专利名称：：日本血吸虫微卫星位点及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物技术和遗传学领域，更具体地，本发明涉及一类血吸虫微卫星DNA，及其在日本血吸虫群体遗传学中的应用。
背景技术：
：SSR(SimpleSequenceRepeat)又称微卫星DNA，是一种新兴的分子标记，它是由2-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，它广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上。不同个体同一座位重复单位的重复数目可能不相同，因而形成多态性，即SSR分子标记。SSR比起RFLP和RAPD等其他的分子标记，具有多态性高，分析简便，易于实现自动化高通量筛选，成本低等优点，知道了其序列后，只要合成引物，做一次PCR反应就可得到结果，是一种理想的分子标记，已被应用于人类及其他物种的遗传图谱地建立。近年来，从日本血吸虫全基因组中发掘微卫星位点的研究越来越引起人们的重视，许多学者己经做了大量的研究。但由于缺少日本血吸虫全基因组数据库，许多研究所采用的位点均是曼氏血吸虫的微卫星位点，这给研究和应用工作带了问题。
发明内容本发明的目的在于提供一类血吸虫微卫星DNA。本发明的另一目的在于提供对应于所述的血吸虫微卫星DNA的引物。本发明的另一目的在于提供所述的血吸虫微卫星DNA在日本血吸虫群体遗传学中的应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸具有选自S6QIDN0:l-17任一所示的核苷酸序列。4本发明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，其作为微卫星标志物用于血吸虫遗传关系的确定；血吸虫基因的定位；血吸虫各种或各亚种间的保守性分析；血吸虫的进化分析；或血吸虫的品种或地域种群鉴定。在另一优选例中，所述的血吸虫是日本血吸虫OS"cAWo:yow"7'apo"/cww)。在本发明的第三方面，提供一种特异性扩增选自SEQIDNO:l-17任一所示的微卫星位点序列(其也可扩增存在于该相应的微卫星位点上(即与该微卫星位点基因座位相同)，但简单重复序列数目与该SEQIDNO:l-17所示的微卫星位点的简单重复序列数目不同(即序列的长度可不同)的序列)的引物(对)。在另一优选例中，所述的引物是引物对，所述的引物对具有选自以下序列对所示的序列SEQIDNO:18和SEQIDNO:19;SEQIDNO:20和SEQIDNO:21;SEQIDNO:22禾卩SEQIDNO:23;SEQIDNO:24禾nSEQIDNO:25;SEQIDNO:26和SEQIDNO:27;SEQIDNO:28和SEQIDNO:29;SEQIDNO:30和SEQIDNO:31;SEQIDNO:32和SEQIDNO:33;SEQIDNO:34和SEQIDNO:35;SEQIDNO:36禾PSEQIDNO:37;SEQIDNO:38禾tlSEQIDNO:39;SEQIDNO:40禾卩SEQIDNO:41;SEQIDNO:42禾nSEQIDNO:43;SEQIDNO:44和SEQIDNO:45;SEQIDNO:46和SEQIDNO:47;SEQIDNO:48和SEQIDNO:49;或SEQIDNO:50禾卩SEQIDNO:51。在本发明的第四方面，提供所述的引物的用途，用于测定血吸虫基因组中是否存在对应于所述的微卫星位点(具有与该微卫星位点相同的序列，或者位于该相应的位点(即与该微卫星位点基因座位相同)，但简单重复序列数目与所述的微卫星位点的简单重复序列数目不同(即序列的长度可不同))的多核苷酸。在本发明的第五方面，提供一种确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传关系的方法，所述方法包括(1)以所述的微卫星位点序列作为标记；(2)用特异性扩增(l)的微卫星位点序列的引物，分别对所述两种或多种样品中血吸虫的基因组DNA进行扩增，从而获得相应的扩增产物；(3)比较两种或多种样品中血吸虫的扩增产物的异同，从而确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传关系。在另一优选例中，通过电泳分析扩增产物的条带数目和/或位置情况，扩增产物的条带数目和/或位置一致性越高，表示两种或多种血吸虫之间的遗传关系越近；扩增产物的条目数目和/或位置差异越大，表示两种或多种血吸虫之间的遗传关系越远。