专利名称：一种人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法
技术领域：
本发明涉及一种人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
暖地大叶藓(^wcto6o^w7 g/ga"fewm )隶属真藓科大叶藓属植物，与同属 植物大叶藓(i^o&6o^附ra^ww)统称为回心草。回心草是地方习用药，也 是彝、傣、哈尼族等使用的民族药。近年来我国有关大叶藓属植物(主要以暖 地大叶藓为供试材料)药理作用的研究、现代临床研究及制剂应用研究都确定 了其在治疗冠心病、心绞痛以及高血压和高血脂等疾病中的疗效。该种药用植 物制剂目前有云南英茂生物制药有限公司生产的回心康片和陕西长武制药厂 生产的回心草片剂和针剂。目前作为药材使用的回心草一暖地大叶藓，均来源于野生资源，以全草入 药，在夏、秋季采收，药材组成主要是干缩的配子体。利用野生暖地大叶藓进 行大规模制药生产将会面临诸多问题首先，自然生长过程中常受到自然环境 变化的影响，会存在各种变异个体或群体，会影响资源产量和资源性状的一致 性和稳定性；其次，采收期的不同、产地的不同等均会影响药材质量的稳定性; 更重要的是野生植物资源在自然界中的分布是零散的，几乎没有大面积成片的 现象， 一旦野生植物成为重要开发资源，仅靠野生资源一方面很难满足市场需 要，另一方面，在开发利用的压力下，极易遭到破坏，对物种生存构成直接威 胁。因此，通过人工扩繁暖地大叶藓，为制药领域提供丰富的植物药材势在必 行。但目前现有技术中还没有关于大叶藓属植物在试管内大量扩繁配子体的培 养技术，更没有将大叶藓属植物组织培养成配子体的相关技术报道。发明内容本发明的目的在于提供一种人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，以填 补现有技术的空白，实现人工大量扩繁暖地大叶藓、为制药领域提供丰富植物 药材的目的。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下 本发明公开的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法包括以下顺序步骤1) 将生长于自然环境中未展开叶片的暖地大叶藓配子体表面消毒后，切取茎尖接种到诱导配子体产生原丝体的培养基上，进行培养40~60天，培养 条件为温度20 25。C，光照强度2000~4000 lx,光照时间10 ~ 12小时/天； 所述诱导配子体产生原丝体的培养基配方为改良Kn叩培养基+ 0 2.0mg/1 2,4-二氯苯氧乙酸+ 0 0.10mg/1 6-节基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖，其中改良 Knop培养基配方为KC1 76.04mg/l、 MgS04 7H20 828.2mg/l、 KH2P04 250.4mg/l、 Ca(N03)2 .4H20 1001.3mg/l、 CuS04 .5H20 0.027mg/l、 KI 0.014mg/l、 ZnS04 . 7H20 0.027mg/l、 H3B03 0.309mg/l、 NaMo04 . 2H20 0.012mg/l、 MnCl2 . 4H20 0.198mg/l、 CoCl2 6H20 0.027mg/l、 FeS04 . 7H20 27.8mg/l、 NarEDTA37.3mg/l、酒石酸氨0.1151mg/l;2) 将步骤1)得到的原丝体转入原丝体扩繁培养基上，进行培养40~60 天，培养条件为温度20-25。C,光照强度2000-4000 lx,光照时间10~12 小时/天；所述原丝体扩繁培养基的配方为改良Kiwp培养基+ 0 ~ 2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸或0~2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖，其中改良Knop 培养基配方为KC1 76.04mg/l、 MgS04 . 7H20 828.2mg/l、 KH2PO4250.4mg/l、 Ca(N03)2 '41120 1001.3mg/l、CuSO4 '5H20 0.027mg/l、KI 0.014mg/l、ZnSO4 7H20 0.027mg/l、H3BO3 0.309mg/l、NaMoO4 .2H20 0.012mg/l、MnCl2 '4H20 0.198mg/l、 CoCl2 6H20 0.027mg/l、 FeS04 . 