专利名称：一种草茎点霉的遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及草茎点霉(i^o脂/^6w固)的电穿孔遗传转化技术，适用于草茎点霉
的遗传工程以及草茎点霉分子生物学研究等领域。
背景技术：
草茎点霉不仅是某些动植物的病原菌，而且也是一种可用于杂草防治的生防菌。由 草茎点霉引起的动植物病害有植物黑胫病和鲑鳟鱼类的鳔真菌病(吴庆禹等，东北林
业大学学报，2005， 33 (2) : 43-45; Mohamed Faisal et al， 2007， Mycopathologia (2007) 163: 4148)。目前已从草茎点霉中分离出了至少三种不同类型的活性化合物(Jose' Fausto Rivero-Cruz et al， / iV饥iVod 2003， 66' 511-514; Vikrant et al， J. o/尸/^to;7a^0/. 154 (7-8): 461-468; Xiao Bing Yang et al， S/ocWw/e 87:747-754)。'近年来，我们从草茎 点霉中分离到了一种抗肿瘤的多糖YCP，生物活性和临床前的研究均表现出良好的结 果。在国家863、国家自然科学基金等国家级科研项目基金的大力支持下，YCP多糖的 研究已经非常接近成药了。在相关的基础研究方面，我们不仅建立了草茎点霉成熟的工 业发酵工艺，而且对YCP多糖的生物合成途径也展开了深入的研究。因此，草蓬点霉非 常有望成为具有良好开发前景的丝状真菌之一。可以预见，今后很多研究将试图通过基 因工程的办法改良菌种。同时，草茎点霉对植物和鱼类致病的分子生物学机制研究也将 引起高度重视，但是，遗传转化方法的研究是对草茎点霉实施基因工程和分子生物学研 究的前提。
丝状真菌的遗传转化目前主要有醋酸锂介导的孢子转化法、PEG介导的原生质体转 化法、农杆菌介导的转化法和电穿孔转化法。在草茎点霉中，目前还没有建立任何转化 方法。我们尝试过前3种转化方法，均不理想。电穿孔转化技术在微生物等的遗传转化 中具有较高的效率，而且简单易行，在原核生物中已有广泛的应用。BioRad、 Phamacia 等世界著名公司已开发了电穿孔仪。
本发明首次利用了电穿孔技术对草茎点霉实施了外源基因转化，找到了合适的转化 条件，并优化了裂解酶的组合，转化方法简单，转化效率高，此法可用于草茎点霉的遗传工程以及分子生物学研究和应用。
发明内容
本发明目的是提供一种利用电穿孔技术对草茎点霉进行外源基因的遗传转化方法，并找到转化效率较高的转化参数组合，可用于草茎点霉基因工程以及分子生物学研究等领域。
本发明达到发明目的所采用的技术方案是利用真菌细胞壁降解酶对草茎点霉的细
胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，纯化的原生质体和适量外源基因(DNA)水
溶液进行混合，然后利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击处理的原生质体可以吸
纳外源DNA，从而实现了外源DNA对草茎点霉的遗传转化。本发明的技术方案如下-
一种草茎点霉的遗传转化方法，它由下列步骤组成
(1) 将草茎点霉原生质体用缓冲液EB悬浮，以显微镜检査计数，调整原生质体液的原生质体浓度至107-108/ml，所述的缓冲液EB为一种水溶液，其中含浓度为2mM的2-[4- (2-羟乙基)-l-哌嗪]乙磺酸(HEPES) ， pH7.5，浓度为0.6 M的甘露醇
(mannitol),浓度为lmM的MgCl2，在121。C高压灭菌20min，
(2) 将用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至终浓度为l吗/pl，每10(^1原生质体液中加入5吗DNA，混匀，冰浴冷却20min，成混合液，所述的外源DNA为任何可以转化真菌的DNA或质粒，
(3) 在预冷的电击杯中加入步骤(2)所得混合液，冰浴冷却5min后用电穿孔仪进行
电击，
(4) 电击后向电击杯中加入lml CM液体培养基(添加甘露醇至终浓度为0.6 M的甘露醇)，冰浴冷却20min，悬浮后与5ml融化的0.7% CM固体培养基混合，平铺于1.5% CM固体培养基(添加蔗糖至终浓度为0.2M的蔗糖)平板上，28。C培养12h后，覆盖10ml融化的0.7% CM固体培养基(添加潮霉素至终浓度为250pg/ml的潮霉素)，在28'C培养至转化子出现，所述的CM液体培养基的配方为3%蔗糖，0.3%硝酸钠，1 %磷酸钾，pH5.8, 0.05 % KC1， 0.05 % MgS04， 0.001 % FeS04， 0.2 %酵母提取物(yeast extract), 121'C高压灭菌20min;所述的0.7% CM固体培养基的配方为CM液体培养基中加入终浓度为0.7n/。的琼脂粉，12rC高压灭菌20min;所述的1.5c/。CM固体培养基的配方为CM液体培养基中加入终浓度为1.5%的琼脂粉，12rC高压灭菌20min，(5)将转化子在1.5% CM固体培养基(添加外源DNA编码的抗生素至终浓度为125吗/ml的外源DNA编码的抗生素)平板上继代培养，稳定生长后保存，所述的外源DNA编码的抗生素优选潮霉素。