在本发明的第六方面，提供一种用于确定血吸虫遗传关系、定位血吸虫基因、血吸虫各种或各亚种间保守性分析、血吸虫进化分析或血吸虫品种鉴定的检测试剂盒，所述的试剂盒中含有特异性扩增选自SEQIDNO:l-17任一所示的微卫星位点序列的引物(对)。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有选自下组的材料PCR扩增试剂，电泳试剂，或序列分析软件。在本发明的第七方面，提供一种用于遗传分析的多核苷酸集，所述的多核苷酸集包括SEQIDNO:1-17所示的微卫星位点序列。在另一优选例中，所述的多核苷酸集作为微卫星标志物的集合用于血吸虫遗传关系的确定血吸虫基因的定位；血吸虫各种或各亚种间的保守性分析；血吸虫的进化分析；或血吸虫的品种鉴定。在另一方面，提供一类特异性扩增所述多核苷酸集中的微卫星位点序列的引物(对)。在另一优选例中，所述的引物是引物对，所述的引物对具有选自以下序列对所示的序列SEQIDNO:18和SEQIDNO:19;SEQIDNO:20和SEQIDNO:21;SEQIDNO:22禾卩SEQIDNO:23;SEQIDNO:24禾卩SEQIDNO:25;SEQIDNO:26和SEQIDNO:27;SEQIDNO:28和SEQIDNO:29;SEQIDNO:30和SEQIDNO:31;SEQIDNO:32和SEQIDNO:33;SEQIDNO:34禾tlSEQIDNO:35;SEQIDNO:36禾卩SEQIDNO:37;SEQIDNO:38禾PSEQIDNO:39;SEQIDNO:40和SEQIDNO:41;SEQIDNO:42禾BSEQIDNO:43;SEQIDNO:44和SEQIDNO:45;SEQIDNO:46和SEQIDNO:47;SEQIDNO:48和SEQIDNO:49;或SEQIDNO:50和SEQIDNO:51。在另一方面，提供一种确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传关系的方法，所述方法包括(1)从所述的用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集中选出一个或多个微卫星位点序列作为标记；(2)用对应于相应微卫星位点序列的引物，分别对所述两种或多种样品中血吸虫的基因组DNA进行扩增，从而获得相应的扩增产物；(3)比较两种或多种样品中血吸虫的扩增产物的异同，从而确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传关系。在另一方面，提供一种用于确定血吸虫遗传关系、定位血吸虫基因、血吸虫各种或各亚种间保守性分析、血吸虫进化分析、血吸虫品种或地域种群鉴定的检测试剂盒或系统，所述的试剂盒或系统中含有特异性扩增所述多核苷酸集中一个或多个微卫星位点序列的引物(对)。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1.PCR扩增产物电泳图谱。其中，M:DNA标志物，1-96:96个武汉流行区的单个样本在位点sjpn8上的的PCR扩增产物。图2.杂合子样本基因扫描映描图。图3.纯合子样本基因扫描映描图。图4.江西省流行区各样本之间的遗传距离。图5.7个不同流行区(铜陵、贵池、都昌、常德、岳阳、沙市、西昌)日本血吸虫样本种群间的遗传差异(AMOVA)的分析。图6.7个不同流行区(铜陵、贵池、都昌、常德、岳阳、沙市、西昌)种群的UPGMA谱系图。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，开发出了一类适用于对血吸虫样本进行功能基因组研究、基因定位、亲缘鉴定、或品种鉴定的多核苷酸集，所述的多核苷酸集中包含有多个简单重复序列(微卫星位点序列，SSR)，利用对应于这些简单重复序列的特异性引物可以检测到血吸虫种群基因的多态性。因此，基于该多核苷酸集中的一个或多个简单重复序列可以分析血吸虫的遗传关系等。本发明人还基于所述简单重复序列设计了特异性的引物，所述引物扩增效果良好，扩增产物唯一。在此基础上完成了本发明。如本文所用，术语"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......构成"、"基本上由......构成"、禾P"由......构成"。