并将其克隆到pCI载体(购自Promega公司)的五coR I和Sa/I位点之间，使hPON3基因处于CMV启动子的控制之下，得到重组质粒pCI-hPON3。经测序证明，得到的基因序列与设计一致。pCI-hP0N3质粒用CaCl2法转入大肠杆菌中并进行扩增，质粒大量提取的产率为3.15pg/ml大肠杆菌，OD260/280=1.82。弓I物1: 5 ， AAGAATTCATGGGGAAGCTCGTGGCG 3'引物2: 5'CCGTCGACCTAGAGCTCACAGTACAG3，2.电刺激介导的P0N3骨骼肌表达将25pl 2pg/W的pCI-hPON3质粒注射入10只预先麻醉的雄性ICR小鼠左 侧胫骨头肌中。30秒后，将两根接入电刺激器的针状电极沿肌纤维方向插入注 射部位两侧进行基因电转移操作，电场参数见权利要求2。空载质粒对照组小鼠 肌肉注射相同质量的pCI质粒并给予相同条件的电刺激，PBS对照组小鼠仅注射 25pl PBS。各组小鼠注射后每两天自眦静脉取血并离心分离5pl血清测定hPON3 水解二氢香豆素的活性。电转24小时后，空载质粒对照组和转基因组小鼠分别 取肝脏和电转移部位的肌肉组织10mg提取总RNA，用引物3,4做RT-PCR，以 确定电转的pCI-PON3在肌肉中的表达。RT-PCR结果见附图2。小鼠p-actin的 表达作为内参。引物3: 5 ， ATACTGTGTATCTTTATGTTGTG 3' 引物4: 5'TGAAGCACAGAGCCATTGTTG 3'重组质粒pCI-hPON3在电刺激介导下转移进入小鼠骨骼肌组织中表达 hPON3蛋白，具有生物活性的hPON3蛋白分泌至血液中。转基因组小鼠血清 PON3活性自注射质粒后24小时起与两对照组相比开始升高，第8天达到最高 值(2.40± 0.05U/ml)，接近PBS对照组血清PON3活性(1.69 ±0.11 U/ml)和pCI对 照组血清PON3活性(1.69士0.12U/ml)的1.4倍(P<0.05)，高水平的表达至少可 持续24天，两对照组小鼠血清PON3活性在此期间无明显变化，说明电击介导 下hPON3基因可在小鼠骨骼肌组织中持续表达并分泌进入血液循环。RT-PCR 结果显示，小鼠肝脏表达的PON3水平与对照组无显著差异，转基因小鼠的肌肉 组织中则有hPON3特异性表达，空载质粒对照组小鼠肌肉无表达，结果进一步 证实hPON3基因在电刺激介导下在小鼠骨骼肌组织得到了有效表达，并分泌进 入血液循环，提高了小鼠血清的PON3活性。3. PON3重组质粒应用于防治肝损伤转基因组小鼠注射重组质粒并电刺激2天后，腹腔注射10% CCl4玉米油溶 液(lml/kg b.w.)，以建立小鼠急性肝损伤模型；另取10只同龄同来源雄性小鼠 每隔一天腹腔注射相同剂量CCU玉米油溶液30天共15次，以建立亚急性肝损 伤模型。同时急性和亚急性肝损伤组分别取IO只健康同龄同来源雄性小鼠注射 相同剂量相同次数四氯化碳作为阳性对照，另10只小鼠注射相同次数lml /kg b.w.玉米油作为阴性对照。最后一次注射CC1424小时后，摘眼球取血并处死小 鼠，测定各组小鼠血清ALT、 AST水平，肝匀浆丙二醛(MDA)，还原型谷胱甘 肽(GSH)和总抗氧化活性(T-AOC)，并制作肝脏组织切片以观察肝脏的损伤情况。 急性和亚急性肝损伤CCU对照组小鼠血清ALT、 AST与正常对照组相比显 著升高(P<0.01)，其肝匀浆的MDA水平与正常对照组相比分别升高了 1.7倍 和2.3倍(P<0.05)，而GSH和T-AOC水平均有显著降低(P<0.05)。 CCU对 照组小鼠肝脏组织切片与正常对照组相比，细胞坏死面积、空泡、脂滴及水肿等 病理学改变的比率均显著增加，说明小鼠肝脏的氧化水平升高，急性与亚急性肝 损伤模型分别建立成功。急性肝损伤组注射四氯化碳后，转基因组小鼠与CCl4对照组相比血清ALT 降低30%， AST降低32。/q，差异显著(P<0.05);其肝匀浆的MDA水平与CC14 对照组比降低了 53%,已恢复接近正常对照组水平(P〈0.05);而GSH和T-AOC 水平则表现出明显升高，恢复至正常水平(P<0.05)。