7H20 27.8mg/l、 Na2-EDTA 37.3mg/l、酒石酸 氨0.1151mg/l;3) 将步骤2)扩繁得到的原丝体转入诱导原丝体形成配子体的培养基上， 进行培养40 60天，培养条件为温度25 3(TC,光照强度3000 ~ 4000 lx, 光照时间12~14小时/天；所述诱导原丝体形成配子体的培养基配方为改良 White培养基+ 0 ~ 2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖，其中改良White 培养基配方为認03 80mg/l、 MgS04 '7&0 720mg/l、 NaH2P04 '41120 16.5mg/l、KC1 65mg/l、 Na2S04 200mg/l、 Ca(N03)2 .4H20 300mg/l、 CuS04 .5H20 0.001mg/l、 ZnS04 .7H2O3.0mg/l、H3BO3 1.5mg/l、NaMo04 .2H20 0細lmg/1、 MnS02 .4H20 7.0mg/l、 FeNa-EDTA 4.588mg/l、肌醇100 mg/l、烟酸0.3 mg/l、盐酸硫胺素 0.1mg/l、盐酸吡P多辛0.1 mg/l、甘氨酸3mg/1。所述方法中对配子体表面进行消毒的消毒剂为70 ~ 75%体积分数的酒精 溶液和0.1%~0.2%体积分数的升汞溶液。所述方法中切取的茎尖来源于幼叶尚未展开的配子体，长度为0.5-l.Ocm。所述诱导配子体产生原丝体的培养基配方优选为改良Knop + 2.0mg/1 2,4-二氯苯氧乙酸+ 0.1mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖。所述原丝体扩繁培养基的配方优选为改良Knop培养基+ 1.0mg/l 2，4-二 氯苯氧乙酸或1.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖。所述诱导原丝体形成配子体的培养基配方优选为改良White培养基+ l.Omg/1 6-糠基氨基嘌呤或不附加任何植物激素+ 5 ~ 10g/l蔗糖。所述步骤1)中的培养条件优选为温度23 ± 2°C,光照强度2500 ± 250 lx, 光照时间10小时/天，培养50天。所述步骤2)中的培养条件优选为温度23 ± 2°C ，光照强度3000 ± 250 lx， 光照时间12小时/天，培养55天。所述步骤3)中的培养条件优选为温度27 ± 2°C ，光照强度3500 ± 250 k， 光照时间14小时/天，培养60天。本发明的有益效果为首次建立了人工扩繁暖地大叶藓配子体的方 法，填补了现有技术的空白；并且，使用本发明的人工扩繁方法，极利于高度 集约化和高密度工产化生产，也利于自动化控制生产；在短时间内可实现人工 大量扩繁暖地大叶藓，为制药领域提供巿场保障，经济效益明显。
具体实施方式
本发明公开的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法包括以下顺序步骤 1)将生长于自然环境中未展开叶片的暖地大叶藓配子体表面消毒后，切 取茎尖接种到诱导配子体产生原丝体的培养基上，进行培养40 60天，培养条件为温度20-25。C,光照强度2000 ~ 4000 lx,光照时间10 ~ 12小时/天； 所述诱导配子体产生原丝体的培养基配方为改良Kn叩培养基+ 0 ~ 2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+ 0 0.10mg/1 6-苄基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖，其中改良 Knop培养基配方为KCl 76.04mg/l、 MgS04 7H20 828.2mg/l、 KH2P04 250,4mg/l、 Ca(N03)2 .4H20 1001.3mg/l、 CuS04 .5H20 0.027mg/l、 KI 0.014mg/l、 ZnS04 . 7H20 0.027mg/l、 H3B03 0.309mg/l 、 NaMo04 . 2H20 0.012mg/l、 MnCl2 . 4H20 0.198mg/l、 CoCl2 6H20 0.027mg/l、 FeS04 . 7H20 27.8mg/l、 Na2-EDTA37.3mg/l、酒石酸氨0.1151mg/l;2) 将步骤1)得到的原丝体转入原丝体扩繁培养基上，进行培养40-60 天，培养条件为温度20 25。C,光照强度2000 ~ 4000 lx，光照时间10-12 小时/天；所述原丝体扩繁培养基的配方为改良Knop培养基+ 0 ~ 2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸或0 ~ 2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖，其中改良Knop 培养基配方为KCl 76.04mg/l、 MgS04 . 7H20 828.2mg/l、 KH2PO4250.4mg/l、 Ca(N03)2 4H20 1001.3mg/l、CuSO4 .5H20 0.027mg/l、KI 0.014mg/l、ZnSO4 '71120 0.027mg/l、H3BO3 0.309mg/l、NaMoO4 .2H20 0.012mg/l、MnCl2 '4H20 0.198mg/l、 CoCl2 . 