如本文所用，所述的"简单重复序列"，"串联重复序列"，"SSR位点(序列)"，"微卫星序列"，"微卫星位点"，"微卫星DNA"可互换使用，均是指具有选自SEQIDNO:1-17任一所示的核苷酸序列。如本文所用，所述的"多核苷酸集"是一种多核苷酸的集合，其中含有SEQIDNO:l-17所示的多核苷酸。在用于遗传分析时，可以从所述的多核苷酸选出一条或多条所述的多核苷酸，作为SSR标记物。如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。简单重复序列如本文所用，所述的"简单重复序列(SSR)"又称为"串联重复序列(ShortTandemRepeats,STR),或"微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)"，是指一种短序列，例如一种单、二、三、四、或五-核苷酸，其在某一特定的核苷酸序列中至少重复一次。对于釆用SSR位点为遗传标记的种群遗传学研究，选择出合适的SSR位点显得尤为重要。首先，其单元结构要求简单，因为结构复杂(重复的碱基多，或者有其非重复碱基的插入)将会对后续分析带来一定的偏差；其次，微卫星位点所在的位置应该远离基因编码区，如果处于或接近基因编码区，这些位点就可能会在种群的传代过程中丢失，不能真实地反映群体的遗传特征；第三，所选取的微卫星位点原始序列要具有高度的特异性。此外，在被研究样本大小的选择上也有很高的要求，如果选取的样本数量太小，可能会失去一些等位基因，从而给样本之间遗传差异的计算带来偏差。因此，合适的SSR位点的选择需要经过大量的分析和试验工作。本发明所述的各SSR位点具有选自SEQIDNO:1-17任一所示的核苷酸序列。这些核苷酸序列的集合构成所述的多核苷酸集。本发明所述的SSR位点能有效的反映出某个种群所独有的遗传学特征，其具有以下特征所述位点都为3-4个碱基的重复序列且不包含复杂结构；所述位点的原始序列均为日本血吸虫基因组特异；所述位点的微卫星的重复次数在10-25次；并且，所述位点都处在全基因组中的位置远离编码区。引物尽管所述的多核苷酸集中的各SSR位点在不同的种群中可以是不同的(即含有简单重复序列的重复数目不同)，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用测序或电泳分析等技术就可获得其长度多态性。因此，本发明提供了可用于扩增所述的SSR位点的引物。所述的引物根据这些SSR位点两端的保守序列进行设计。引物的设计方法为本领域技术人员所熟知的方法。通常，可以针对一个SSR位点，根据其两端序列设计不同种引物，通过PCR试验确定最合适的引物。更特别的，在设计引物时，采用相近的Tm温度，以便使这些引物能够在高通量的扩增和检测中使用。此外，确保引物扩增的位点的唯一性是必要的。一般而言，18-26bp的寡核苷酸引物具有较好的特异性。采用所述的引物，可扩增出血吸虫(特别是日本血吸虫)基因组中相应的SSR位点。并且，釆用相同的引物对，以不同来源的血吸虫的基因组DNA为模板，可获得包含多态性SSR结构(如SSR重复次数不同、或长度不同等)的多核苷酸。应用本发明的简单重复序列及其相应的引物具有多种用途。包括但不限于用于血吸虫遗传关系的确定；血吸虫基因的定位；血吸虫各种或各亚种间的保守性分析；血吸虫的进化分析；或血吸虫的品种鉴定。9血吸虫各虫种通过对这些日本血吸虫SSR位点在其它种血吸虫中进行扩增，寻找能够在日本血吸虫以外的其它血吸虫中得以扩增的位点。如果位点能够被成功扩增，说明这个位点在多种血吸虫中共同存在，这个位点就能被其它血吸所利用。血吸虫的进化分析微卫星标记可以作为物种间关系研究的手段，进行物种间的进化分析。根据遗传距离确定物种间的进化关系。血吸虫的品种鉴定利用本发明人开发的SSR标记，对血吸虫进行PCR扩增，寻找每一个品种所对应的品种特异性SSR标记，就能够实现血吸虫品种在形态特征结合分子标记的前提下进行品种鉴定。作为本发明的一种优选方式，本发明的SSR位点可被应用于进行不同血吸虫流行疫区之间血吸虫种群的比较，分析各血吸虫种群之间的遗传差异，或在这些种群之间建立谱系关系图。或者作为分子标记，应用于血吸虫品种或地域种群鉴定。作为本发明的一种优选方式，本发明的SSR位点可被应用于流行病学上。其应用方法例如某个区域(以前该地区并无血吸虫病的记录-新增疫区)爆发血吸虫病，可以随机从感染的人体或者动物体内获取日本血吸虫成虫样本(组成一个新的种群)，利用本发明的微卫星位点，对上述样本进行高通量的基因扫描，分析其遗传学特征。再通过其与已了解的种群结构特征的对比，判断该新增疫区的血吸虫种群的来源，通过切断该来源或传播血吸虫的宿主(如阳性钉螺)的迁徙路径，从而可达到对该新增疫区日本血吸虫病的监测和控制的目的。