专利名称：一种弓形虫pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及生物医学及实验动物寄生虫质量控制技术领域，尤其涉及弓形 虫PCR检测方法。
背景技术：
现行国家标准中的弓形虫检测依仗血清学检测，然而血清学检测存在无法 避免的滞后性以及难以检测环境中的病原体。在实验动物质量控制新国标修订稿中列举了弓形虫检测的PCR方法。该方 法是对原有血清学方法(IHA、 IFA、 ELISA等)的有效补充。但是仍需要处死 动物，并且检测方法相对繁琐。由于PCR是以指数方式扩增，极微量的DNA污染都可能造成假阳性结果， 因此反应体系的干净程度是绝对重要的。现有技术中，需要自行加入各种PCR 反应组分，容易发生核酸污染，干扰检测结果。参照修订稿中的操作流程，需 要在PCR操作时分7次加入PCR反应组分以及反应过后电泳前的上样缓冲液， 共8次需要移取试剂加入PCR反应管。耗时费力，且人为操作不慎，操作地点 设备(如超净工作台失效)，甚至PCR操作区域布局不当，都使反应体系受污 染的机率大大增加，会直接改变PCR结果，影响诊断。另外，在该修订稿中，仍需要处死动物釆取腹水、其他组织或采取大量血 液(0.2毫升已经超过小鼠最大安全采血量)作为样品，每检测一只动物就必 须处死或者采血造成动物伤害。因此，本领域迫切需要提供一种简便、有效的实验动物弓形虫PCR检测方 法，并且无需处死动物。发明内容本发明旨在提供一种实验动物弓形虫PCR检测方法。在本发明中，提供了一种弓形虫PCR检测方法，所述的检测方法包括步骤(1) 将引物、T叫DNA聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、和 PCR产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；(2) 将步骤(1)得到的粉末和样品混合，进行PCR反应，得到PCR产物；和(3) 将PCR产物进行电泳检测；所述样品包括抽提自哺乳动物尿液和/或粪便的核酸。在另一优选例中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。在另一优选例中，所述的缓冲液是10X PCR缓冲液，其中含有氯化钾， Tris-HC1，和Triton X-100。在另一优选例中，所述的10X PCR缓冲液的配方是5 0 OmM氯化钾，1 0 0mMTris-HCl， 1 v/v%Triton X-100，和双蒸水。在另一优选例中，PCR产物电泳前的上样缓冲液是10X上样缓冲液，其中含 有丙三醇，和GelRecF 。在另一优选例中，所述的10X上样缓冲液的配方是5 Ov/v^丙三醇，和 0. 05v/v%GelRed 。在另一优选例中，所述的Taq DNA聚合酶为红色。在另一优选例中，所述的哺乳动物选自灵长类动物、猫科动物、犬科动物、 或啮齿类动物。在另一优选例中，所述的哺乳动物选自猴子、猪、猫、犬、大鼠、或小鼠。 在另 一优选例中，所述的样品还包括阳性对照品和阴性对照品。据此，本发明提供了一种简便、有效的实验动物弓形虫PCR检测方法，并 且无需处死动物。
图1显示了实施例1中的检测电泳图；其中A显示的是DL2000标记物的电 泳结果，B显示的是标准阳性片段的电泳结果。
具体实施方式
发明人在实践中发现可以通过检测实验动物的排泄物，如尿液和/或粪便，用PCR的方法检测弓形虫是否存在，并且所述的用于检测的PCR试剂是一次性加入， 避免了由于操作歩骤繁多而可能造成无法准确检测的后果。如本文所用，"PCR"是指聚合醇链反应(polymerase chain reaction, PCR)，是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性-退 火-DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增的一项分子生物学 技术。本发明中所使用的聚合酶稳定剂是上海赛百盛基因技术有限公司的产品。 Tris是指三羟甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)ami画ethane)。 Triton X-100是指曲拉通X100(Amresco)。GelRed荧光核酸染色试剂(GelRed Nucleic Acid Stain)是美国Biotium Inc.的产品，GelRed 是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂。它 可以替代高毒性染色剂一溴化乙锭(EB)，用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 中dsDNA和ssDNA的染色。GelRed 既可用于预制凝胶也可用于电泳后染色。本发明提供的弓形虫PCR检测方法包括步骤.-(1) 将引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、 和PCR产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；(2) 将步骤(1)得到的粉末和样品混合，进行PCR反应，得到PCR产物；和(3) 将PCR产物进行电泳检测，确定样品中是否存在弓形虫。 