专利名称：一种植物重组表达载体及其包含该载体的转化体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物重组表达载体及其包含该载体 的转化体。
背景技术：
转录因子(transcriptionfactor, TF)又称反式作用因子，是一群能与真核基因启动子 区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的 时间与空间表达的蛋自质分子。当植物感受外界干旱、高盐、激素、病害时，通过一 系列信号传递，激发转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合后，激活RNA聚 合酶II转录复合物，从而启动特定基因的转录表达，最后通过基因产物的作用对内、 外界信号做出的调节反应。植物许多基因的表达都是由特定的转录因子与特定的顺式 作用元件相互作用调控的。
在植物代谢研究中，通过对特定转录因子的表达或者抑制的调控，可以同时调控 代谢途径上多个对转录因子响应的关键酶基因，打破代谢物代谢途径上的瓶颈，从而 达到对整个代谢途径进行调控的目的。目前对转录因子的研究表明，转录因子对植物 代谢的调节是通过合成与基因启动子上相应的顺式作用元件结合的蛋白而实现的。由 于转录因子对于代谢途径上的关键酶的调控具有特异性，所以构建只包含转录因子的 载体有时不能够达到同时调控代谢途径上所有关键酶基因的目的，而构建转录因子加
关键酶基因的载体又存在启动子冲突的问题。因此，通过构建转录因子加关键酵基因 的载体，并对关键酶进行启动子修饰是解决这一问题的最佳策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物重组表达载体。
本发明所提供的植物重组表达载体，包含转录因子、启动子和关键酶基因的的融 合序列，所述的启动子为包含对转录因子特异响应元件的启动子。所述启动子可为组成型、诱导型或组织特异性表达启动子，优选为带有jere元件 的启动子，最优选为tdc启动子。
所述转录激活因子可为orca2、 orca3、 PAP1、 PAP2、 0SB1、 TTG1、 anl、 an2、 anll、 jafl3、 del、 antl、 Lc、 TT16、 B、 Sn、 Hopi、 Cl、 Pl、 ANL2、 TTG2、 ttl、 tt2、 CPRF、 Ntliml、 MybA中之一。
在一些实施方案里，所述转录激活因子优选为具有与orca3相同或相似功能的所 有具有DNA结合蛋白区AP2结构域和转录激活结构域的转录激活因子如winl， orca2,erfl等，以及其它具有相似转录激活活性功能的基因；尤其优选为orca3。
所述关键酶基因可包括一个目的基因或多个相同或不同的目的基因。
所述关键酶基因可以是任何可以利用的基因，如gl0h基因。gl0h基因具有SEQ ID NO. l所述的序列。
所述植物重组表达载体可含有筛选标记。所述筛选标记可为潮霉素(hygroraycin) 和卡钠霉素(kan呵cin)。
本发明的第二个目的是提供包含上述植物重组表达载体的转化体。
本发明所述转化体的制备方法，包括以下步骤
制备植物重组表达载体；
转化植物材料；
筛选转基因植物材料。
本发明的优点或有益效果本发明通过构建新型植物重组表达载体可以同时调节植 物代谢途径上的多个关键酶基因的表达，不仅包含对转录因子响应的关键酶基因，也 包括对转录因子不响应的关键酶基因，从而达到打通代谢流，调控目标代谢产物含量 的目的。
图1. rolB、 rolC和hpt基因的PCR电泳图。
图2.关键酶gl0h及转录因子orca3的PCR电泳图。
具体实施例方式
下面对本发明进行更加详细的描述
本发明中对植物代谢产物的调节可以包括提高有活性成分的含量或者降低毒性成 分的含量等，在本发明中"转录因子"的选择不特定于某个转录因子，只要对于植物 代谢途径有调控作用的"转录因子"均可以用来进行代谢调控研究，"特异启动子" 必须为包含对"转录因子"特异响应元件的启动子，并不特定于某一启动子，"关键 酶基因"可以是单个基因或者多个基因，为目标代谢物合成途径上的限速酶基因且自 然状态下对转录因子的调控不响应。
构建包含"转录因子""特异启动子""关键酶基因"的植物表达载体可以包括 一个或多个关键酶基因但最好只包含一个"关键酶基因"，这样易于构建植物表达载 体。在进行遗传转化植物材料时，所选用的植物材料没有特别要求，可以是植物叶片， 悬浮细胞系等。所采用的遗传转化方法无特殊要求，可以采用发根农杆菌浸染法、基 因枪等方法。转基因材料的扩大培养可以根据相应遗传转化方法及材料进行选择。对 转基因材料中目标代谢产物的检测可采用多种方法，如高效液相色谱法、气相色谱法 等方法能达到检测到目标代谢产物即可。对于转基因材料中位于代谢途径上和目标代 谢产物相关的基因表达的测定可采用多种方法，如PCR和荧光定量PCR等方法达到 检测目的即可。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，实验所用的试剂为常用试剂。
