专利名称：：一种利用整合子系统定点、定向的基因重组方法
技术领域：
：本发明属生物
技术领域：
，涉及一种基因重组的方法，具体涉及一种利用整合子系统将目的基因定点且定向地进行基因重组的方法。
背景技术：
：已知在生物技术研究中，将目的基因插入到染色体基因组DNA，可以采用同源重组的办法或使用转座子的方法，但实践表明，同源重组的效率较低，操作麻烦，并且由于目的基因的插入而使原有基因遭受破坏；使用转座子的方法，也存在插入到染色体的部位是随机的，而且操作使用的转座酶价格昂贵等缺陷。整合子由于其与细菌的多重耐药性有关而得到广泛的关注。近年来在非临床菌株中发现有整合子的存在，其分布范围要比预期广得多。目前，本领域的有关学者主张将整合子作为细菌基因进化的有力工具。通常，一个整合子至少包括三个最基本的元件编码属于酪氨酸重组酶家族的整合酶的基因，位于整合酶编码区而与整合酶编码方向相反的驱动下游基因盒表达的启动子Pc，整合酶所识别的重组位点attl。基因盒由一个通常无启动子的开放读码框和3'端整合酶重组识别位点attC构成。整合酶通常催化三种类型的重组反应attlxattl、attlxattC、attCxattC，其中attlxattC之间的重组效率比另外两种高得多，在此，由于attC序列具有一定的方向性，因而使得整合到attl位点的基因盒与Pc启动子方向一致而使其相应的基因得到有效的表达。研究表明，数个基因盒可以同时存在于一个整合子中，其相应基因的表达水平通常与其在整合子中的位置有关。距离Pc启动子越近的基因盒其表达水平越高，因此插入到attl位点的基因盒表达水平最高。
发明内容本发明目的是提供一种简便、快速的基因重组的方法，具体涉及一种利用整合子系统将目的基因定点且定向地进行基因重组方法，尤其涉及一种利用整合子系统将目的基因定点且定向地插入到大肠杆菌染色体的基因重组方法。本发明利用含有目的DNA片段的基因盒插入到整合子的attl位点时表达水平增高的原理，对阳性克隆进行筛选。本方法采用整合子系统作为工具，首先构建在多克隆位点两侧含有attC序列的工具载体，然后将目的基因克隆到该载体，目的基因在宿主菌表达整合酶的情况下，能够定点且定向地插入到大肠杆菌基因组DNA中的attI位点。实践证明，本方法简便易行，只需常规简单的基因克隆操作，仅需要4天时间就可以将目的基因插入到宿主菌的染色体DNA中。所述的整合子系统作为分子生物学工具具有良好的应用前景，例如可用于获取含有目的基因的大片段DNA;同时，目的基因插入到宿主染色体定点且定向的特性，在基因治疗中将有助于解决目的基因插入到基因组DNA的靶向性问题等。本发明通过下述技术方案和方法实现1、通过PCR扩增获取目的基因；2、通过下述步骤制备工具载体构建工具载体pACZC，其特征是在来源于pUC19质粒(TaKaRa)的LacZ基因的两侧引入整合酶识别重组序列attC,将该片段克隆到pACYC184质粒(JBacteriol，1978，134:1141-1156.)，该重组质粒命名为pACZC，利用其上LacZ上的多克隆位点，将任意DNA片段装配成基因盒结构。在上述pACZC质粒的LacZ编码区加入筛选标志基因aadA2，其编码对链霉素的抗性，该重组质粒命名为pACAZC。3、定点、定向地将目的基因插入到大肠杆菌的染色体中将高表达整合酶的质粒pUCINT(中华检验医学杂志，2007，30:1398-1400)转化菌株DHS(专利申请号200810033538.7)，在该株细菌的染色体DNA的已知位点含有整合酶识别重组序列attl，转化后的细菌命名为DHS1;将目的基因克隆到工具载体pACAZC的多克隆位点，转化DHS1菌株，利用整合酶催化高效率的attC位点和位点attl位点之间的重组反应，以及其对attC位点识别的方向性，实现目的基因定点且定向地插入到DHS1菌株染色体DNA的attl位点。利用筛选标志基因aadA2插入到attl位点时获得整合子的面有启动子Pc而高效表达，在含有链霉素的LB琼脂平板中筛选得到阳性克隆。为消除aadA2基因背景表达造成的假阳性克隆，使用PCR技术对筛选到的阳性克隆作进一步的鉴定。采用本发明建立的方法及配套工具载体，在不使用特殊设备和试剂的情况下，仅用4天时间就可以把目的基因定点且定向地插入到大肠杆菌染色体。本方法简便、快速、成本低廉，可应用于分子生物学技术。图1是目的基因插入到DHS1菌株基因组DNA的流程图，其中，在HS1菌株中的矩形标志表示目的基因在染色体上的插入位点，在筛选到的阳性克隆中较小的矩形标志表示插入到大肠杆菌基因组的目的基因。图2是重组质粒pACZC的结构示意图，其中，attCs和attCe是整合酶所识别的重组序列，其中attCs端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时靠近attl位点，而attCe端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时远离attl位点，为克隆目的基因可采用的限制性酶切位点有Hindin、Pstl、Sse8387I、SmaI、KpnI、SacI、PvuI、NdeI、ApalI。图3是重组质粒pACAZC的结构示意图，其中，attCs和attCe是整合酶所识别的重组序列，其中attCs端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时靠近attl位点，而attCe端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时远离attl位点，aadA2为编码链霉素抗性筛选标记的基因，AAFQ为用于筛选阳性克隆所用的引物，为克隆目的基因可采用的限制性酶切位点有XhoI、BglII、Mlul、ApaI、SmaI、KpnI、SacI、PvuI、NdeI、ApalI。