本发明对于PCR反应所需试剂，先进行预混和冻干制备。PCR反应需要的反应组分有缓冲液、Taq酶、引物2条、dNTP、样品(或阴、阳性对照)、水。 在本发明的一个优选例中，按照国标修订稿中的弓形虫PCR检测方法中规定的 上述组分的浓度，配置试剂后进行预混和分装，每个PCR反应管中加入T叫DNA 聚合酶、单次 PCR 引物按弓形虫 Bl 基因序列设计 5， GGAACTGCATCCGTTCATGAG3' (694-714bp， SEQ ID NO: 1); 5' TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3'(887-868bp， SEQ ID NO: 2)，预计扩增产物 为194bp。 10XPCR反应缓冲液(含MgCl2 15mM)以及10 dNTP:各为lOmM， 并加入PCR产物电泳前的上样缓冲液。预混分装后进行冻干。冻干的目的是去 除预混溶液中的水分，防止预混成分的变性和降解。由于去除了水分，预混后的PCR管中反应组分呈粉末状。为了保证每一管中均含有Taq酶，避免PCR预 混管的核心组分差异，采用红色的Taq酶，所以预混冻干后，PCR反应管底部 可见红色粉末。本发明将预混和冻干的PCR反应试剂和提取自哺乳动物排泄物的样品混合， 进行PCR反应，得到PCR产物。在常规PCR实验中，由于反复冻融和抽取，可能导致试剂的浪费和交叉污 染，增加出错的机率。本发明PCR反应管在使用时，因原有溶液组分已被冻干 成为粉末，只需加入样品，再补足水至原定的反应体系(50或20微升体系) 即可。PCR操作中向PCR反应管中加溶液縮短为2次，而不是传统的7次。预 混的试剂也避免了操作中因多次加样，可能发生的核酸污染。由于已经预混了 上样缓冲液，PCR反应结束后，电泳前也不用预混上样缓冲液，经存放期试验， 该试剂盒在-2(TC条件下能存放一年仍然有效，室温下存放十五天之内不影响 检测效果。本发明采用动物尿液和粪便作为样品，可以检出弓形虫阳性结果。在人工 感染后80小时，可以从尿液和粪便中查出相应的核酸序列， 一方面说明弓形 虫核酸在小鼠体内的代谢规律，另一方面说明PCR方法在通过尿液和粪便样品 检测弓形虫的可行性。后续的血清学IHA试验的结果说明弓形虫感染的小鼠在 已能从排泄物中检出阳性序列的40小时之后，仍未能从其血清中检测到的特 异性抗体。通过排泄物检测弓形虫指标，可以避免伤害或处死动物，对于某些 价值较高的基因工程小鼠的质量检测有很重要的意义，是对于减少、替代和优 化动物实验的"3IT理论的施行，也是保障动物福利的具体实践。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所 揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特 征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于1、 简化和标准化弓形虫PCR诊断方法，最大可能地防止PCR检测中的核酸 污染；2、 在保证诊断效果的情况下对动物无伤害。下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。在本发明的实施例中，PCR反应的操作步骤如下 l.提取待检样品的DNA:(1) 取疑似弓形虫病的病料(实验大小鼠推荐采用动物的腹水、尿液或粪 便)；(2) 按照不同厂商的核酸提取试剂盒或者自配试剂进行，优选使用Qiagen Mini AmpDNA Kit。(3) 室温晾干或倒置于超净工作台内风干，15-30分钟。用双蒸水溶解(难于溶解时，可56'C水浴15分钟) 2.PCR加样体系模板 双蒸水即为模板，即用或-7(TC冻存备用10ul 40ul3.反应程序94'C预变性 94'C变性 60'C退火 72。C延伸3min如s 30s30个循环72。C延伸 7min4.电泳10pl扩增产物经2 %琼脂糖凝胶电泳(加入少许EB或Goldenview核酸显影剂 混匀)分离。同时在相邻孔加适量DNAMarker,在5V/cm电压下，lxTAE液中电泳30分钟，在紫外成像仪下观察结果。 [结果判定]
在约194bp位置出现特异性扩增带，实验结果为阳性(如图l)。 实施例1
采用弓形虫(7b^^力as鹏卵/ 力7)国际标准毒株RH株人工感染了实验小 鼠(近交系C57 12只雌雄各半、远交系ICR 24只雌雄各半和裸小鼠6只雌雄 各半，均购自上海市斯莱克实验动物有限责任公司SCXK (沪)2003-003，动物 实验在上海市计划生育科学研究所动物房SYXK (沪)2003-019进行)，并设 生理盐水对照组(近交系C57、远交系ICR和裸小鼠各6只雌雄各半)。分别 于感染后第4至第120小时，每4小时收集一次小鼠的尿液和粪便(小鼠代谢 笼系苏州冯氏实验动物设备有限公司产品)，提取核酸后，采用预混冻干的PCR 反应管进行弓形虫PCR检测。感染后第120小时，动物采血，进行血清学检测， 弓形虫间接血凝(IHA)试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。结果， 弓形虫感染后第80小时后，所有的感染组小鼠的尿液和粪便制样均可PCR检 测出阳性条带，经克隆测序，与己知的弓形虫B1基因片段同源性高达99%。对 照组小鼠的尿液和粪便均未出现特异性条带，电泳结果仅见引物二聚体。IHA 试验均为阴性结果。