实施例1.采用基因克隆方法获得长春花中转录因子orca3、特异启动子tdc启动 子及关键酶基因gl0h。 1.组织分离(Isolation)
将长春花种子用75%乙醇浸泡1 min，再用2%NaCl浸泡10min，无菌水冲洗3-4 次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(MurashigeandSkoog， 1962) 固体培养基中，25'C、 12h/12h光照培养，即可获得长春花无菌苗，待苗长至5cm左 右后，切取叶片和茎段用于RNA提取。2. RNA的分离(RNA isolation)
称取0.5g所述的长春花无菌试管苗，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有 1 mL TRIzol (TRIzol Reagents, GIBCO BRL, USA)的1.5 mL Eppendorf管中，充分振 荡后，于室温下放置5min,加200ML氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3 min后， 于4°C 、 12，000g离心15 min;将上清液(约600 ML)吸入干净的1.5 mL E卯endorf管中， 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4'C、12，000g离心10min; 弃上清，加1 mL 75%乙醇清洗，振荡后，于4°C、 7，500g离心5 min;室温干燥15-20 min后溶于适量(30-50 PL) RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量， 然后在分光光度计上测定RNA含量。
3. 基因克隆(Cloning of the gene) 3丄第一链cDNA的合成
3.2.1关键酶glOh基因编码区的PCR扩增
根据所述关键酶gl0h的编码序列(SEQIDNO. 1)，设计扩增出完整编码框的上 下游引物，(FglOh 5、-AGATCTATGGATTAVVTAVVTATTATTTAAVT-3、， RglOh 5、-GGTGACTTAAAGGGTGCTTGGTACAGCAC-3、)并在上游和下游引物上分别引 入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一 链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海博亚或晶泰生物技 术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank 中所报道的长春花glOh基因(SEQIDNO. 1)编码序列一致。
3.2.2转录因子orca3基因编码区的PCR扩增
根据所述转录因子orca3的编码序列(SEQIDNO. 2)，设计扩增出完整编码框 的上下游引物(Forca3 5、- ATGTCCGAAGAA ATCATTTCCG TCTC陽3、， Rorca3 5、- TT AATATCGTCTCTTCTTCCTTCCTCC-3、)，并在上游和下游引物上分别引入限制性内 切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA 为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海博亚或晶泰生物技术服务有 限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报 道的长春花的转录因子orca3基因(SEQIDNO. 2)编码序列一致。
3.2.3 tdc启动子基因编码区的PCR扩增根据所述特异启动子(带有jere元件的tdc启动子)的编码序列(SEQ ID NO. 3)， 设计扩增出完整编码框的上下游引物(Ftdc 5 、-AAGCTTAAATACATTAAATCTTAATTTCAC-3', Rtdc
5 、 - AGATVTTCTGCTGCTTTTCTGT A AAACC AGT A-3 、)，并在上游和下游引物上分别 引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第 一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海博亚或晶泰生物 技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与 GenBank中所报道的长春花的转录因子特异响应启动子(带有jere元件的tdc启动子) 基因(SEQIDNO.3)编码序列一致。