6H2O0.027mg/l、 FeS04 . 7H2027.8mg/l、 Na2-EDTA37.3mg/l、酒石酸 氨0.1151mg/l;3) 将步骤2)扩繁得到的原丝体转入诱导原丝体形成配子体的培养基上， 进行培养40 60天，培养条件为温度25 3(TC，光照强度3000 ~ 4000 lx， 光照时间12~14小时/天；所述诱导原丝体形成配子体的培养基配方为改良 White培养基+ 0 ~ 2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖，其中改良White 培养基配方为KN03 80mg/l、 MgS04 '71120 720mg/l、 NaH2P04 '41120 16.5mg/l、 KCl 65mg/l、Na2SO4200mg/l、Ca(NO3)2 4H20 300mg/l、 CuS04 .5H20 0.001mg/l、 ZnS04 .7H2O3.0mg/l、H3BO3 1.5mg/l、NaMo04 .2H20 0.0001mg/l、 MnS02 '41120 7.0mg/l、 FeNa-EDTA 4.588mg/l、肌醇100 mg/l、烟酸0.3 mg/l、盐酸硫胺素 0.1mg/l、盐酸吡喷辛0.1 mg/l、甘氨酸3mg/1。所述方法中对配子体表面进行消毒的消毒剂为70 ~ 75%体积分数的酒精 溶液和0.1%~0.2%体积分数的升汞溶液。所述方法中切取的茎尖来源于幼叶尚未展开的配子体，长度为0.5~l.Ocm。下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明 实施例1将生长于自然环境中未展开叶片的暖地大叶藓配子体进行表面消毒，消毒 剂为70~75%体积分数的酒精溶液和0.1%~0.2%体积分数的升汞溶液；消毒 后，将切取长度为0.5 ~1.0cm的茎尖接种到诱导配子体产生原丝体的培养基 上，培养条件为温度23土2。C，光照强度2500 ± 250 lx，光照时间10小时/ 天，培养50天。按常规方法制备诱导配子体产生原丝体的培养基，配方组成为以下五种a) 改良Knop + 5 10g/l蔗糖；b) 改良Knop + O.lmg/1 6-节基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖；c) 改良Knop + 2,0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+ 5 ~ 10g/l蔗糖；d) 改良Knop + 1.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸+ 0.05mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖；e) 改良Knop + 2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+ O.lmg/1 6-苄基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖。所述改良Knop培养基配方为KC1 76.04mg/l、 MgS04 7H20 828.2mg/l、 KH2PO4250.4mg/l、 Ca(N03)2 . 4H20 1001.3mg/l、 CuS04 5H20 0.027mg/l、 KI 0.014mg/l、ZnSO4 '71120 0.027mg/l、H3BO3 0.309mg/l、NaMoO4 .2H20 0.012mg/l、 MnCl2 . 4H20 0.198mg/l、 CoCl2 6H20 0.027mg/l、 FeS04 . 7H20 27.8mg/l、 NarEDTA37.3mg/l、酒石酸氨0.1151mg/l。培养结果如下a) 改良Knop + 5 10g/l蔗糖的培养基中，外植体100%褐变死亡，未能诱 导形成原丝体；b) 改良Knop + O.lmg/1 6-节基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基中，有 8.2%的外植体上产生了单一 的配子体小芽，其余全部褐变死亡；c) 改良Knop + 2.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基中，仅 有11.6%的外植体产生了原丝体，原丝体为绿色，由外植体与培养基相接触的 部位向四周呈放射状生长，经测量其生长圈平均直径为0.92cm;d) 改良Knop + 1.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+ 0.05mg/l 6-节基氨基喋呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基中，有38.6%的外植体产生了原丝体，原丝体为绿色，由外 植体与培养基相接触的部位向四周呈放射状生长，经测量其生长圈平均直径为 1.12cm;e) 改良Knop + 2.