遗传分析方法在得知了本发明提供的各SSR位点或其对应的特异性引物后，本领域人员可采用多种本领域已知的技术来确定血吸虫的遗传关系(或亲缘关系)，定位血吸虫的基因，对血吸虫各种或各亚种间进行保守性分析，进行血吸虫进化分析，或进行血吸虫的品种鉴定，或血吸虫地域种群鉴定。由于SSR位点的PCR扩增是特异性扩增，其稳定性和重现性都较好。检测微卫星PCR扩增后的产物的方法可以采用本领域人员熟知的技术，最常用最简便的方法是采用琼脂糖凝胶电泳技术。通过比较扩增条带的数目和/或大小来确定扩增产物的差异。该方法操作简单，成本低廉。另一种更为精细的方法是通过测序仪的基因扫描，从而可很好地分辨出PCR产物大小上1-2碱基的差异。基因扫描可釆用本领域人员已知的一些软件，例如GenMapper4.0软件。经过大量试验验证，发明的微卫星位点能满足高通量基因扫描的要求。检测试剂盒或系统本发明还提供了一种用于确定血吸虫遗传关系、定位血吸虫基因、血吸虫各种或各亚种间保守性分析、血吸虫进化分析、血吸虫品种或地域种群鉴定的检测试剂盒或系统，所述的试剂盒或系统中含有可特异性扩增选自SEQIDNO:1-17任一所示的微卫星位点序列的引物(对)。所述的引物(对)也可扩增处于SEQIDNO:l-17任一所示的微卫星位点同一基因座位上且含有简单重复序列的重复数目不同的微卫星位点。此外，所述的试剂盒中还含有各种分析血吸虫遗传关系、定位血吸虫基因、血吸虫各种或各亚种间保守性分析、血吸虫进化分析或血吸虫品种鉴定所需的其它材料。例如可以包含选自下组的材料PCR扩增试剂，电泳试剂，PCR产物纯化试剂，或序列分析软件。这些试剂均可以是本领域人员常规使用的。此外，所述的试剂盒中还可含有的使用说明书，以说明所述试剂盒的使用方法，给出较合适的使用条件。本发明的优点和效果1.开发出一类适用于对血吸虫样本进行功能基因组研究、基因定位或品种鉴定的微卫星位点，所述的微卫星位点能有效得阐明日本血吸虫种群之间的遗传差异。2.针对各微卫星位点找到了合适的引物，所述引物扩增效果良好，扩增产物唯一。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例lSSR的获得以及引物设计1.成虫样本DNA的抽提采用DNA的酚抽提和乙醇沉淀法1)取单条虫置入200pl提取缓冲液洗涤虫体3次，2000g离心2min分离洗液；2)吸干洗涤液，加入20pl抽提缓冲液，用RNAase-free的灭菌小碾磨棒，碾磨虫体至匀浆；3)加入提取缓冲液至终体积504)加入0.5|alRNAase(lOug/)_il),5|ilSDS(10%)，0.5pl蛋白质消化酶，用枪反复混匀；5)在复式水浴恒温振荡器中110转/分56°C消化lh;6)加入等体积50pl苯酚氯仿异丙醇为25:24:l的混合液，混匀，10000g，离心5min;7)取上清，加入50)al氯仿异丙醇为24:l的混合液，混匀，10000g，离心5min;8)取上清，加入80(il无水乙醇，混匀，-30。C过夜；9)加入1ml70%乙醇，10000g，离心15min;10)取下层溶液加入IOplddH20，待用。或釆用蛋白酶K消化法1)用200jli1GNT缓冲液洗漆虫体3次，2000g，离心2min分离洗涤液；2)吸干洗涤液，加入20plGNT缓冲液，用一根RNAase-free的灭菌小碾磨棒，碾磨虫体至匀浆；3)加入40plGNT缓冲液，旋转10s;14)加入lpl蛋白酶消化酶，用移液器反复混匀，在复式水浴恒温振荡器中110转/分于56'C消化lh;5)10000g，离心5min，室温放置，转移上清至一只干净1.5mlEP管中；6)加入50plNID缓冲液，振荡30s，置室温3min;7)旋转混合30s，95°C15min灭活蛋白酶消化酶；8)10000g,离心5min,取上清至一千净1.5mlEP管中，待用。2.微卫星位点的筛选及引物的获得从基因组数据库获取初始数据，并经过如下原则的筛选a)3-4个碱基重复(例如CGG，TACC);b)各位点不包含复杂结构；c)序列为日本血吸虫基因组特异；d)微卫星的重复次数在10-25次；e)位点所处的位置应该远离编码区；f)位点侧翼的序列在日本血吸虫全基因组中是单一的。本发明人针对重复单元为TAA的序列进行了筛选，获取50余条合格位点的原始序列。经过进一步分析、实验和选择，最后获得17条具有典型性的有效的微卫星序列，分别命名为Sjpnl-Sjpn17,它们的序列依次如SEQIDNO:1-SEQIDNO:17所示。