专利名称：香菇香九菌种的分子标记、其检测方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属香燕菌种的检测领域，特别是涉及一种香菇香九菌种的分子标记、其检测方 法与应用。
技术背景我国香燕产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香薛总 产量的70%以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断縮小与排行第一的双孢蘑菇产 量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最 高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩 目，中国香菇已风靡世界。优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香范产业中 的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国 家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新 品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种 登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其 是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种"同种异名，异种同名"的 现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香 菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求 越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确 无误。面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更 为有效的菌种鉴定体系。 发明内容本发明的目的是提供一种香菇香九菌种的分子标记、其检测方法与应用，通过采用 PCR技术，经过筛选试验，获得了香菇菌株香九的特异DNA片断，以此片段的DNA序列 为基础，设计特异性PCR扩增引物，通过对香九菌株的特异片段检测从而对香九菌种进行 鉴定和检测。本发明的一种香菇香九菌种的分子标记，是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR 扩增的专用弓I物是香九F/R，香九F是5' GGTCCATGTATAGTCTG 3 ，， 香九R是5' GTCCATTGGTTCAAAC 3， ， PCR产物大小为750bp。扩增出的SCAR片段的序列如下:本发明的一种香菇香九菌种的分子标记的检测方法，包括下列步骤(1) 菌丝培养将4i:保藏的香菇菌种转接到PDA平板上，23。C 25。C避光培养，10 d ~14d后接到 100mLPDY培养基中，100rpm 150rpm， 23。C 25。C摇瓶培养10d 14d后收集菌丝，放入 -20°<:冰箱保冻备用；(2) 基因组DNA的提取用改进的CTAB (十六垸基三甲基溴化铵)法提取菌丝的基因组DNA:1) 将-2(TC冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65'C预热的2XCTAB抽提液，65 r保温45min以上，间或轻摇混匀；2) 12000rpm， 4。C离心20min，取上清液；3) 加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液(混合液体积比为25: 24: 1)，轻轻混 匀10min， 12000rpm， 4。C离心10min，取上清液移入新离心管中；4) 加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液(混合液体积比为24: 1)，轻轻混匀10min， 12000rpm， (C离心10min，取上清液移入新离心管中；5) 加入2/3体积(相对于上一步骤中的上清液)的-20。C预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm， 4'C离心10min，去上清；6) 沉淀用75% (体积百分数)乙醇、1Ommol/L醋酸钾洗涤2 3次，每次8000rpm， 室温离心5min;7) 加入预冷的95% (体积百分数)乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min， 弃乙醇，真空抽干或自然晾干；8) 加入100pL10XTE (Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；9) 加入lpL10mg/mLRNaseA37。C水浴，lhr，去除RNA;紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致，冷藏 备用；(3) SCAR分子标记的检测扩增体系(总体积25nL): 10XPCRbuffer2.5pL， 25mmol/LMgCL22pL， 10mmol/L dNTP 0.25L， 2.5U L DNA酶0.5pL， lOpmol/L香九F/R引物各lpL，提取的模板 DNAl(iL (浓度lng 10ng/nL)， ddH20 18单;PCR反应条件:94°C lmin; 94°C 15second， 60°C 15second， 72°C lmin， 30个循环; 72 °C 5min;(4) 电泳检测取上述PCR扩增产物8pL，与lpL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上， 于0.5 X TBE缓冲液(Tris-硼酸缓冲液)中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB (溴化乙锭)染色，然后在凝胶成像仪上照相，分析结果。本发明的一种香菇香九菌种的分子标记的应用，是利用香菇香九菌种基因SCAR的 PCR扩增专用引物，进行基因SCAR扩增，存在SCAR标记的即是香菇香九菌种。 本发明的有益效果该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性 高的优点。该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间， 出燕试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国30个香菇主栽菌种中具有香 九菌种的专一性。