实施例2
从2007年上海市实验动物生产许可证五年到期复评审检测中的六家不同 受检单位的抽样实验小鼠，采集小鼠的尿液和粪便，共计6个品系(KM、 ICR、 裸小鼠、BALB/c、转基因小鼠、C57) 78只小鼠148份核酸样品。提取核酸后， 采用自制的弓形虫PCR快速检测试剂盒进行检测。同时，使用德国genekam产 弓形虫PCR检测试剂盒作对比。除了试剂盒的比对，还进行了3人次的人员比 对。结果，PCR反应均为阴性，无论是自制的PCR快速所检测的小鼠样品中人 员比对的结果一致，德国genekam产品结果与自制的弓形虫PCR快速检测试剂 盒完全一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并非用以限定本发明的实质技术 内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相 同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。序列表
〈110〉上海实验动物研究中心
〈120〉 一种弓形虫PCR检测方法
<130〉 083019
<160> 2
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211> 21
〈212> DNA
〈213〉 人工序列
〈221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400> 1
ggaactgcat ccgttcatga g
<210〉 2
<211〉 20
〈212〉 廳
<213〉 人工序列
<221> misc—feature
<223> 引物
〈400〉 2
tctttaaagc gttcgtggtc
权利要求
1.一种弓形虫PCR检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括步骤(1)将引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、和PCR产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；(2)将步骤(1)得到的粉末和样品混合，进行PCR反应，得到PCR产物；和(3)将PCR产物进行电泳检测；所述样品包括抽提自哺乳动物尿液和/或粪便的核酸。
2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的缓冲液是10X PCR缓 冲液，其中含有氯化钾，Tris-HCl，和Triton X-100。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的10X PCR缓冲液的配 方是5 0 OmM氯化钾，1 0 OmM Tris-HCl， 1 v/v%Triton X-100，和双蒸水。
5. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，PCR产物电泳前的上样缓冲液 是10X上样缓冲液，其中含有丙三醇，和GelRecP 。
6. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的10X上样缓冲液的配 方是5 Ov/v^丙三醇，和0. 05v/v%GelRed 。
7. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的Taq DNA聚合酶为红色。
8. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的哺乳动物选自灵长类 动物、猫科动物、犬科动物、或啮齿类动物。
9. 如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的哺乳动物选自猴子、 猪、猫、犬、大鼠、或小鼠。
10. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样品还包括阳性对照品 和阴性对照 品o
全文摘要
本发明公开了一种弓形虫PCR检测方法，所述的检测方法包括步骤(1)将引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶稳定剂、四种单核苷酸、缓冲液、和PCR产物电泳前的上样缓冲液混合，冻干成粉末；(2)将步骤(1)得到的粉末和样品混合，进行PCR反应，得到PCR产物；和(3)将PCR产物进行电泳检测；所述样品包括抽提自哺乳动物尿液和/或粪便的核酸。
文档编号C12Q1/68GK101649348SQ20081004155
公开日2010年2月17日 申请日期2008年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者濮俊毅, 胡建华, 诚 高 申请人:上海实验动物研究中心