采用Primer5.0软件设计引物，并初步PCR筛选，最终确定H对有效引物，如表1。表1日本血吸虫17个微卫星位点的弓<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>所设计的引物对均通过BLAST进行确证。以SjpnlO为例，将所设计的引物在日本血吸虫全基因组数据库做Blast,由Blast结果可知SjpnlO位点位于Contig号位SJC—C00056977,位点序列在日本血吸虫全基因组中具有唯一性。实施例2.以位点sjpnl为例的遗传分析1.以Sjpnl序列为基础，设计相应的引物，如下F:TGAGCACAACTGTATATCCCAAAR:TGGGCAGACATACCAGGTTC2.PCR反应，在日本血吸虫样本的全基因组DNA上扩增出相应的目的片段。PCR循环条件为95°C5min;94°C45s,55°C45s，72°C45s，30个循环；72°C10min。PCR反应体系为25ng基因组DNA，2个单位的SBSTaq聚合酶，双向引物各10pm，1.25mMMgC12，1(il10X反应缓冲液，0.5pidNTPs(2.5mM，TaKaRa)。3.常规方法对PCR产物进行纯化。4.遗传学特征分析，例如分析多个(如铜陵、贵池、都昌、常德、岳阳、沙市、西昌)的遗传学特征。可选择的遗传分析方法如下(1).对PCR产物进行电泳鉴定.通过电泳分析扩增产物的条带数目和/或位置情况，扩增产物的条带数目和/或位置一致性越高，表示两种血吸虫之间的遗传关系越近；扩增产物的条目数目和/或位置差异越大，表示两种血吸虫之间的遗传关系越远。(2).样本的基因扫描PCR产物用ABI3730XL自动测序仪分离，以ABIGenescan-500LIZ(AppliedBiosystems)分子内标测定PCR产物的DNA片段的确切长度。并用ABI3730XL和GenMapper4.0软件(AppliedBiosystems)进行初始数据处理。其它位点的遗传分析方法与sjpnl类似。实施例3.PCR扩增产物的初步检测和基因扫描1.PCR扩增产物的初步检测在对PCR产物进行基因扫描(Genscan)之前，对所扩增的PCR产物进行检测，确保基因扫描实验的成功。所扩增的PCR产物应有阳性的目的条带，并且目的条带的带型要单一，不得有拖带等现象。图1为武汉流行区的96个单个样本在位点sjpn8上的PCR扩增产物的电泳图，每个泳道均出现单一目的条带，大小约为250bp。2.GeneM叩per4.0的运行根据不同位点扩增出来PCR产物大小设置不同的控制面板(Panel)，并运行GeneM叩per4.0，所述操作可参考使用说明书。3.基因型(Genetypes)由于日本血吸虫是二倍体生物，故其单个样本的基因型有两种杂合子为两个不同的等位基因；纯合子仅只有一个等位基因。(i).杂合子如图2所示三个样本均为杂合子，每个样本均出现清晰的二个等位基因的峰图。(ii).纯合子如图3所示二个样本均为纯合子，每个样本均出现清晰的单个等位基因的峰图。由GenMapper4.0导出数据存为Excel格式，根据各微卫星位点的基准(即该微卫星重复部分两侧的侧翼序列的大小)计算出微卫星重复部分的长度大小，进而计算出微卫星TAA重复单元的次数。TAA重复单元的次数用于后续的遗传学分析。实施例4.统计学分析1.等位基因个数，观测杂合度和期望杂合度等位基因的个数(Na,Numberofallele)和观察杂合度(Ho，Observedheterozgosity)是用于分析多态性的指标。Na和Ho的差异范围反映种群间的遗传变异程度。分析了7个种群样本，发现二倍体的Na为520;Ho为0.1381.000(表2)，差异较大，反映了种群间存在高水平的遗传变异且各个位点上存在多个等位基因。根据各位点观察杂合度的值，可以利用软件GenAlEx6计算出各位点的期望杂合度He(ExpectedheterozgosityHe)，各位点的期望杂合度与观察到的杂合度无显著性差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注*Na:等位基因的个数；Ho:观察杂合度；He:期望杂合度。已有报道，在曼氏血吸虫基因组上的ll个微卫星位点的观察杂合度(Observedheterozgosity，Ho)为0.331.00，等位基因的个数为26;已有报道日本血吸虫平均的Ho为0.050.82，平均等位基因的个数为2.7510.75。