专利名称：：转录因子圈套序列及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种转录因子圈套序列及其应用。
背景技术：
：神经干细胞是一种可以分化为神经元，胶质细胞和少突胶质细胞并且可以自我更新以补充大脑细胞的细胞，有效的促进神经干细胞向所需的表型分化为神经退行性病变和神经系统损伤的功能重建带来了令人振奋的希望。Snyder等从新生小鼠神经外胚层细胞建立了(^17.2永生性神经干细胞株，大量的试验已经证明其可以分化为神经元，胶质细胞和少突细胞，尤其由于永生化的细胞本身所具有的容易贮备，管理，可商品化培养的特点，使对C17.2的研究成为当前的热点。转录因子圈套(TFD)策略(transcriptionfactor"decoy"strategy)是应用与顺式元件相一致的人工合成的寡核苷酸双链(ODNs)转染细胞,竞争结合转录因子，从而抑制正常的内源性基因表达，目前不论在体外还是在体内，既可作为基因表达调节研究的新方法，又可作为一种新型的基因治疗手段，具有以下优点潜在的药物靶点(转录因子)非常丰富；圈套ODNs的合成相对简单且可靶向特异的组织；不必弄清靶性转录因子的精确分子结构；圈套ODNs可阻断与同一顺式元件连接的多种转录因子的效应，其抑制构成性表达因子的能力比反义ODNs更强，因此国外众多学者一致认为该策略可作为一种有效的手段用于治疗某些人类疾病。肝细胞核因子4(HNF4-1)和Myc相关的锌指蛋白l(MAZ-1)能够直接进入细胞核调节基因转录,从而对机体的各种生理活动进行调控,具有重要的作用。
发明内容本发明的目的之一在于提供一种转录因子圈套序列。本发明的目的之二在于提供该转录因子在促进神经干细胞向神经元的方向分化中的应用。本发明的目的之三在于提供该转录因子圈套序列在增强神经干细胞的迁移能力中的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种转录因子圈套序列，其特征在于该圈套序列具有序列表中SEQNO1_5所示的序列。上述的转录因子圈套序列在促进神经干细胞向神经元的方向分化中的应用。上述的转录因子圈套序列在增强神经干细胞的迁移能力中的应用。通过Invitrogen公司合成了转录因子MAZ-1，HNF4-1的圈套序列，经过RealtimePCR检测MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs共同作用对靶基因Rho-GDIy的下调效果最好。当MAZ-1，HNF4-1dODNs转染入神经干细胞C17.2后，MTT法检测对细胞的增殖没有影响，但是其细胞形态发生了显著的变化，经免疫组化双染色证实神经干细胞C17.2具有向神经元方向分化的趋势，体外迁移试验证明MAZ-1，HNF4-1dODNs能够促进神经干细胞的迁移。本发明为治疗神经系统疾病及移植的广泛应用奠定了一定的基础。图1为实时定量RT-PCR检测MAZ-1和HNF4-ldODNs对目的基因Rho-GDlYmRNA表达水平的影响。图2MTT法检测MAZ-1和HNF4-1dODNs对神经干细胞的增殖的影响。图3免疫组化双染色证实神经干细胞(:17.2具有向神经元方向分化的趋势。图4体外迁移试验证明MAZ-1，HNF4-1dODNs能够促进神经千细胞的迁移。具体实施例方式采用如下的具体实施方案实施例一MAZ-1,HNF4-1转录因子圈套的设计，参见表l本实验不仅设计了无意的对照圈套序列(nonsensecontroldODNs:53mer)，与转录因子结合位点序列相一致的圈套序列(MAZ-1:14mer;HNF4-l:20mer)，而且为了保证圈套序列的稳定性，提高圈套序列的作用效果，还设计了分别包含两段或者三段与转录因子结合位点相一致的序列，中间包含/的酶切位点(MAZ-l:30mer，46mer;HNF4-l:42mer)。表lMAZ1，HNF4-1转录因子圈套寡核苷酸序列和无意的对照序列(横线表示与转录因子结合位点一致的序列)。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例二在Lipofectamine2000介导下共转染神经干细胞系C17.2，三天后用RNeasyMiniKit(Qiagen,USA)抽提转染72小时的细胞的腿，再根据TaKaRa的反转录实验手册，用AMV反转录酶以oligo(dT)为引物将抽提的总RNA反转成第一链cDNA。然后，通过引物(Rho-GDI"/,GAPDH)进行PCR以检测目的基因Rho-GDt/，内标为GAPDH。Realtime-PCR结果，参见图1。