图4是筛选阳性克隆用扩增曲线，其中,A为从链霉素平板上挑选的三个含有质粒pACSA2的DHS1菌落为模板的扩增曲线；B为从链霉素平板上挑选的三个含有质粒pACSAll的DHS1菌落为模板的扩增曲线；1、2、3分别为菌落编号。图5是扩增产物的融解曲线图，其中，A图对应于图4.A扩增产物的融解曲线，B图对应于图4.B扩增产物的融解曲线，1、2、3分别为菌落编号。图6是PCR扩增产物的电泳图，其中，A图为以筛选出的在染色体DNA已插入200pb的菌落为模板的PCR扩增产物的电泳图，B图为以筛选出的在染色体DNA已插入l.lkb的菌落为模板的PCR扩增产物的电泳图。图7表示将图6A1泳道的扩增产物切胶纯化后的测序结果，划线部分序列与引物SA2一致。图8表示将图6B1泳道的扩增产物切胶纯化后的测序结果，划线部分序列与引物SA11一致。具体实施方式实施例1构建工具载体pACAZC，其通过下述步骤实现(1)用重叠PCR技术构建含有attCs-LacZ-attCe基因盒的重组质粒pACZC，构建过程如下述attCs的扩增体系为去离子水18.88ul，10Xbuffer2.5u1，dNTP2.0ix1，引物AADL0.5ul，引物LAP2N0.5u1，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，148号菌株基因组DNA0.5p1(该菌株含有的整合子序列与pCTX-M3质粒上的整合子的序列相同，GenBankaccessionnumber:AF550415.2)。扩增条件为95。C预变性5分钟，94。C30秒，5(TC30秒，72。C30秒，共30个循环，最后72。C延伸7分钟。attCe的扩增体系为去离子水18.88u1，10Xbuffer2.1，d證2.0iU，引物AADUCLO.5ul，引物LAP50.5ul，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，148号菌株基因组DNA0.5iU，扩增条件同前。LacZ的扩增体系为去离子水18.88u1，10Xbuffer2.5li1，dNTP2.0y1，引物LAP30.5u1，引物LAP4N0.5u1，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12iU，稀释过后的pUC19质粒0.5ixl，扩增条件同前。取1h1attCs扩增产物加100u1去离子水稀释后标为attCs稀释，取1y1attCe扩增产物加100u1去离子水稀释后标为attCe稀释，取1y1LacZ扩增产物加100u1去离子水稀释后标为LacZ稀释。attCs-Z的扩增体系为去离子水18.88u1，10Xbuffer2.5u1，dNTP2.0ul，引物LAP4N0.5ul，引物AADL0.5nl，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，attCs稀释0.5^1，LacZ稀释0.5yl，扩增条件同前，将扩增产物切胶纯化后标为attCs-Z纯化。Z-attCe的扩增体系为去离子水18.88n1，10Xbuffer2.5u1，dNTP2.0Ul，引物LAP30.5ul，引物AADUCL0.5ul，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12yl，attCe稀释0.5ul，LacZ稀释0.5ul，扩增条件同前，将扩增产物切胶纯化后标为Z-attCe纯化。对attCs-Z纯化和Z-attCe纯化用EcoRI(TaKaRa)酶切，酶切体系为attCs-Z纯化(或Z-attCe纯化)34n1，10XHBuffer4u1，EcoRI(TaKaRa)2yl，37°Clh65°C10rain。对酶切产物切胶回收纯化，获取目的片段，各取21.5yl，10XLigaseBuffer5ul，T4DNALigase(TaKaRa)2u1，16°Clh65。C10min，对连接产物切胶回收纯化，获取目的片段，取1^1加100p1去离子水稀释后标为attCs-Z-attCe稀释。attCs-Z-attCe的扩增体系为去离子水18.88y1,10Xbuffer2.5"1，dNTP2.Owl,引物AADL0.5ul，引物AADUCL0.5ul，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，模板attCs-Z-attCe稀释0.5nl，扩增条件同前，扩增结束后对扩增产物切胶回收纯化，取该纯化产物34ul，10XHbuffer4ul，ClaI(TaKaRa)2ul，30°Clh65°C10min，对酶切产物切胶回收纯化，标为attCs-Z-attCe切纯。同样对pACYC184质粒用ClaI(TaKaRa)和EcoRV(TaKaRa)酶切，对酶切产物切胶回收纯化，标为pACYC184切纯。取attCs-Z-attCe切纯4u1，pACYC184切纯1u1，连接液SolutionI5ul，16°ClOh65°C10min。取上述连接产物5u1转化50ulDH5a感受态细胞，涂布氯霉素平板，37"过夜培养后挑取阳性克隆，提取质粒作初步鉴定，最后经测序确证。