实施例2.包含构建包含orca3 (转录因子)、tdc (特异启动子)、gl0h (关键酶 基因)的植物表达载体的构建。
1. 中间载体pCAMBIA1304+的构建
选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件，构建双元植物表达载体 pCAMBIA1304+。
其构建流程如下ffindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA1304;回收pBI121 GUS表达盒，回收pCAMBIA1304大片段；连接这两个回收产物，转化DH5 a ,在 LB/kan+平板上筛选得到单克隆，再抽提质粒，酶切验证(Hindni和EcoRI双酶切)， 即构建成功中间载体pCAMBIA1304+。
2. 包含转录因子orca3的中间载体pCAMBIA1304+-O的构建 选用转录因子orca3和pCAMBIA1304+为基本元件，构建双元植物表达载体
pCAMBIA1304十-O。
其构建流程如下Sacl和Xbal双酶切pCAMBIA1304+和含有orca3基因的pGEM T-easy vector;回收orca3基因，回收pCAMBIA1304+大片段；连接这两个回收产物， 转化DH5 a ，在LB/kan+平板上筛选得到单克隆，再抽提质粒，酶切验证(SacI和Xbal 双酶切)，即构建成功中间载体pCAMBIA1304+-O。3. 包含转录因子orca3及tdc启动子的中间载体pCAMBIA1304-的构建 选用特异启动子(tdc启动子)和？€八1^181八1304+-0为基本元件，构建中间载体
pCAMBIA1304*。
其构建流程如下HindIII和BgHI双酶切pCAMBIA1304+-O和含有tdc启动子基 因的pGEMT-easy vector;回收tdc启动子基因，回收pCAMBIA1304+-O大片段；连 接这两个回收产物，转化DH5a，在LB/kan+平板上筛选得到单克隆，再抽提质粒， 酶切验证(HindIII和BglII双酶切)，即构建成功中间载体pCAMBIA1304*。
4. 植物表达载体PCAMBIA1304*+gl0h的构建
以所述的pCAMBIA130^为表达载体，用实施例1中关键酶glOh替换其上的 gfp+gus基因，从而获得含转录因子orca3及特异启动子(tdc启动子)及关键酶gl0h 的植物表达载体pCAMBIA1304*+gl0h。
其构建流程如下BstEII和BglII双酶切pCAMBIA130"和含有glOh基因的pGEM T-easy vector;回收gl0h基因，回收pCAMBIA130"大片段；连接这两个回收产物， 转化DH5a，在LB/kan+平板上筛选得到单克隆，再抽提质粒，酶切验证(Bs伍II和 BglII双酶切)，即构建成功植物表达载体pCAMBIA1304*+gl0h。
实施例3.发根农杆菌介导构建包含orca3(转录因子)、tdc(特异启动子)、gl0h (关键酶基因)的植物表达载体遗传转化长春花获得转基因毛状根
1. 含转录因子orca3、 tdc启动子及关键酶glOh的植物表达载体发根农杆菌工程 菌的获得
将实施例2中含转录因子orca3、 tdc启动子及关键酶glOh的植物表达载体转入发 根农杆菌C58C1。
2. 发根农杆菌介导转录因子orca3、 tdc启动子及关键酶glOh转化长春花 2丄外植体的预培养
剪取实施例1中长春花无菌苗叶片(0.5 cm x 0.5 cm)和茎段(0.5 cm)外植体，接种到 预培养培养基(MS + AS 100 Wnol/L)上，25。C暗培养2 d。 2.2.农杆菌与外植体的共培养
8将所述的预培养长春花叶片和茎段外植体，放入含活化好的所述发根农杆菌工程 菌的1/2MS悬液中浸泡5min (轻轻摇动使外植体与菌液充分接触)后，倒出悬液， 用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100 Wnol/L)中，暗 培养2 d。以浸泡在不带有发根农杆菌的1/2 MS液体培养基中的叶片和茎段外植体为 对照。
2.3.毛状根的诱导和继代培养
将所述的共培养2 d的长春花外植体转入到脱菌固体培养基(1/2 MS + Cef 250 mg/L)上于25"C、 16h/8h光照培养20天左右，可从外植体边缘切口处长出毛状根。 剪取毛状根(大约2-3 cm)，将起源于一个单细胞的每条根作为一个无性系，接种于脱 菌培养基(1/2MS + Cef250mg/L)中暗培养两周，选择生长快、分枝好的毛状根转 入脱菌培养基(1/2MS + Cef250mg/L)中继代筛选，每两周继代培养一次，经过5-6 次继代后即可完全脱菌。再将生长良好的长春花毛状根转入无抗生素的1/2MS培养 基上继续暗培养20d左右，转基因毛状根生长迅速、根毛和分枝逐渐增多、向地性 丧失并可以在无植物激素的培养基上快速生长，具有典型的毛状根特征。获得无性系 GK G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9。