病理学分析显示转基因小 鼠肝脏坏死细胞面积与阳性对照组相比有极显著的降低，水肿、空泡和脂肪变性 的程度也明显减轻。亚急性实验也表现出相同的趋势转基因组与CCU对照组 相比ALT降低了 80%， AST水平降低了 79%， MDA， GSH和T-AOC也均回复 到了正常对照组的水平。病理切片显示，中央小静脉周围的炎性细胞浸润和肝细 胞水肿程度明显减轻，肝细胞坏死和肝细胞索结构的紊乱现象已消失。急性肝损 伤组注射四氯化碳后各组小鼠血清ALT、 AST的变化见附图3;亚急性肝损伤组 ALT、 AST变化见图4;急性和亚急性小鼠肝脏典型病理切片照片分别见附图5， 图6。以上结果说明转基因后，高水平的血清PON3可有效降低肝脏氧化压力， 对四氯化碳诱导的急性和亚急性肝细胞损伤均有较好的保护作用，因此hPON3 可应用于制备预防和治疗肝脏损伤药物。本发明与现有技术相比，其有益效果是本发明首次以防治肝损伤为目标构建 人对氧磷酶3基因的哺乳动物细胞表达载体pCI-hP0N3，经电刺激介导将其导入 小鼠骨骼肌组织中，并获得分泌性表达人对氧磷酶3。腹腔注射四氯化碳建立小 鼠急性和亚急性肝损伤模型后，通过血清生化指标测定和肝脏组织病理学分析及 体内肝细胞抗氧化实验检测，证实转基因表达的人对氧磷酶3对肝细胞损伤有明 显的保护作用。因此本发明对防治肝损伤起效较快， 一次给药可维持药效时间较 长，毒副作用小，成本低廉。四.


图1人对氧磷酶基因3哺乳动物细胞表达载体的构建流程2转基因组和对照组小鼠PON3在肝脏和肌肉中表达的RT-PCR分析结果(1) 对照组小鼠肝脏(2) 转基因组小鼠肝脏(3) 转基因组小鼠肌肉(4) 对照组小鼠肌肉图3急性肝损伤造模成功后各组小鼠血清ALT、 AST的变化 图4亚急性肝损伤造模成功后各组小鼠血清ALT、 AST的变化 图5急性肝损伤造模后各组小鼠典型肝脏病理学照片(A) 正常对照组小鼠(B) CCLj对照组小鼠(C) 转基因组小鼠图6亚急性肝损伤造模后各组小鼠典型肝脏病理学照片(A) 正常对照组小鼠(B) CCU对照组小鼠(C) 转基因组小鼠五.具体实施方式
1.pMD18T-hPON3质粒由本室构建并保存。以pMD18T-hPON3为模板,.用引物 1 ， 2经PCR法扩增hPON3全长基因共1065bp，经￡coR I和Sa/I双酶切后插入 pCI质粒的相应多克隆位点中。hPON3基因处于CMV启动子的控制之下。经测 序证明，结果与设计序列完全一致(流程见附图1)。将pCI-hPON3转化用CaCl2法制备的感受态TOP10大肠杆菌，并按照《分子克隆》第三版的操作流程扩增 大肠杆菌，PEG法进行质粒的大量提取。用紫外分光光度法测定所提取质粒的 纯度和产率，并用PBS将质粒浓度调整为2pg"l。所有生化试剂均购自Sigma 公司，酶购自Takara公司。2. 健康雄性ICR小鼠30只，SPF级，4-6周龄，体重18-22克，购自南京医科大 学实验动物中心。动物随机分为3组，分别为转基因组，空质粒对照组和PBS 对照组，每组10只。实验前1天按照下节所述方法测定各组小鼠血清P0N3水 解二氢香豆素活性的基础值。实验前20分钟各组小鼠腹腔注射巴比妥钠 300mg/kg b.w.进行麻醉。用汉密尔顿注射器将25^12吗 1的pCI-hPON3质粒肌 肉注射入转基因组小鼠的左侧胫骨头肌中。30秒后，将接入电刺激器连接的两 根不锈钢针状电极插入注射部位两侧，电极间距0.5cm。电刺激由成都仪器厂生 产的YC-2型程控刺激器发生，电场参数为方波，200V/cm,波宽20ms，频率 为lHz，脉冲数8。空质粒对照组小鼠注射相同质量的pCI质粒并给予相同的电 场刺激。PBS对照组仅肌肉注射25plPBS。所有小鼠均饲养于SPF级实验动物 房内，自由饮食，环境温度22士2。C，湿度45-75%。血清PON3活性的测定实验前1天及实验后的每两天，用微量采血管自小 鼠眦静脉采血，2000 rpmx10分钟以分离血清。取5^1血清加入lml反应体系并 充分混匀。