上述的草茎点霉的遗传转化方法，所述的外源DNA为带有潮霉素抗性基因的质粒。
所述的草茎点霉的原生质体的制备方法如下
(1) 用缓冲液LS配制终浓度均为lmg/ml的由蜗牛酶、纤维素酶和裂解酶(lysingenzyme)组成的细胞壁降解酶液，所述的酶液经过滤灭菌后每20ml酶液加入约0.9-Ug湿菌体，置30'C的摇床，转速为50-100rpm，酶解3-4h，得原生质体酶解液。所述的缓冲液LS的配方为20mM磷酸钾，pH5.8， 0.6 M甘露醇，121。C高温灭菌20min，
(2) 原生质体酶解液过滤除去菌丝残片，离心，得到原生质体沉淀。
所述的草茎点霉的湿菌体的制备方法如下
(1) 在1.5。/。CM固体培养基平板上进行草茎点霉菌种活化，培养温度2『C，
(2) 取经活化的草茎点霉菌种接种至含玻璃珠的CM液体培养基中，置于温度为28°C、转速为200rpm的摇床培养24h，
(3) 将步骤(2)所得培养液按10%的接种量在新鲜CM液体培养基进行扩大培养24h，
(4) 将步骤(3)所得培养液用灭菌的3层医用纱布过滤，用无菌去离子水冲洗滤布上的菌丝体，重复2—4次，去除残余培养液，再用缓冲液LS冲洗2—4次，收集湿菌体。
由于目前真菌绝大多数用潮霉素筛选，故本发明中所述的外源DNA优选带有潮霉素抗性基因的质粒，如pCAMBIA系列载体，其它任何可以转化真菌的DNA或质粒，也可采用本发明所述的方法进行转化。
本发明的有益效果体现在可以用来对草茎点霉实施基因工程从而进行遗传改良育种，可以用于旨在提高抗肿瘤多糖YCP和其它活性化合物的生物合成能力的转基因育种；也可以用于草茎点霉的分子生物学研究，如研究该菌对植物和鱼类的致病分子机制以及该菌的生长发育等。
图l为转化子鉴定结果，其中编号M的泳道是DNA分子量标准，编号1-10的泳道是随机挑选的转化子分别用PCR和PCR-EcoRV鉴定结果(均有相应的潮霉素编码基因的PCR扩增条带)，编号W的泳道是未转基因的对照材料(没有相应的潮霉素编码基因的PCR扩增条带)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于
此
实施例1:利用电穿孔法对草茎点霉(i^m"er6^"附)进行外源抗潮霉素基因的遗传转化
利用发明内容中所述的方法，将含潮霉素抗性基因的外源质粒pAH1700导入了草茎点霉，通过潮霉素筛选获得了稳定转化的工程菌。具体方法如下1.草茎点霉原生质体的制备；
(1) 在1.5。/。CM固体培养基平板上进行草茎点霉菌种活化，培养温度28'C。 1.5% CM'固体培养基的配制方法3 %蔗糖，0.3 % NaN03， 1 %磷酸钾，pH5.8, 0.05 % KC1,
0.05 % MgS04, 0.001 % FeS04, 0.2 %酵母提取物(yeast extract), 1.5%琼脂粉，121 °C高压灭菌20min。
(2) 取经活化的草茎点霉菌种接种至含玻璃珠的CM液体培养基中，置于温度为28°C、转速为200rpm的摇床培养24h。 CM液体培养基的配制方法为3 % sucrose, 0.3 %NaN03, 1 %磷酸钾，pH5.8, 0.05 % KCl， 0.05 % MgS04， 0.001 % FeS04, 0.2 %酵母提取物(yeast extract), 1.5%琼脂粉，12rC高压灭菌20min。
(3) 将步骤(2)所得培养液按10%的接种量在新鲜CM液体培养基进行扩大培养24h。
(4) 将步骤(3)所得培养液用灭菌的3层医用纱布过滤，用无菌去离子水冲洗滤布上的菌丝体，重复2—4次，去除残余培养液，再用缓冲液LS冲洗2-4次，收集湿菌体。
(5) 用缓冲液LS配制终浓度均为lmg/ml的由蜗牛酶、纤维素酶和裂解酶(lysingenzyme)组成的细胞壁降解酶液，所述的酶液经过滤灭菌后每20ml酶液加入约0.9-1.lg湿菌体，置30'C的摇床，转速为50-100rpm，酶解3-4h，得原生质体酶解液。所述的缓冲液LS的配方为20mM磷酸钾，pH5.8，0.6M甘露醇，121。C高压灭菌20min。
(6) 原生质体酶解液过滤除去菌丝残片，离心，得到原生质体沉淀。
(7) 原生质体沉淀用缓冲液EB悬浮，1000g离心10 min,重复1次。所述的缓冲液EB的配置方法为2 mM HEPES， pH7.5, 0.6 M mannitol, lmM MgCl2， 121 。C高压灭菌20min。
(8) 原生质体沉淀悬浮于适量缓冲液EB中，显微镜检检查和计数，调整原生质体的浓度为10々ml左右用于以下转化。
2.电穿孔法对原生质体进行外源DNA转化
(1) DNA制备。用于转化的外源质粒经限制酶切成线状，纯化后溶于无菌去离子水，终浓度lpg/W，用于转化.