图1是香菇香九菌种的SCAR扩增图谱，其中M是100bpDNAladder， NC是空白对 照，箭头所指是香菇香九菌种的特异性标记。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。实施例11、 菌丝培养将4"C保藏的香菇菌种转接到PDA平板上，25'C避光培养。14d后接到100mL PDY 培养基中，150rpm， 25'C摇瓶培养。待菌丝生长达到一定量时，收集菌丝，放入-2(TC冰箱 保冻备用。2、 基因组DNA的提取用改进的CTAB法提取基因组DNA。紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度， 调整样品DNA的浓度一致，冷藏备用。3、 SCAR分子标记的检测扩增体系(总体积25^L): 10XPCRbuffer 2.5nL，25mmol/LMgCl22pL， 10mmol/LdNTP 0.25L， 2.5U/|aL T叫DNA酶0.5pL， 10pmol/L香九F/R各lpL，模板DNAlnL(浓度lng 10ng/VL)， ddH20 18.6pL。PCR反应条件:94°C lmin; 94°C 15second， 60°C 15second， 72°C lmin， 30个循环; 72 。C 5min。4、 电泳检测取上述PCR扩增产物8uL，与lpL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上， 于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成 像仪上照相。采用专用香九检测引物对香菇菌株进行PCR扩增，香九菌株能扩增出分子量为750bp 的特殊DNA条带。如图1中箭头标注所示。
权利要求
1. 一种香菇香九菌种的分子标记，其特征在于该分子标记是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR扩增的专用引物是香九F/R，香九F是5’GGTCCATGTATAGTCTG3’，香九R是5’GTCCATTGGTTCAAAC3’，PCR产物大小为750bp。
2. 香菇香九菌种的分子标记的检测方法，包括下列步骤(1) 菌丝培养将香菇菌种转接到PDA平板上，23。C 25。C避光培养，10 d ~14d后接到100mL PDY 培养基中，100rpm 150rpm， 23。C 25。C摇瓶培养10d 14d后收集菌丝；(2) 基因组DNA的提取用改进的CTAB法提取菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度 和纯度，调整样品DNA的浓度一致；(3) SCAR分子标记的检测将提取的DNA进行基因SCAR的PCR扩增；(4) 电泳检测上述PCR扩增产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，电泳，用EB染色， 在凝胶成像仪上照相，分析结果。
3. 根据权利要求2所述的香菇香九菌种的分子标记的检测方法，其特征在于所述歩骤 (2)中的改进的CTAB法.- 1) 将-2(TC冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65。C预热的2XCTAB抽提液，65 XM呆温45min以上，间或轻摇混匀； 2) 12000rpm， 4。C离心20min，取上清液； 3) 加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液，其混合液的混合体积比为25: 24: 1， 轻轻混匀10min， 12000rpm， 4。C离心10min，取上清液移入新离心管中； 4) 加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，其混合液的混合体积比为24: 1，轻轻混匀 10min， 12000rpm， 4。C离心10min，取上清液移入新离心管中； 5) 加入2/3体积的-2(TC预冷的异丙醇，轻轻摇动5min， 8000rpm， 4。C离心10min， 去上清； 6) 沉淀用体积百分数为75%的乙醇、1Ommol/L醋酸钾，洗涤2 3次，每次8000rpm， 室温离心5min; 7) 加入预冷的体积百分数为95%的乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min， 弃乙醇，真空抽干或自然晾干；8) 加入100WL10XTE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；9) 加入luL10mg/mLRNaseA37。C水浴，lhr，去除RNA;10) DNA提取物于-2(TC冰箱贮藏备用。
4. 根据权利要求2所述的香菇香九菌种的分子标记的检测方法，其特征在于所述歩骤(3) 中的PCR扩增的总体积为25pL，包括10XPCRbuffer 2.5pL， 25mmol/LMgCL22|iL， 10mmol/LdNTP0.25L， 2.5U&L T叫DNA酶0.5nL， 1Opmol/L香九F/R引物各lpL，浓 度lng 10ng/VL提取的模板DNA lpL， ddH20 18.6pL;PCR反应条件94°C lmin; 94°C 15second， 60°C 15second， 72°C lmin， 30个循环； 72 。C 5min。
5. 根据权利要求2所述的香菇香九菌种的分子标记的检测方法，其特征在于所述歩骤(4) 中的PCR扩增产物是8pL，加样缓冲液为lpL，琼脂糖凝胶为1.5%,电泳是在0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳。
6. —种香菇香九菌种的分子标记的应用，是利用香菇香九菌种基因SCAR的PCR扩增专 用引物，进行基因SCAR扩增，存在SCAR标记的即是香菇香九菌种。
全文摘要
本发明涉及一种香菇香九菌种的分子标记、其检测方法及应用，该分子标记是基因SCAR的分子特异检测标记，其PCR专用引物对序列为香九F5’GGTCCATGTATAGTCTG3’与香九R5’GTCCATTGGTTCAAAC 3’；检测方法1)菌丝培养；2)基因组DNA的提取；3)SCAR分子标记的检测；4)电泳检测；应用将香菇菌种进行基因SCAR扩增，存在SCAR标记的即是香菇香九菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点，在收集的我国30个香菇主栽菌种中具有香九菌种的专一性。
文档编号C12N15/11GK101265494SQ20081003726
公开日2008年9月17日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者宋春艳, 尚晓冬, 琦 谭, 陈明杰 申请人:上海市农业科学院