显示显示不同的MAZ-1,HNF4-1dODNs对其作用的靶基因Rho-GDlY的作用效果不同，但是均具有抑制作用，46mer的斷Z-l和42mer的HNF4-1共同作用对效果最好。*,p<0.05，**,p<0.01。实施例三在LipofectamineTM2000介导下共转染MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs神经干细胞系C17.2实验组和对照组，培养12、24、36、48小时后，96孔板各孔加入5mg/mLMTT液体20^1，继续培养4小时。然后取出培养板，吸去孔内培养液，加入200plDMSO,酶联免疫检测仪自动振摇培养板l分钟，以490nm为参考波长测定吸光度值。图2结果显示HNF4-l和MAZ-ldODNs对细胞的增殖没有明显影响。实施例四在用MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)d0DNs转染神经干细胞系C17.2五天后，在激光共聚焦显微镜下分别对实验组(图3E，31)和对照组(图3A)进行常光观察，同时拍摄照片以做记录。弃培养基，用缓冲溶液漂洗细胞后，进行Nestin和neurofilament(NF)免疫组化双染色，用FITC/TRITC偶连的二抗显色，在特定波长的荧光下表达NF的细胞发红色的荧光(TRITC)，表达Nestin的细胞发绿色荧光(FITC)，结果显示对照组细胞的形态比较规则(图3A)，仅有Nestin被检测到；实验组细胞形态发生明显改变(图3E,31),长出很长的神经突起，不仅检测到Nestin(图3G,3K)，并且检测neurofilament(NF)(图3M,30)也有表达，但是未检测出GFAP的表达，这表明当Rho-GDIy下调之后神经干细胞系C17.2有向神经元细胞分化的趋势。实施例五在完全相同的培养条件下，以共转染MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs和pEGFP-Cl质粒的细胞为实验组，以转染相同数量无意对照序列的细胞和不做任何处理的细胞为对照组，连续30小时测量两组细胞平均沟间距离(averagegaps,AGs)。以对照组第1天的AGs为100%,测连续30小时之内，对照组细胞(图6A-D)的AGW分别为100±4，78±2,64±5;无意序列细胞(图6E-H)的AG。/。分别为102±7，80±9，68±6;实验组细胞(图61-L)的AG。/6分别为100±7，56±8，42土4。随着时间的推移，MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs处理过的试验组细胞向中间生长的越来越多，表明细胞迁移能力较强；而对照组细胞迁移能力较弱，表明转录因子MAZ-1和HNF4-1与神经干细胞的迁移能力密切相关。序列表〈110〉上海大学〈120>转录因子圈套序列及其应用<160>5〈210〉1<211>20〈212〉腿〈213〉人工合成〈400>1TCATTGCCAAAGGGCACGAT〈210〉2〈211〉42〈212〉DNA〈213>人工合成<400〉2TCATTGCCAAAGGGCACTGAATTCATTGCCAAAGGGCACGAT<210〉3〈211〉14〈212>DNA〈213>人工合成<400〉3TATGGGGAGGGACT〈210〉4〈211〉30〈212〉DNA<213>人工合成〈400>4TATGGGGAGGGTGAATTCAGGGGAGGGACT〈210〉5<211>46〈212〉薩<213>人工合成〈400〉5TATGGGGAGGGTGAATTCAGGGGAGGGTGAATTCAGGGGAGGGACT权利要求1.一种转录因子圈套序列，其特征在于该圈套序列具有序列表中SEQNO1-5所示的序列。2.根据权利要求1所述的转录因子圈套序列在促进神经干细胞向神经元的方向分化中的应用。3.根据权利要求1所述的转录因子圈套序列在增强神经干细胞的迁移能力中的应用。全文摘要本发明涉及一种转录因子圈套序列及其应用。当神经干细胞C17.2转染本发明的圈套序列，对其目的基因Rho-GDIγ具有明显的抑制作用。MTT法检测对细胞的增殖没有影响，但是其细胞形态发生了显著的变化，经免疫组化双染色证实神经干细胞C17.2具有向神经元方向分化的趋势，体外迁移试验证明本发明的圈套序列能够促进细胞的迁移，本发明为治疗神经系统疾病及移植的广泛应用奠定了一定的基础。文档编号C12N15/11GK101280303SQ20081003773公开日2008年10月8日申请日期2008年5月20日优先权日2008年5月20日发明者刘小燕,文铁桥,霄李,娇王申请人:上海大学