(2) 每10(Hil原生质体液中加入5吗DNA，混匀，冰浴20min后，加入预冷的电击杯(2cm)，冰浴5min后，电击，电击参数750V，电容25pF，电阻400Q。
(3) 电击后向电击杯中加入lmlCM液体培养基(添加终浓度为0.6M的甘露醇)，冰浴20min，悬浮后与5ml融化的0.7% CM固体培养基混合，平铺于1.5% CM固体培养基(添加终浓度为0.2M的蔗糖)平板上，28。C培养12h后，覆盖10ml融化的0.7%CM固体培养基(添加终浓度为250吗/ml的潮霉素)，在2『C培养至转化子出现。
(4) 转化子在含终浓度为125^/mL潮霉素的1.5。/。CM固体培养基上继代培养，稳定生长后保存.
结果转化率大于20个转化子/电击杯。转化子鉴定方法为PCR,用针对潮霉素抗性基因的引物可以从转化子中扩出相应的潮霉素抗性基因(见图l)，证明潮霉素抗性基因已经稳定存在于转化子中。
权利要求
1. 一种草茎点霉的遗传转化方法，其特征是它由下列步骤组成(1)将草茎点霉原生质体用缓冲液EB悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度至107-108/ml，所述的缓冲液EB为一种水溶液，其中含浓度为2mM的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸，pH7.5，浓度为0.6M的甘露醇，浓度为1mM的MgCl2，在121℃高压灭菌20min，(2)将用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至终浓度为1μg/μl，每100μl原生质体液中加入5μgDNA，混匀，冰浴冷却20min，成混合液，所述的外源DNA为任何可以转化真菌的DNA或质粒，(3)在预冷的电击杯中加入步骤(2)所得混合液，冰浴冷却5min后用电穿孔仪进行电击，(4)电击后向电击杯中加入1ml添加甘露醇至终浓度为0.6M的甘露醇的CM液体培养基，冰浴冷却20min，悬浮后与5ml融化的0.7％CM固体培养基混合，平铺于添加蔗糖至终浓度为0.2M的1.5％CM固体培养基平板上，28℃培养12h后，覆盖10ml融化的0.7％CM固体培养基，其中添加潮霉素至终浓度为250μg/ml的潮霉素，在28℃培养至转化子出现，所述的CM液体培养基的配方为3％蔗糖，0.3％硝酸钠，1％磷酸钾，pH5.8，0.05％KCl，0.05％MgSO4，0.001％FeSO4，0.2％酵母提取物，121℃高压灭菌20min；所述的0.7％CM固体培养基的配方为CM液体培养基中加入终浓度为0.7％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min；所述的1.5％CM固体培养基的配方为CM液体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min，(5)将转化子在添加终浓度为125μg/ml的由外源DNA所编码的抗生素的1.5％CM固体培养基平板上继代培养，稳定生长后保存，所述的外源DNA编码的抗生素优选潮霉素。
2. 根据权利要求1所述的草茎点霉的遗传转化方法，其特征是:所述的外源DNA 为带有潮霉素抗性基因的质粒。
3. 根据权利要求1所述的草茎点霉的遗传转化方法，其特征是所述的草蓬点霉的原生质体的制备方法如下(1)用缓冲液LS配制终浓度均为lmg/ml的由蜗牛酶、纤维素酶和裂解霉组成的细胞壁降解酶液，所述的酶液经过滤灭菌后每20ml酶液加入约0.9-1.lg湿菌体，置3(TC 的摇床，转速为50-100rpm,酶解3-4h，得原生质体酶解液。所述的缓冲液LS的配 方为20mM磷酸钾，pH5.8， 0.6M甘露醇，12rC高温灭菌20min, (2)原生质体酶解液过滤除去菌丝残片，离心，得到原生质体沉淀。
全文摘要
本发明提供了一种利用电穿孔(electroporation)技术对草茎点霉(Phoma herbarum)进行外源基因的遗传转化方法利用真菌细胞壁降解酶对草茎点霉的细胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，纯化的原生质体和适量外源基因/脱氧核糖核酸(DNA)水溶液进行混合，然后利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击处理的原生质体可以吸纳外源DNA，从而实现了外源DNA对草茎点霉的遗传转化。本发明的有益效果体现在可以用来对草茎点霉实施基因工程从而进行遗传改良育种，可以用于旨在提高抗肿瘤多糖YCP和其它活性化合物的生物合成能力的转基因育种；也可以用于草茎点霉的分子生物学研究，如研究该菌对植物和鱼类的致病分子机制以及该菌的生长发育等。
文档编号C12N15/11GK101544986SQ20081002463
公开日2009年9月30日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者丰明乾, 添 周, 谭仁祥, 越 韩, 魏闻捷 申请人:南京大学