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸+ O.lmg/1 6-节基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基中，有88.6%的外植体产生了原丝体，原丝体为绿色，由外 植体与培养基相接触的部位向四周呈放射状生长，经测量其生长圈平均直径为 4.62cm。比较上述培养结果可以看出离体条件下，诱导暖地大叶藓配子体形成原 丝体，培养基中激素的添加是必须的。在改良Knop培养基的基础上，添加激 素的种类及其浓度对诱导配子体形成原丝体有重要影响。单一添加6-苄基氨基 嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸都不利于原丝体的形成，而二者复合使用时诱导效果 明显，尤其以2.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸配合O.lmg/1 6-苄基氨基嘌呤时诱导效 果最好。实施例2将生长于自然环境中未展开叶片的暖地大叶藓配子体进行表面消毒，消毒 剂为70~75%体积分数的酒精溶液和0.1%~0.2°/。体积分数的升汞溶液；消毒 后，将切取长度为0.5~1.0cm的茎尖接种到诱导配子体产生原丝体的培养基 上，所述诱导配子体产生原丝体的培养基配方为改良Knop + 2.0mg/1 2,4-二 氯苯氧乙酸+ O.lmg/1 6-苄基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖，其中改良Knop培养基 配方为KC1 76.04mg/l、 MgS04 7H20 828.2mg/l 、 KH2P04 250.4mg/l 、 Ca(N03)2 '4H20 1001.3mg/l、CuSO4 '5H20 0.027mg/l、KI 0.014mg/l、ZnSO4 7H20 0.027mg/l、 H3B03 0.309mg/l、 NaMo04 . 2H20 0.012mg/l、 MnCl2 . 4H20 0.198mg/l、 CoCl2 '6H20 0.027mg/l、 FeS04 '71120 27.8mg/l、 Na2-EDTA 37.3mg/l、 酒石酸氨0.1151mg/1,按常规方法制备成诱导配子体产生原丝体的培养基，按 以下五种培养条件进行培养a) 温度23土2。C，光照强度2500 ± 2501 x,光照时间10小时/天，培养50天；b) 温度23土2。C，光照强度2500 ± 2501 x，光照时间12小时/天，培养50天；c) 温度23土2。C，光照强度2500 ± 2501 x，光照时间10小时/天，培养40天；d) 温度23士2。C，光照强度2500 ± 2501 x,光照时间10小时/天，培养60天；e) 温度23土2。C，光照强度3500 ± 2501 x,光照时间10小时/天，培养50天。培养结果如下a) 温度23土2。C,光照强度2500 ± 2501 x,光照时间10小时/天，培养50 天时，有88.6%的外植体产生了原丝体，原丝体为绿色，由外植体与培养基相 接触的部位向四周呈放射状生长，经测量其生长圏平均直径为4.62cm;b) 温度23士2。C,光照强度2500 ± 2501 x,光照时间12小时/天，培养50 天时，有68.4%的外植体产生了原丝体，原丝体为绿色，由外植体与培养基相 接触的部位向四周呈放射状生长，经测量其生长圃平均直径为2.62cm;c) 温度23士2。C,光照强度2500 ± 2501 x，光照时间10小时/天，培养40 天时，有86.4%的外植体产生了原丝体，原丝体为绿色，由外植体与培养基相 接触的部位向四周呈放射状生长，经测量其生长圈平均直径为3.38cm;d) 温度23士2。C,光照强度2500 ± 2501 x,光照时间10小时/天，培养60 天时，有88.6%的外植体产生了原丝体，原丝体由外植体与培养基相接触的部 位向四周呈放射状生长，颜色由原先的绿色变为暗绿色，尤其是原丝体生长圈 的中心部位明显变黑，经测量其生长圈平均直径为4.66cm;e) 温度23士2。C，光照强度3500 ± 2501 x，光照时间10小时/天，培养50 天时，有48.2%的外植体产生了原丝体，原丝体为绿色，由外植体与培养基相 接触的部位向四周呈放射状生长，经测量其生长圈平均直径为2.34cm。比较上述培养结果可以看出，光照强度和光照时间对于诱导外植体产生原 丝体有影响，光照增强和光照时间延长不利于诱导原丝体的形成。此外，培养 时间对诱导形成的原丝体的生长量有影响，培养时间延长，原丝体生长量增加。 但培养时间过长，会因为培养基中养分和水分的不足而导致原丝体生长停滞， 甚至死亡。实施例3将实施例l得到的绿色原丝体转入原丝体扩繁培养基上，培养条件为温 度23土2。