所构建的pACZC重组质粒如图2所示。表1是构建pACZC重组质粒过程中使用的引物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)在pACZC质粒的LacZ中插入链霉素筛选标志基因aadA2，并且在适当位置引入数个限制性内切酶位点，该重组质粒命名为pACAZC，具体构建过程如下aadA2基因的扩增体系为去离子水40.5ul，10Xbuffer5wl，d,2.0"引物AADPFl.Oyl，引物AADSRl.Oul,PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.25ul，148号菌株基因组DNA0.25ul。扩增条件为95。C预变性5分钟，95°C30秒，55°C30秒，72'C60秒，共30个循环，最后72'C延伸7分钟。扩增结束后对扩增产物切胶回收纯化，取该纯化产物34ul，10XHbuffer4u1，PstI(TaKaRa)2ul，37°Clh65°C10min，对酶切产物切胶回收纯化后，进行第二次酶切，上述酶切纯化产物30ul,10XTbuffer4u1，0.1%BSA4yl,SmaI(TaKaRa)2ul，30°Clh65°C10min，对酶切产物切胶回收纯化，标为aadA2切纯。同样对pACZC质粒用PstI和SmaI酶切，对酶切产物切胶回收纯化，标为pACZC切纯。取aadA2切纯4u1，pACZC切纯lul，连接液Solution15ul，16°C10h65°C10min。取上述连接产物5ul转化50DH5a感受态细胞，涂布氯霉素平板，37'C过夜培养后挑取阳性克隆，提取质粒作初步鉴定，最后经测序确证。所构建的pACZAC重组质粒图3所示。表2是构建pACZAC重组质粒过程中使用的引物。表2_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2应用该体系将pACYC184质粒上约200bp和l.lkb大小的片段为例，作为目的基因定点且定向地插入大肠杆菌基因组DNA中。(1)在pACAZC的多克隆位点处插入pACYC184质粒上约200bp和1.lkb大小的片段，并将该重组质粒分别命名为pACSA2和pACSAll，具体操作过程如下述表3是构建重组质粒pACSA2和pACSAll过程中使用的引物。表3_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>获取200bp目的基因的扩增体系为去离子水40.5ul，10Xbuffer5u1，dNTP2.0y1，引物SM14561.0p1，引物SA21.0u1，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.25ul，稀释后的pACYC184质粒0.25"1。扩增条件为95"C预变性5分钟，95°C30秒，55"C30秒，72'C60秒，共30个循环，最后72'C延伸7分钟。扩增结束后对扩增产物切胶回收纯化，取该纯化产物34ul，10XLbuffer4ul，SacI(TaKaRa)2yl，37'Clh65°C10min，对酶切产物切胶回收纯化后，进行第二次酶切，酶切体系为上述酶切纯化产物30Pi,10XTbuffer4ul，O.1%BSA4nl，SmaI(TaKaRa)2ul，30°Clh65°ClOmin，对酶切产物切胶回收纯化，标为SA2切纯。同样对pACAZC质粒用SacI和SmaI酶切，对酶切产物切胶回收纯化，标为pACAZC切纯。取SA2切纯4ul，pACAZC切纯lnl，连接液SolutionI5u1，16°C10h65°C10min。取上述连接产物5u1转化50y1DH5a感受态细胞，涂布氯霉素平板，37。C过夜培养后挑取阳性克隆，提取质粒作初步鉴定，最后经测序确证。所构建的重组质粒命名为pACSA2。按同样的方法，使用引物SAll和SM1456构建在pACAZC质粒的LacZ多克隆位点插入片段长度约为1.lkb重组质粒，并将其命名为pACSAll。(2)将上述重组质粒pACSA2和pACSAll转化DHS1感受态细胞，涂布氯霉素抗性平板，过夜培养后，挑选阳性克隆接种5mlLB液体培养基，并加10Wl氨苄青霉(终浓度为lOOixg/ml)素和10氯霉素(终浓度为20ug/ml)。过夜培养后取100u1菌液加lmlLB液体培养基稀释，取IOOyl涂布链霉素(20ug/ml)抗性平板，过夜培养。(3)用罗氏LightCycler进行real-timePCR快速筛选阳性克隆，通过下述步骤从上述过夜培养后的链霉素抗性平板上挑选三个菌落，加入50u1去离子水，振荡混匀，IOO'C煮沸IO分钟后，10000转离心1分钟，取上清作为模板进行real-timePCR。扩增体系为，SYBRPremixExTaq(TaKaRa)5^1，引物5CS5'GGCATCCAAGCAGCAAGC3'和AAFQ5'CATCCACTGCGGAGCCGTAC3'各0.2pl，3.6pl去离子水，1.0pl前述待测定模板。扩增条件为95"预变性10s，随后95'C变性10s，62'C退火8s，72'C延伸10s，共40个循环。扩增结束后融解曲线的测定条件为从5(TC上升到95'C，上升速度为每秒O.1°C。扩增曲线见图4，可见l号扩增曲线对应的为阳性克隆；扩增产物的融解曲线见图5，其中A图对应于图4.A扩增产物的融解曲线，B图对应于图4.B扩增产物的融解曲线，1、2、3分别为菌落编号。