3.转基因长春花毛状根的PCR检测
设计Ri质粒T-DNA区rol基因特异性引物，用PCR方法对所述毛状根进行分子 检测。由于目的基因glOh在植物表达载体上与潮霉素抗性基因(hpt)在同一个边界内， 检测hpt基因以确认转基因毛状根。根据目的基因gl0h序列、orca3序列(SEQ ID NO. 1)设计引物对目的基因进行检测。结果图1.M: DNA分子量标记；1 9依此代 表无性系G1、 G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9; +表示阳性对照； 一表示 阴性对照；这表明，利用rolB、 rolC和hpt基因的PCR特异引物，能分别扩增出423 bp、 622 bp和812 bp的特异DNA片段，而以非转化长春花普通根基因组DNA (NC) 为模板时，没有扩增出任何片段。图2: M: DNA分子量标记；G1 G9依此代表无 性系G1、 G2、 G3、 G4、 G5、 G6、 G7、 G8、 G9; PC表示阳性对照；NC表示阴 性对照；这表明用关键酶gl0h及转录因子orca3的PCR引物扩增转基因长春花毛状 根DNA，能扩增出与预期结果一致的特异目的片段。这说明诱导毛状根形成的rolB、 rolC基因和T-DNA区的hpt和gl0h及orca3基因已经整合到长春花基因组中。实施例4.荧光定量PCR检测转基因长春花毛状根中TIAs生物合成基因的表达
1. 引物的设计和合成
根据长春花中TIAs生物合成代谢途径基因(orca3、 gl0h、 dxs、 ggpps、 as a 、 cpr、 tdc、 tdc、 sgd、 d4h和dat，共ll个)和看家基因18SrRNA全序列设计引物。引物 扩增基因片段长度在150-400 bp之间。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
2. RNA的提取、标准品的制备和标准工作曲线
参照实施例1中所述方法，从长春花毛状根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中 基因组DNA，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成，再以第一链cDNA 为模板，分别用ll对引物进行PCR扩增获得相应的U条基因的扩增条带。
PCR产物电泳回收，用紫外分光光度计测定所有目的基因原液的浓度和纯度。标 准品用IO倍梯度稀释法得到系列浓度的目的基因标准品。每个标准品用荧光定量 PCR方法测定，得到Ct值。以每个标准浓度的对数对它们的Ct值作图，得到满意的 ll个基因标准工作曲线。得到的ll个基因相关系数(斜率-3.3左右，相关系数大于 0.95)表明初始模板浓度的对数与循环阈值Ct之间存在着极强的线性关系，这为定量 的准确性提供了基础。标准曲线同时显示，荧光定量PCR (FQ-PCR)反应线性范围 极宽，可达5个log值的范围(10-9-10-5 Hg"L),敏感度高，起始浓度在10-9 fig尔L 也可获得良好的定量效果。参照标准品工作曲线，可以准确地得到样品中起始模板的 浓度。
3. 荧光定量PCR检测看家基因18SrRNA基因的表达
为调整各样品间在RNA抽提和逆转录过程中反应效率的差异，检测目的基因表达 量的同时需检测看家基因18SrRNA基因的表达。检测18S rRNA和目的基因的荧光
定量PCR的反应体系如下 _
2 x QuantiTectTM SYBR Green Master Mix 10 PL
GSP1 0.2 ML
GSP2 0.2叱
50XcDNA 5叱 ddH20 4.6叱总体积_20叱
PCR反应条件热启动和变性94'C 15min, 50个循环(94匸变性15 sec， 55'C退 火30sec， 72'C延伸30sec并检测荧光，80^20 sec并检测荧光)。
4. 熔解曲线分析和荧光定量PCR产物的检测
所有PCR产物经50个循环完成以后，以0.2°C/SeC的速度使温度从72X:缓慢上升 到95'C。扩增产物双链DNA随温度的升高逐渐变性解链为单链，SYBRGreenI染料 逐渐释放出来，荧光信号逐渐减弱，仪器每升高0.2'C检测一次反应管内荧光强度的 变化，最后得到扩增产物荧光信号强度对温度变化的熔解曲线(Melting curve),定量 PCR仪自动以dF/dT对温度T作图。根据熔解曲线的形状和峰值对反应管中的扩增 产物进行鉴定。为消除引物二聚体对Ct的影响，将每个循环中的读板温度调高到 80'C,在这一温度下双链的引物二聚体变性，释放出结合的SYBR-Green染料，从而 消除了引物二聚体产生的荧光信号。