C,光照强度3000 ± 250 lx，光照时间12小时/天，培养55天。 按常规方法制备原丝体扩繁培养基，配方组成为以下四种a) 改良Knop培养基+ 1.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+ 5 ~ 10g/l蔗糖；b) 改良Knop培养基+ 2.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸+ 5 ~ 10g/l蔗糖；c) 改良Knop培养基+ 1.0mg/l 6_糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖；d) 改良Knop培养基+ 2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖。 所述改良Knop培养基配方为KC1 76.04mg/l、 MgS04 . 7H20 828.2mg/l、KH2PO4250.4mg/l、 Ca(N03)2 4H20 1001.3mg/l、 CuS04 . 5H20 0.027mg/l、 KI 0.014mg/l、ZnSO4 .7H20 0.027mg/l、H3BO3 0.309mg/l、NaMoO4 '21120 0.012mg/l、 MnCl2 . 4H20 0.198mg/l、 CoCl2 6H20 0.027mg/l、 FeS04 . 7H20 27.8mg/l、 Na2-EDTA37.3mg/l、酒石酸氨0.1151mg/l。 培养结果如下a) 改良Knop培养基+ 1.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基 中，最初接种的直径约3 4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆形 的生长圈，生长速度较快，几乎长满培养基表面，经测量其生长圏平均直径为 6.52cm,原丝体为绿色；b) 改良Knop培养基+ 2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基 中，最初接种的直径约3~4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆形 的生长圈，生长速度较慢，经测量其生长圈平均直径为3.26cm，原丝体为绿色；c) 改良Knop培养基+1.0mg/1 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基 中，最初接种的直径约3 4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆形 的生长圈，生长速度较快，几乎长满培养基表面，经测量其生长圈平均直径为 6.36cm,原丝体为绿色，偶见配子体形成；d) 改良Knop培养基+ 2.0mg/1 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基 中，最初接种的直径约3 4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆形 的生长圈，生长速度较慢，经测量其生长圈平均直径为4.18cm,原丝体为绿色。比较上述培养结果可以看出，在改良Knop培养基的基础上，添加激素种类及浓度的不同对原丝体的生长有很大影响。2,4-二氯苯氧乙酸和6-糠基氨基 嘌呤都有利于原丝体的生长，但激素浓度过高不利于原丝体的生长。实施例4将实施例l得到的绿色原丝体转入原丝体扩繁培养基上，所述原丝体扩繁 培养基的配方为改良Knop培养基+1.0mg/1 2,4-二氯苯氧乙酸+ 5 ~ 10g/l蔗 糖，其中改良Knop培养基配方为KC1 76.04mg/l、 MgS04 . 7H20 828.2mg/l、 KH2PO4250.4mg/l、 Ca(N03)2 4H20 1001.3mg/l、 CuS04 5H20 0.027mg/l、 KI 0.014mg/l、ZnSO4 .7H20 0.027mg/l、H3BO3 0.309mg/l、NaMoO4 .2H20 0,012mg/l、 MnCl2 . 4H20 0.198mg/l、 CoCl2 . 6H20 0.027mg/l、 FeS04 . 7H20 27.8mg/l、 Na2-EDTA37.3mg/l、酒石酸氨0.1151mg/l，按常规方法制备成原丝体扩繁培养 基，按以下五种培养条件进行培养a) 温度23士2。C,光照强度3000 ± 250 lx,光照时间10小时/天，培养55天；b) 温度23士2。C,光照强度3000 ± 250 lx,光照时间12小时/天，培养55天；c) 温度23土2。C，光照强度3000 ± 250 lx,光照时间12小时/天，培养40天；d) 温度23土2。C，光照强度3000 ± 250 lx,光照时间12小时/天，培养60天；e) 温度23土2。