本发明采用的17个新微卫星位点的Ho为0.1381.000，等位基因的个数为520，结果表明日本血吸虫等位基因数远远超过曼氏血吸虫的等位基因数，杂合度的范围及平均的杂合度也存在一定的差异，说明这17个新微卫星位点可揭示更多的遗传变异信息，中国大陆的日本血咴虫和曼氏血吸虫具有明显不同的遗传特征。提示其原因是日本血吸虫和曼氏血吸虫在漫长的进化过程中，受到不同生态环境的影响，产生了明显的进化差异。2.同一种群内样本之间的遗传差异利用GenClonel.O软件(参见Arnaud-HaondS等，GENCLONE:acomputerprogramtoanalyzegenotypicdata,testforclonalityanddescribespatialclonalorganization[J].MolEcolNotes,2007,7(1):15-17)对种群内遗传差异最明显的江西都昌流行区所有样本迸行了分析，GenClone1.0计算的是任意2个样本间等位基因之间的差异，所以在17个位点之中(日本血吸虫为二倍体生物，对应有2个等位基因，杂合子为2个不同的等位基因，纯合子为2个相同的等位基因)，任意2个样本之间最大的遗传距离为34。结果显示绝大多数两个样本之间的遗传距离分布在2532之间，其中遗传距离为30的频率高达70%(图4)，显示江西都昌种群内各个样本之间的遗传差异明显。其他种群内各样本之间的遗传差异也较大。3.种群之间遗传差异的分析遗传差异的分析(AMOVA)是尸统计(F^:F-statistic)的一种工具，它对共显性等位基因间的遗传距离矩阵进行分析，结果用来衡量在种群间的遗传差异占整个遗传差异的比例，从而说明种群之间遗传差异的程度。对7个种群分析的结果显示种群内产生遗传差异占整个遗传差异的比例为90%，种群之间产生差异所占的比例较高，为10%(图5)，证实了种群之间的差异较为明显。其中，Permutation(置换次数—9999;Rst为O.103556(P值为0.00(X<0.05)。d.用于研究的感染的钉螺数、该流行区阳性钉螺的感染率和有效的基因型数目及单一多位点基因型(MLG)数目的分析在江西都昌种群内，其单一多位点基因型数目为61(雄为28，雌为33)，而采集于该流行区的钉螺数目仅为ll只；而湖北沙市种群内，其单一多位点基因型(MLG)数目为29(雄为15，雌为14)，而釆集于该流行区的钉螺数目却为30只(表3)。表3感染的钉螺数，该流行区阳性钉螺的感染率和有效的基因型数目及单-多位点基因型(MLG)数目<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注每个流行区都分性别进行分析，所用到的软件为GENALEXcf去除所有的缺失数据M又分析16个位点(不包括P7位点)。上述结果提示单一多位点基因型(MLG)数目跟流行区阳性钉螺的感染率相关，江西都昌流行区阳性钉螺的感染率高达6.5%，而湖北沙市流行区阳性钉螺的感染率却远远小于0.01%。高感染率，可能导致该种群内最趋近于随机交配的遗传方式。e.七个流行区种群的UPGMA谱系分析UPGMA谱系图用来阐明各种群之间的遗传距离。7个种群的UPGMA谱系图显示江西都昌，安徽铜陵，湖北沙市和湖南常德为一簇，其遗传距离在0.01780.0363间；安徽贵池和湖南岳阳为另外一簇，其遗传距离为0.0247;而四川西昌单独为一簇，并且四川西昌与其他两簇的遗传距离在0.01920.0693间(图6)。UPGMA谱系图表明了各个流行区之间存在着遗传差异，其中四川流行区和其他流行区遗传差异尤为明显。实施例5.七个流行区种群之间遗传差异的解释本发明人还发现中国大陆的7个流行区种群之间存在一定的遗传差异，其中四川流行区种群明显区别于其它种群。这一差异可以用地理位置和生态屏蔽来解释。四川流行区位于三峡上游，其阳性钉螺的迁徙及混合受到地理位置的限制，因此,可能会导致其种群内某些基因不易与下游地区种群的基因杂合。相对地，其他流行区都位于湖泊区，阳性钉螺的迁徙相对容易，其基因型就会比较丰富。此外，灭螺产生的选择压力也可能会导致基因型的改变。另外，中国大陆的日本血吸虫野外样本明显的基因杂合性在侧面证实了日本血吸虫在基因组和转录组上存在基因多样性。本发明分析了微卫星DNA作为遗传标记在日本血吸虫种群遗传学研究中的应用，建立了一种适合于群体遗传学研究的，简便快速的单个日本血吸虫成虫样本基因组DNA抽提的方法。利用17个新的微卫星位点为遗传标记对于7个日本血吸虫种群的遗传多样性进行了分析，阐明了中国大陆日本血吸虫具有明显的遗传多样性，在中国不同流行区之间可能具有基因多态性，存在复杂的种群遗传变异，从而为今后日本血吸虫病的监测和疫苗的研究提供了支持。