根据标准曲线，求出各待测样品cDNA中各目的基因的原始浓度，然后以每份 cDNA中目的基因浓度除以每份cDNA中的看家基因18SrRNA的浓度对每个样品中 目的基因的浓度进行校正。每份样品目的基因的校正浓度除以非转化对照根中该目的 基因的校正浓度，则表示样品对非转化对照根的相对表达量，非转化对照根的表达量 即为1。
通过研究，本发明中提供了一种实时荧光定量PCR测定长春花TIAs生物合成基 因表达量的方法。应用本发明的方法，具有快速、准确、灵敏度高、扩增污染小等优 点，同时，同一样本可同时分析TIAs生物合成途径中多个目的基因的表达，大大节 约了成本。
5. 荧光定量PCR检测转基因长春花毛状根中转录因子orca3及关键酶glOh的表
达
选取实施例3转转录因子orca3及关键酶gl0h的长春花毛状根中无性系，用非转 化普通根作对照，用荧光定量PCR测定转录因子orca3及关键酶gl0h的表达量。转 录因子orca3和关键酶gl0h的表达量和TIAs含量比较，结果表明，非转化对照根 glOh基因的表达量最低，TIAs含量最高的无性系G8中gl0h基因的表达量最高，是 空白转化对照发根的15.5倍。TIAs含量低的无性系G2中gl0h基因表达量是空白转对照发根的1.8倍。glOh基因的表达量与TIAs含量之间具有显著的相关性 (y=3.39x-1.84，r2=0.95)。
Realtime-PCR result
g的6CKG1G2G3G6G8
orca33731.6757220768.9465.8
g10h17.267.929.7156130267
6.荧光定量PCR检测转基因长春花毛状根中12个基因的表达 用荧光定量PCR技术测定实施例3转转录因子orca3及关键酶gl0h的长春花毛状 根中TIAs生物合成基因的表达情况，结果表明，orca3基因及gl0h基因导入长春花 毛状根可诱导初级代谢中ggpps的表达，还可诱导次级代谢中gl0h、 tdc、 tdc、 sgd 和dat的表达。
本实施例采用荧光定量PCR技术测定转基因长春花毛状根中TIAs生物合成相关 基因的表达，通过基因表达量的高低可以初步筛选出TIAs高产的长春花毛状根。
实施例5.利用HPLC测定转基因长春花毛状根中TIAs含量
1. 毛状根液体培养
选取实施例3中生长迅速的长春花毛状根无性系，在超净工作台上取出毛状根培 养物，无菌水冲洗掉琼脂后，用无菌滤纸吸干表面水分，将毛状根切成约5cm长的 根段，放入装有30mLl/2MS液体培养基的150mL三角瓶中，起始接种量为0.5-1.0 g鲜重/瓶。将培养瓶置于转速为120rpm的旋转式摇床上，于25'C黑暗下振荡培养。 每隔3d随机抽取毛状根培养物5瓶，用滤纸吸干毛状根表面水分后，称取鲜重，并 计算毛状根培养物的鲜重增值倍数。
2. 色谱条件及系统适用性以及标准溶液的配制
色谱柱C-18反相硅胶柱(Di咖onsilC18， 5 pm， 250x4.6 mm， DIKMA)。长春碱、 长春质碱的洗脱剂为乙腈5mMNa2HP04缓冲液(用H3PO调节pH至6)。流动项 条件为:0-20min梯度洗脱60:40(v/v)到50:50(v/v);20-33min常液洗 脱，50:50(v/v);33-45min常液洗脱，60:40(v/v)。检测波长210腿。柱温35"C,流速1.0 mL/min，进样量10 jiL，灵敏度(AUFS-l.O)，理论塔板数按长春碱、长春质碱计算不低于2000。
阿吗碱的的洗脱剂为水(用H3PO调节pH至2.03):乙腈。流动项条件为0-10min 梯度洗脱95:5(v/v)到80: 20(v/v)，0-40min常液洗脱80:20(v/v);45-55min常液洗脱95: 5(v/v)。检测波长238nm。柱温35'C,流速1.0mL/mm,进样量10 ^L，灵敏度 (AUFS-l.O)，理论塔板数按阿吗碱峰计算不低于2000。
3.标准曲线的制作
将所述对照品溶液分别稀释1、 2、 5、 10倍，在相应色谱条件下进样，记录图谱 及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，mg/L)进行回归分析。通过研究，本 发明中长春碱在2.5-25 mg/L、长春质碱在2.5-25 mg/L、阿吗碱在2.5-25 mg/L范围 内呈现良好的线性关系。长春碱、长春质碱和阿吗碱对照品的线性回归方程分别为-
Yvinblastine=44.278X-30.322r=0.9972
Ycatharanthine=40.649X+24.094r=0.9974
Yajmalicine=44.262X-29.476r=0.9971
4.样品的制备和TIAs含量的测定
收集所述液体培养30d的长春花转基因毛状根，用滤纸吸干表面培养基，称取鲜 重，于6(TC烘干48h至恒重，称其干重。将毛状根放入研钵中，加入少量石英砂， 研磨，加入95%乙醇(1:5, W/V)， 50'C超声提取30min，冷却至室温，对提取液离 心(12，000rpm) 10min，吸取上清液，于12,000 rpm再离心10 min，吸取上清液， 用HPLC法测量TIAs含量。