C,光照强度2500 ± 250 lx,光照时间12小时/天，培养55天。培养结果如下a) 温度23士2。C，光照强度3000 ± 250 lx，光照时间10小时/天，培养55 天时，最初接种的直径约3 4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆 形的生长圈，经测量其生长圈平均直径为4.62cm,原丝体为绿色；b) 温度23土2。C,光照强度3000 ± 250 lx，光照时间12小时/天，培养55 天时，最初接种的直径约3~4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆 形的生长圈，原丝体几乎长满培养基表面，经测量其生长圈平均直径为6.52cm, 原丝体为绿色；c) 温度23士2。C，光照强度3000 ± 250 lx，光照时间12小时/天，培养40 天时，最初接种的直径约3~4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆 形的生长圈，经测量其生长圈平均直径为5.73cm，原丝体为绿色；d) 温度23士2。C,光照强度3000 ± 250 lx,光照时间12小时/天，培养60 天时，最初接种的直径约3~4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆 形的生长圈，经测量其生长圈平均直径为6.53cm，原丝体为绿色；e) 温度23土2。C,光照强度2500 ± 250 lx,光照时间12小时/天，培养55 天时，最初接种的直径约3~4mm的少量原丝体向四周呈辐射状生长，形成圆 形的生长圈，经测量其生长圈平均直径为4.58cm,原丝体为绿色。比较上述培养结果可以看出，光照强度和光照时间对原丝体扩繁增殖影响 较大。光照太弱和光照时间过短不利于暖地大叶藓原丝体的生长。此外，培养 时间的长短对原丝体的生长量影响明显，在养分和水分供应充足的条件下，培 养时间越长，原丝体的生长量越大。实施例5将实施例3得到的绿色原丝体转入诱导原丝体形成配子体的培养基上，培 养条件为温度27土2。C，光照强度3500 ± 250 lx,光照时间14小时/天，培 养60天。按常规方法制备诱导原丝体形成配子体的培养基，配方组成为以下三种a) 改良White培养基+ l.Omg/1 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖；b) 改良White培养基+ 2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖；c) 改良White培养基+ 5 ~ 10g/l蔗糖。所述改良White培养基配方为KN03 80mg/l、 MgS04 7H20 720mg/l、 NaH2P04 . 4H20 16.5mg/l、 KC1 65mg/l、 Na2S04 200mg/l、 Ca(N03)2 4H20 300mg/l、 CuS04 5H20 0.001mg/l、 ZnS04 7H20 3.0mg/l、 H3B03 1.5mg/l、 NaMo04 2H20 0扁lmg/1、 MnS02 4H20 7.0mg/l、 FeNa-EDTA 4.588mg/l、 肌醇100mg/l、烟酸0.3mg/1、盐酸硫胺素0.1 mg/l、盐酸P比^辛0.1 mg/l、甘 氨酸3 mg/l。培养结果如下a)改良White培养基+ l.Omg/1 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖的培养基中，形成了大量配子体，经统计，平均每瓶培养基中新生配子体数为22株，平均株高为1.82cm;b) 改良White培养基+ 2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖中，形成了 数量更多的配子体，经统计，平均每瓶培养基中新生配子体数为31株，平均 株高为1.01cm;c) 改良White培养基+ 5 10g/l蔗糖中，形成了较多配子体，经统计，平 均每瓶培养基中新生配子体数为12株，平均株高为2.06cm。比较上述培养结果可以看出，在改良White培养基上就可获得数量较多的 配子体。在改良White培养基的基础上添加适宜浓度的6-糠基氨基嘌呤能更加 促进配子体的分化形成，但不利于配子体生长。实施例6将实施例3得到的绿色原丝体转入诱导原丝体形成配子体的培养基上，所 述诱导原丝体形成配子体的培养基配方为改良White培养基+ l.Omg/16-糠基 氨基嘌呤+ 5 10g/1蔗糖，其中改良White培养基配方为KN03 80mg/l、 MgS04 .7H20 720mg/l 、 NaH2P04 4H20 16.5mg/l、 KC1 65mg/l、 Na2S04 200mg/l 、 Ca(N03)2 . 