专利名称：一种简便高效分离纯化植酸酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种简便高效分离纯化植酸酶的方法。本发明尤其涉及一种 从微生物深层发酵液中直接分离纯化植酸酶。该方法具有分离纯化简便、收 得率高、纯度高、成本低等优点。
背景技术：
从微生物深层发酵液中分离纯化酶的常用方法有
(1) 沉淀分离通过改变某些条件，使溶液中某些溶质的溶解度降低，从 而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离的目的。沉淀分离的方法有很多 种，诸如盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀、选择性变性沉 淀等。沉淀分离纯化酶的收得率较高， 一般在70%以上，但纯度较低， 一般
在30-50%之间。
(2) 层析分离利用混合物中各组分的物理化学性质(分子量大小和形状、 分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等)的不同，使各组分在两相中 的分布程度不同而达到分离。层析分离中一个是固定的，称为固定相，另一 个是流动的称为流动相。当流动相经过固定相时，各组分的移动速度不同， 从而使不同的组分分离纯化。常用的有吸附层析、离子交换层析、凝胶层析 和亲和层析等。层析分离方法分离纯化酶的收得率较低， 一般在15-40%之 间，纯度在60%以上。
亲和层析是利用生物分子对之间所具有的专一性而又可逆的亲和力使 生物分子分离纯化的技术。酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都 是具有专一而可逆的亲和力的分子对。在成对互配的生物分子中，可把任何 一方作为固定相，而对样品溶液(流动相)中的另一方分子进行亲和层析。亲和层析具有较强的选择性，因此，分离纯度高。但由于固相亲和层析吸附 剂的空间位阻作用，吸附容量低，制备亲和层析柱价格高，成本高，所以，
工业化大生产很难使用。该法分离纯化酶的收得率一般在15-50%之间，纯 度在90°/。以上。
植酸酶和其催化的底物一植酸(或植酸盐)是具有专一而可逆的亲和力 的分子对，可特异性地吸附。同时，植酸(或植酸盐)具有极强的螯合能力， 通常与钙、镁、钠、锌、铁、铜、锰等矿物质形成不溶性盐类。本发明正是 基于此而提出的。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便高效分离纯化植酸酶的方法。此法克服了 通常分离纯化方法中，在酶的纯度提高的前提下，而收得率低的问题。
在达到上述目的中，根据本发明提供了一种简便高效的分离纯化植酸酶 的方法。先将产植酸酶的发酵液用离心机离心，收集上清液。利用植酸酶作 用的底物——植酸(或植酸盐)作为亲和层析吸附剂，直接将植酸(或植酸 盐)加入到上清液中，充分搅匀，植酸(或植酸盐)与植酸酶特异性吸附。 由于植酸(或植酸盐)具有极强的螯合能力，通常与钙、镁、钠、锌、铁、 铜、锰等矿物质形成不溶性盐类。此时，添加含有上述金属离子的无机盐可 将植酸和植酸酶的结合体沉淀出来，采用上述离心机收集该沉淀，经干燥机 干燥即得植酸酶粉制剂。
根据本发明方法，所用植酸盐主要是植酸钠、植酸钙等盐，将植酸(或 植酸盐)先配成20%的水溶液，再取适当的量加到经过离心机离心的上清液 中，使其浓度为0.2-0.8°/。，温度10-35。C， pH5.0-7.5，在发酵罐或搅拌罐中， 搅拌混合，此时，添加适量的金属盐溶液(用自来水稀释)，使其浓度为 0. 03-0. 1%，搅拌混合。两次搅拌的转速20-50转/分，搅拌时间10-30分钟。 含有植酸(或植酸盐)、金属盐的植酸酶混合物沉淀出来。采用离心机收集 该沉淀，即为湿酶。经真空耙式干燥机干燥即得植酸酶粉制剂。