在本发明中转orca3基因和glOh基因显著提高长春花毛状根TIAs含量。转orca3 基因及glOh基因的长春花毛状根中长春碱、长春质碱和阿吗碱的平均含量分别为 1.324mg/gDW、 0.196mg/gDW和0.872mg/g DW，是空白转化发根的4.01倍、0.7倍 和3.75倍(0.329mg/g DW长春碱、0.249 mg/g DW长春质碱和0.233 mg/g DW阿吗碱)。 转orca3基因及glOh基因毛状根总TIAs含量为2.392mg/g DW，是空白转化发根的 2.9倍(0.812 mg/g DW)。在所测试的转orca3基因及glOh长春花毛状根无性系中， G8中TIAs含量最高(4.315 mg/g DW)。
本实施例采用HPLC法测定了转基因长春花毛状根TIAs含量，采用转orca3基因及glOh基因的代谢工程策略获得了 TIAs高产的长春花毛状根，证明了本发明的可 行性，为利用生物工程技术调节植物代谢产物含量提供了一种新的方法
技术领域：
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明 各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本 文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的 多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。序列表
<110>上海海泰药业有限公司
<120> —种植物重组表达载体及其包含该载体的转化体 <140>
<141> 2008-05-18
<160> 3
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 1494
<212> DNA
<213> 长春花(Catharanthus roseus)
<400>
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1权利要求
1.一种植物重组表达载体，包含转录因子、启动子和关键酶基因的的融合序列，所述的启动子为包含对转录因子特异响应元件的启动子。
2. 如权利要求1所述的植物重组表达载体，其特征在于所述启动子可为 组成型、诱导型或组织特异性表达启动子。
3. 如权利要求1所述的植物重组表达载体，其特征在于所述启动子为带 有jere元件的启动子。
4. 如权利要求3所述的植物重组表达载体，其特征在于所述启动子为tdc 启动子。
5. 如权利要求1所述的植物重组表达载体，其特征在于所述转录激活因 子可为orca2、 orca3、 PAP1、 PAP2、 0SB1、 TTG1、 anl、 an2、 anll、 jafl3、 del、 antl、 Lc、 TT16、 B、 Sn、 Hopi、 Cl、 Pl、 ANL2、 TTG2、 ttl、 tt2、 CPRF、 Ntliml、 MybA中之一。
6. 如权利要求1所述的植物重组表达载体，其特征在于所述转录激活因 子为具有与orca3相同或相似功能的所有具有DNA结合蛋白区AP2结构域和转录激活结构域的转录激活因子。
7. 如权利要求6所述的植物重组表达载体，其特征在于所述转录激活因 子为orca3。
8. 如权利要求l所述的植物重组表达载体，其特征在于所述关键酶基因 可包括一个目的基因或多个相同或不同的目的基因。
9. 如权利要求1所述的植物重组表达载体，其特征在于所述关键酶基因 为gl0h基因，该基因具有SEQ1DNO. 1所述的序列。
10. 如权利要求l所述的植物重组表达载体，其特征在于所述植物重组 表达载体可含有筛选标记。
11. 如权利要求l所述的植物重组表达载体，其特征在于所述筛选标记 为潮霉素(hygromicin)和卡钠霉素(kanamycin)。
12. —种包含1-ll任一项所述植物重组表达载体的转化体。
全文摘要
一种植物重组表达载体，属于基因工程技术领域，其特征在于，所提供的植物重组表达载体，包含转录因子、启动子和关键酶基因的的融合序列，所述的启动子为包含对转录因子特异响应元件的启动子。所述启动子可为组成型、诱导型或组织特异性表达启动子，优选为带有jere元件的启动子，最优选为tdc启动子。提供包含上述植物重组表达载体的转化体。其中转化体的制备方法，包括以下步骤制备植物重组表达载体；转化植物材料；筛选转基因植物材料。
文档编号C12N15/82GK101613713SQ200810039590
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者唐克轩, 宇 孙, 磊 张, 平 方, 莹 肖, 鹏 邸, 陈军峰, 龚一富 申请人:上海海泰药业有限公司;中国人民解放军第二军医大学