4H20 300mg/l、 CuS04 5H20 0.001mg/l、 ZnS04 7H20 3.0mg/l、 H3B03 1.5mg/l、 NaMo04 .2H20 0.0001mg/l、 MnS02 .4H20 7.0mg/l、 FeNa-EDTA 4.588mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.3mg/1、盐酸硫胺素0.1 mg/l、盐酸吡哆辛 0.1mg/l、甘氨酸3mg/1，按常规方法制备成诱导原丝体形成配子体的培养基， 按以下五种培养条件进行培养a) 温度27土2。C，光照强度3500 ± 250 lx,光照时间14小时/天，培养60天；b) 温度27土2。C,光照强度3500 ± 250 lx，光照时间14小时/天，培养40天；c) 温度27土2。C,光照强度3500 ± 250 lx,光照时间14小时/天，培养50天；d) 温度27土2。C,光照强度3500 ± 250 lx,光照时间12小时/天，培养60天；e) 温度27士2。C，光照强度2500 ± 250 lx，光照时间14小时/天，培养60天。培养结果如下a) 温度27士2。C，光照强度3500 ± 250 lx，光照时间14小时/天，培养60 天时，原丝体上分化形成了大量配子体，经统计，平均每瓶培养基中新生配子 体数为22株，平均株高为1.82cm;b) 温度27土2。C，光照强度3500 ± 250 lx，光照时间14小时/天，培养仰 天时，原丝体上分化形成了配子体，经统计，平均每瓶培养基中新生配子体数 为16株，平均株高为1.04cm;c) 温度27土2。C，光照强度3500 ± 250 lx，光照时间14小时/天，培养50 天时，原丝体上分化形成了配子体，经统计，平均每瓶培养基中新生配子体数 为22株，平均株高为1.3cm;d) 温度27士2。C,光照强度3500 ± 250 lx，光照时间12小时/天，培养60 天时，原丝体上分化形成了配子体，经统计，平均每瓶培养基中新生配子体数 为9株，平均株高为1.06cm;e) 温度27土2。C,光照强度2500 ± 250 lx,光照时间14小时/天，培养60 天时，原丝体上分化形成了配子体，经统计，平均每瓶培养基中新生配子体数 为8株，平均株高为1.09cm。比较上述培养结果可以看出，光照强度和光照时间对配子体形成影响较 大。光照较弱和光照时间较短不利于暖地大叶藓配子体的形成，这与很多其他 高等植物芽的分化形成对光条件的要求是相似的。另外，培养时间的长短对配 子体的生长影响明显，在养分和水分供应充足的条件下，培养时间越长，配子 体长的越高。
权利要求
1.一种人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其特征在于，所述方法包括以下顺序步骤1)将生长于自然环境中未展开叶片的暖地大叶藓配子体表面消毒后，切取茎尖接种到诱导配子体产生原丝体的培养基上，进行培养40～60天，培养条件为温度20～25℃，光照强度2000～4000lx，光照时间10～12小时/天；所述诱导配子体产生原丝体的培养基配方为改良Knop培养基+0～2.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸+0～0.10mg/l 6-苄基氨基嘌呤+5～10g/l蔗糖，其中改良Knop培养基配方为KCl 76.04mg/l、MgSO4·7H2O 828.2mg/l、KH2PO4250.4mg/l、Ca(NO3)2·4H2O 1001.3mg/l、CuSO4·5H2O 0.027mg/l、KI 0.014mg/l、ZnSO4·7H2O 0.027mg/l、H3BO3 0.309mg/l、NaMoO4·2H2O 0.012mg/l、MnCl2·4H2O 0.198mg/l、CoCl2·6H2O 0.027mg/l、FeSO4·7H2O 27.8mg/l、Na2-EDTA 37.3mg/l、酒石酸氨0.1151mg/l；2)将步骤1)得到的原丝体转入原丝体扩繁培养基上，进行培养40～60天，培养条件为温度20～25℃，光照强度2000～4000lx，光照时间10～12小时/天；所述原丝体扩繁培养基的配方为改良Knop培养基+0～2.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸或0～2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+5～10g/l蔗糖，其中改良Knop培养基配方为KCl 76.04mg/l、MgSO4·7H2O 828.2mg/l、KH2PO4 250.4mg/l、Ca(NO3)2·4H2O 1001.3mg/l、CuSO4·5H2O 0.027mg/l、KI 0.014mg/l、ZnSO4·7H2O0.027mg/l、H3BO3 0.309mg/l、NaMoO4·2H2O 0.012mg/l、MnCl2·4H2O 0.198mg/l、CoCl2·6H2O 0.027mg/l、FeSO4·7H2O 