具体实施例方式
用去离子水将植酸(或植酸钠、植酸钙等)配成20%的水溶液，再取适当 的量加到经过离心机离心的上清液中，使其浓度为0.2-0.8%，温度10-35"C， pH5.0-7.5，在发酵罐或搅拌罐中，对其进行混合搅拌。再加适量金属盐(用 自来水稀释)，使其浓度为0. 03-0. 1%，混合搅拌。两次搅拌的转速为20-50 转/分，搅拌时间10-30分钟。
实施例1
取5公斤植酸，加去离子水至25公斤，混匀后，全部加到1000升经离 心后的上清液中，使其浓度为0.5%， 25°C， pH5.0，搅拌混合。将3yoMgSCUO 公斤加入到上述混合物中，使其浓度为0.03%，搅拌混合。混合物经离心机 离心，即得植酸酶湿酶粉剂。该湿酶粉经真空耙式干燥机干燥即得植酸酶粉 制剂。植酸酶纯度达81.3%,收得率达76.6%。
实施例2
取3.2公斤植酸钠，加去离子水至16公斤，混匀后，全部加到800升 经离心后的上清液中，使其浓度为0. 4%， 30°C， pH6. 0，搅拌混合。将5%CaCl28 公斤加入到上述混合物中，浓度为0.05%,搅拌混合。混合物经离心机离心， 即得植酸酶湿酶粉剂。该湿酶粉经真空耙式干燥机干燥即得植酸酶粉制剂。 植酸酶纯度达79.5%，收得率达78.4%。
实施例3
取6公斤植酸钙，加去离子水至30公斤，混匀后，全部加到1000升经 离心后的上清液中，28°C, pH7.2，搅拌混合。将6yoNaC110公斤加入到上述 混合物中，浓度为0.06%，搅拌混合。混合物经离心机离心，即得植酸酶湿 酶粉剂。该湿酶粉经真空耙式干燥机干燥即得植酸酶粉制剂。植酸酶纯度达 78.0%，收得率达80.5%。
权利要求
1、一种简便高效分离纯化植酸酶的方法，包括将植酸(或植酸盐)加入到pH5.0-7.5，温度10-35℃的含植酸酶的上清液中，在发酵罐或搅拌罐中，对其进行混合。然后，加入适量金属盐，搅拌混匀后，即可离心收集沉淀即植酸酶湿粉制剂；
2、 按照权利要求l的方法，其中所述植酸盐为植酸钠、植酸钙。植酸 和植酸盐用水配制成20%，添加到含植酸酶的上清液中使其浓度为 0. 2-0. 8%;
3、 按照权利要求2的方法，稀释植酸(或植酸盐)所用水为去离子水;
4、 按照权利要求1的方法，其中金属盐为含钙、镁、钾、钠、锌、铁、 铜、锰等无机盐；
5、 按照权利要求3的方法，将金属盐用自来水配制成3-10%的溶液，添 加到含植酸酶和植酸的上清液混合物中，使其浓度为0. 03-0. 1%;
6、 按照权利要求l的方法，搅拌转速20-50转/分，搅拌时间10-30分 钟。
全文摘要
根据本发明提供了一种简便高效的分离纯化植酸酶的方法。先将产植酸酶的发酵液用离心机离心，收集上清液。利用植酸酶作用的底物——植酸(或植酸盐)作为亲和层析吸附剂，直接将植酸(或植酸盐)加入到上清液中，充分搅匀，植酸(或植酸盐)与植酸酶特异性吸附。由于植酸(或植酸盐)具有极强的螯合能力，通常与钙、镁、钠、锌、铁、铜、锰等矿物质形成不溶性盐类。此时，添加含有上述金属离子的无机盐可将植酸和植酸酶的结合体沉淀出来，采用上述离心机收集该沉淀，经干燥机干燥即得植酸酶粉制剂。该方法具有分离纯化化简便，收得率高，纯度高，成本低等优点。
文档编号C12N9/16GK101531999SQ20081002671
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月11日 优先权日2008年3月11日
发明者何倩松, 邓开健 申请人:广州市开恒生物科技有限公司