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，国家人类基因组南方研究中心，华东理工大学<120>H本血吸虫微卫星位点及其应用<130>082356<160>51<70>Patentlnversion3.3<210>1<211>448<212>DNA<213>日本血吸虫(Schistosomajaponicum)<220><221>misc一feature<222>(401亍.(414)<223>nisa，c,g,ort<400>1atactgaactattttacagactcttatagtaaactatcccctgaagtacttgcatatatt60tgtttggtattcgtctccatactcttg&gcacaactgtataaacacatat120catttttgtgt3ag38ttC3ctaatttgcaagattttgaagcacatgagg180aacttattggattcaaacattaataat&&t240gtaccagcaggagcatcaatatgcacttctgaacttatcgtttatacata300agtactgtacatttccgaacctggtatgtctgcccaaagtatgcctgtacgcttgatttt360taatggtcagccctattccttatgtaatagac&ccatgcannnnnnnnnnnnnntaccgg420ggatcctctagagtcgacctgcaggcat448<210〉2<211>439<212〉隨<213>日本血吸虫(Schistosomajaponicum)<400〉2aagaaaacactctattgaaaataattaattagagaatatttgtttatcaataccgttccccctcttttttttatccatgacccaataggtt.attggattcaatttagtgttaataettaatataaataaataaata犯ttcaatatcccttcgtgttgaagtgagaattttacteictgatcgggatctgactgtctttgattcaatgtcttgttgtttactaaaataaaaagtttattctgtgsatg犯aacaagggaaa60agtgtttaatatgtcacttatcctgttcat120catttaatagtaatattcatgatactattt180aat犯taataataataataataataataaa240aatgcagtttattemaattgtttttgttgt300caatgttattgataatg犯gaattcaccgt360gatgaaat犯aagacatacactcccaagca420439<210〉3<211>柳<212〉DNA<213>日本血吸虫(Schistosomajaponicum)〈400〉3ccaaactt.atactctgtaatasttgtgtttacagacaaatgaataaagtttaatatcccc60tacatctattgggtaatcacttaggcacatgttcctctctcactctctctggcattgact120acagcg"ttcaaaatccagtgttg犯taaatccgtattattgccatagttaca犯ataatt180tatgcatgtaataatagtgstaataat胆taataataataataataataataataataat240aataataataataataataatggtctacatcctaatttttcattttgtaacagccttttt300cattcaacttctttcataatttccatUaatattgaacaacaacattaacattaactgca360taacttacaatcataattactattattactattattattattactattattattattact化0attactattattattagtagtagtattgttattactgtaa460<21。