27.8mg/l、Na2-EDTA 37.3mg/l、酒石酸氨0.1151mg/l；3)将步骤2)扩繁得到的原丝体转入诱导原丝体形成配子体的培养基上，进行培养40～60天，培养条件为温度25～30℃，光照强度3000～4000lx，光照时间12～14小时/天；所述诱导原丝体形成配子体的培养基配方为改良White培养基+0～2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+5～10g/l蔗糖，其中改良White培养基配方为KNO3 80mg/l、MgSO4·7H2O 720mg/l、NaH2PO4·4H2O 16.5mg/l、KCl 65mg/l、Na2SO4 200mg/l、Ca(NO3)2·4H2O 300mg/l、CuSO4·5H2O 0.001mg/l、ZnSO4·7H2O 3.0mg/l、H3BO3 1.5mg/l、NaMoO4·2H2O 0.0001mg/l、MnSO2·4H2O7.0mg/l、FeNa-EDTA 4.588mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.3mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆辛0.1mg/l、甘氨酸3mg/l。
2. 根据权利要求1所述的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其特征在 于，所述方法中对配子体表面进行消毒的消毒剂为70~75%体积分数的酒精溶 液和0.1%~0.2°/。体积分数的升汞溶液。
3. 根据权利要求1所述的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其特征在 于，所述方法中切取的茎尖来源于幼叶尚未展开的配子体，长度为0.5 ~ l.Ocm。
4. 根据权利要求1所述的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其特征在 于，所述诱导配子体产生原丝体的培养基配方为改良Knop + 2.0mg/l 2,4-二 氯苯氧乙酸+ 0.1mg/l 6-苄基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖。
5. 根据权利要求1所述的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其特征在 于，所述原丝体扩繁培养基的配方为改良Knop培养基+1.0mg/12,4-二氯苯 氧乙酸或1.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤+ 5 ~ 10g/l蔗糖。
6. 根据权利要求1所述的人工扩繁暖地大叶蘚配子体的方法，其特征在 于，所述诱导原丝体形成配子体的培养基配方为改良White培养基+ 1.0mg/1 6-糠基氨基嘌呤或不附加任何植物激素+ 5 ~ 10g/l蔗糖。
7. 根据权利要求1所述的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其特征在 于，所述步骤l)中的培养条件为温度23士2。C，光照强度2500 ± 250 lx，光 照时间10小时/天，培养50天。
8. 根据权利要求1所述的人工扩繁扩繁暖地大叶蘚配子体的方法，其特 征在于，所述步骤2)中的培养条件为温度23土2。C,光照强度3000 ± 250 lx, 光照时间12小时/天，培养55天。
9. 根据权利要求1所述的人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其特征在 于，所述步骤3)中的培养条件为温度27士2。C,光照强度3500 ± 250 k，光 照时间14小时/天，培养60天。
全文摘要
本发明公开了一种人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，其包括以下顺序步骤1)将生长于自然环境中未展开叶片的暖地大叶藓配子体表面消毒后，切取茎尖接种到诱导配子体产生原丝体的培养基上，进行培养40～60天；2)将步骤1)得到的原丝体转入原丝体扩繁培养基上，进行培养40～60天；3)将步骤2)扩繁得到的原丝体转入诱导原丝体形成配子体的培养基上，进行培养40～60天。本发明首次建立了人工扩繁暖地大叶藓配子体的方法，填补了现有技术的空白；使用本发明的人工扩繁方法，极利于高度集约化和高密度工产化生产，也利于自动化控制生产；在短时间内可实现人工大量扩繁暖地大叶藓，为制药领域提供市场保障，经济效益明显。
文档编号C12N5/04GK101248759SQ200810034650
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月14日 优先权日2008年3月14日
发明者娄玉霞, 同 曹, 郭水良, 陈圆圆 申请人:上海师范大学