可见1号阳性克隆扩增产物的融解曲线呈单峰，说明扩增是特异的。(4)用PCR技术对筛选出的阳性克隆中目的基因的插入位点作进一步鉴定，测序确证扩增产物，通过下述步骤扩增体系为，去离子水68nl，10XLAbuffer10nl，dNTP16pl，扩增过程中使用的引物为DHFQ25'TTGGCTCCCATCGCAGCMC3'5CS5'GGCATCCMGCAGCAAGC3',引物DHFQ2和5CS各2[U，LATaqDNA聚合酶(TaKaRa)1pl，上述经real-timePCR证实为阳性克隆的DNA1扩增条件为95'C预变性5分钟，95'C1分钟，55'C1分钟，72'C1分钟，共30个循环，最后72'C延伸7分钟。扩增结束后取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，扩增产物的长度与预期一致(图6)，初步证明在阳性克隆中目的基因插入到染色体的attl位点。对扩增产物切胶回收纯化，使用DHFQ2为引物进行测序，以进一步确证目的基因以预期方向插入到预期位置。测序结果表明目的基因以预期的方向和位置插入到染色体中(图7，图8)。SEQUENCELISTING〈110>复旦大学附属华山医院〈120〉一种利用整合子系统定点、定向的基因重组方法〈130〉11〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉4698〈212〉腿<213〉细菌〈400〉1gaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaactt60gtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggtt120ataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattggga180tatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctga240aaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattstggtgaaagtt300ggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttccc360ggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtat420ttattcggcgc犯agtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgattt已gtgtatgatggt480gtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctgttcagctactg540acggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgctagcggagtgt已t已ct600ggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaa660aaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctc720actgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacg犯cggggc780ggagatttcctggaageitgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaa840agccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaa/tctgacgctcaaatc900agtggtggcg犯acccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccc%0tcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgc1020gtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggac1080tgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtctt1140gagtccaacccggaaagacatgcaa犯gcaccactggcagcagccactggt犯ttgattt1200agaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactga犯ggacaagttttggl加Otgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaacctt1320cgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagatt已cgcgc已gacc1380aaaacgaixtcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagatttcagtgca1440atttatctcttcaaatgt已gcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctc1500atgtttgacagcttatcatcgatccaactattgcgataac犯ga犯aagccagcctttca1560tgatatatctcccaatttgtgtagggcttattatgcacgcttaaaaataataaaagcaga1620cttgacctgatagtttggctgtgagcaattatgtgcttagtgcatctaacgccggagtta1680agccgccgcgcgtagcgcggtcggcttg犯cgaattgttagacactatgcggc已tcagag1740cagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggaga1800aaataccgc已tcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcg1860gtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgc犯ggcgatta1920agttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattc1980gagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatc2040atggtcatcgcttccctcatgatgtctaacgggcgaggta已gccgaccgcaga已tgcggg2100tcggcttgaccgaaatgttagaaccagaagccaaaatcgtccattccgacagcatcgcca2160gtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttc2220tcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggag2280ccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcctctacgccggac2340gcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgaca2400tcsccgatgggg犯gatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgg2460gtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccat2520tccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcagg2580agtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctcct2640tccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgc2700aactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgct2760ggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctc2820aagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccg2880gcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcg已ggctggatgg2940ccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggcca3000tgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctcgcggctc3060ttaccagcctaacttcgatcactggaccgctgatcgtcacggcgatttatgccgcctcgg3120cgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttgtctgcctcc3180ccgcgttgcgtcgc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技术领域：
，涉及一种利用整合子系统定点、定向的基因重组方法，采用整合子系统作为工具，首先构建在多克隆位点两侧含有attC序列的工具载体，然后将目的基因克隆到该载体，目的基因在宿主菌表达整合酶的情况下，能够定点且定向地插入到大肠杆菌基因组DNA中的attI位点。本方法简便易行，不需要特殊的仪器和试剂，仅需要4天时间就可将目的基因插入到宿主菌的染色体DNA中。所述的整合子系统作为分子生物学工具具有良好的应用前景，可用于获取含有目的基因的大片段DNA；同时，目的基因插入到宿主染色体定点且定向的特性，有助于解决在基因治疗中目的基因插入基因组DNA的靶向性问题。文档编号C12Q1/04GK101280301SQ20081003479公开日2008年10月8日申请日期2008年3月18日优先权日2008年3月18日发明者明关,元吕,杨泽华,楠陈,魏取好申请人:复旦大学附属华山医院