>4<211〉442<212>籠<213>日本血吸虫(Schistosomajaponicum)<化0>4caatctggttatg3C3Ctt3tcgtctctgaattaacaataaacctgaagctttgttttactttctatUtattttaaccgtgttgatsataacctcat33ataatgatagcaatcaatcaaagggcggcaUUUagttaatttatttcgaatcaaaactactgatactaacttgtgattaataataatacgaccagttgtattctggattcctactctcatgatgattastaataatacctgccaacaCg3C犯C3g3tEitatatatactaatttagaat犯tcatggtatatactacggatgcatgtcaagctccaatactactacctaataataattacaagtgcatatgtactgtttcagttcct60120180240300360420442<210>5<211>442<212〉隱<213>日本血吸虫(Schistosomajaponicum)，0〉5g犯t3ttSCtttgctgat,tattagaaatgagttcaacgataacaattacagaaeigacsctcatgaatcttgataagataaattcatatgtcacgggattacgagcaaaatt3g3t3CC3gcatcaattaaatttacttattaaaataataagaaattagagtatctttaacat犯taccgataa犯aga3taataataatcagattgacgttctttattcagaaattagtUtggtgcaatacacgtataatctaaatataat犯taatacagtactatcattttcttgasaataaaagtaaattaaccactggcacatatggacaagaagaaacsatagattcacattcgtaggcataaacgtatat犯aaatttcagtaatcaaaataaatttcatta60120180240300360420442<210>6<211>448<212〉隱<213>日本血吸虫(Schistosomajaponicum)<400>6caacattgacctttttatgaatttattactatgatttctaaataataatgcacagtatacagttggtgactg3CtUggtaacagttttgcggcgttcatctactaacagataat犯taatttaccttatcgtcaUtggttcattcttgttttactctttttttttctataataataatgttctacagcBgaatttactgttctgattacttatattgtctttctaaaataataatatgtaccaccatggttactgttctcactgcttcacttctgttcgtcaccaaagcatttataataataataatatatgttcagtcatxacttgatggtcatctgttgcaaaagtttatcgctttcgatactttaataataatctgaagaaacatcttcttggtctttcatat60120180240300360420448〈210〉7〈211>472<212>DNA<213>闩本血吸虫(Schistosomajaponicum)<400〉7tgtattttagttatcctgtatgttgctaggttattcaaacgtaatcagtcgccagcgcct60gaattctcattcaagt犯atgctaattgggcttagtttatttgaaaacgtatcagatacc120caaagagag3gagggggaga3gaUagaccaatagtccatcggtaagtagcgcaccaast180aatggaaattactatcccaataataataatgataataataat,aataataataataataat240aataat犯taat犯taataataataataataataggaggaggaggagaaagaagaattag300tcg犯at犯acatgg"Uatcatagttttcaagggtgatacacagtaaatttgatgggtga360ggtggaggtatgtgaagttacatactgaaataatctacatgagtgtg卿gtgagat犯a420atgtctatataaaca犯aagaaatcgcaagg犯ataacactcgaacaagtta472<210〉8<211〉460<212〉DNA<213〉H本rfil吸虫(Schistosomajaponicum)<400〉8tatgctaattttgaccgatatcaccatcaattacaaaaatatgcacg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