反应体系包括50mMTris/HCl(pH8.0)、 1 mMCaCl2及1 mM 二氢香 豆素。反应于37。C水浴中进行IO分钟，加入10(V10.1MEDTA终止。测定反 应液于270nm处的光吸收并通过水解产物的摩尔消光系数计算血清中PON3的 酶活性。使用SPSS软件的方差分析以及两两比较对各组小鼠血清PON3活性数 值进行统计学分析。3. 转基因组小鼠和空载质粒对照组小鼠在电转移实施24小时后，分别取肝脏组 织和电转移肌肉部位10mg提取总RNA，并DNaseI消化避免DNA的污染。使 用M-MLV反转录后用上文提及的引物3,4做RT-PCR反应，小鼠(3-actin的表达 水平为内参。PCR反应条件如下94°C初始变性5min, 30个循环，每个循环 94。C变性40s， 50。C退火45s， 72°C延伸lmin，循环结束后72°C延伸7min, 保存于-20。C。 1.20/。琼脂糖凝胶分离鉴定PCR产物。4. 转基因组小鼠注射重组质粒并电刺激2天后腹腔注射给予10%四氯化碳玉米油溶液1 ml/kg b.w.诱导急性肝损伤，另取10只同龄同来源雄性小鼠每隔一天腹腔 注射相同剂量CCl4玉米油溶液30天，以建立亚急性肝损伤模型。同时急性和亚 急性肝损伤组分别取两组各10只来源、性别、周龄相同的小鼠作为对照。其中 一组腹腔注射相同剂量相同次数四氯化碳作为阳性对照，另 一组腹腔注射相同剂 量相同次数玉米油作为正常对照。最后一次注射CCU24小时后，将各组小鼠摘 眼球取血并离心分离血清，测定血清ALT、 AST水平，取肝脏制成匀浆测定MDA， GSH和T-AOC水平，另剪取肝脏主叶，置于中性福尔马林溶液中浸泡固定24 小时，梯度浓度酒精溶液脱水及二甲苯清洗后，石蜡包埋组织块，并用切片机切 成厚度为4pm的组织切片。切片用苏木精和伊红染色，于倒置显微镜下观察、 拍照并进行病理学分析。实验数据均采用方差分析以及两两比较进行统计学分 析。所有动物实验操作均遵守《江苏省实验动物管理条例》。
权利要求
1.一种应用人对氧磷酶3即hPON3构建的在哺乳动物细胞内表达的重组质粒，其特征是将PCR扩增的hPON3基因克隆于pCI载体的EcoR I和SalI位点之间，使hPON3基因位于CMV启动子的控制之下。
2. 根据权利要求1所构建的重组质粒pCI-hPON3在电脉冲介导下在小鼠骨骼肌 组织中大量表达并有效分泌至血液的转基因操作方法，其特征是..25^1 2pg/pl 的pCI-hPON3质粒肌肉注射入小鼠胫骨头肌后，将两根接入电刺激器的不锈钢 针状电极插入注射部位两侧，电场参数为方波，200 V/cm，波宽20ms，脉冲 次数8，频率为lHz。
3. 根据权利要求1所述重组表达质粒在制备预防和治疗肝脏损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术制药技术领域。本发明应用人对氧磷酶3基因(hPON3)构建了哺乳动物细胞中表达的重组质粒pCI-hPON3，使用电转移法在小鼠骨骼肌组织中使hPON3得到高效表达并分泌入血，提高了血清中PON3水平，使小鼠抗氧化压力的能力加强，有效的防治肝脏损伤。hPON3转基因表达小鼠血清水解二氢香豆素的活性升高约1.4倍，并可持续24天。转基因组和正常小鼠分别腹腔注射四氯化碳建立小鼠急性和亚急性肝损伤模型后，转基因组小鼠与CCl₄对照组相比血清ALT和AST水平显著降低，肝脏匀浆的丙二醛(MDA)水平降低，还原型谷胱甘肽(GSH)和总抗氧化能力(T-AOC)升高，病理学切片结果显示转基因组小鼠肝细胞损伤程度明显低于CCl₄对照组，表明重组人PON3质粒转基因表达可有效提高血清PON3活性，降低肝脏氧化压力，可用于肝脏损伤的预防和治疗。
文档编号C12N15/87GK101240292SQ20081001969
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月12日 优先权日2008年3月12日
发明者吕海芹, 姜晓玲, 驰 张, 薇 彭, 洁 朱, 秦浚川, 臧宇辉 申请人:南京大学