专利名称：Prm1基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，尤其涉及一种PRM1基因的应用。
背景技术：
大结肠癌是我国常见肿瘤之一，占全国恶性肿瘤死因的第五位。且大结肠癌的发
病率呈逐年升高趋势，并且发病年龄趋于年轻化。我国每年约有13万人新发大结肠
癌，发病率的增速是世界平均水平的两倍，达到年均4%，目前大结肠癌在我国大部分
地区已经成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一。因此寻找有效的免疫治疗靶点十分重
要(S Zheng， SR Cai. Colorectal cancer epidemiology and prevention study in
china. The Chinese-German J Clinical Oncology, 2003，2:72-75)。
肿瘤-睾丸(cancer-testis, CT)基因可在多种组织来源的肿瘤中表达，但在人类正
常组织中仅限于睾丸的生殖细胞中表达。因为生殖细胞不表达人类白细胞抗原分子，
并且体内存在血-睾屏障，所以睾丸组织表达的CT抗原不会引起机体免疫反应，而表达
于肿瘤组织的CT抗原，会引起特异性免疫反应，因此这类抗原又被视为具有肿瘤特异
性。利用这一特性，发现与肿瘤相关的特异性CT基因，可促进抗原特异性肿瘤疫苗的
发展，为肿瘤免疫治疗提供新的机遇(ELke J, Dirk J， Knuth Alexander. Clinical
cancer vaccine trials. Curr Opin Immunol, 2002, 14 (2): 178 - 182)。
PRM1 (Protamine 1)基因，又称为精蛋白Pl，定位于染色体16P13. 2上，全长为
426个碱基，含有2个外显子，2个内含子，编码一个含有50个氨基酸的核蛋白
(Choudhary， S. K. ; Wykes. A haploid expressed gene cluster exists as a single chromatin domain in human sperm. J. Biol. Chem, 1995, 270: 8755-8762)，艮卩精 蛋白Pl。精蛋白是精子细胞核内DNA结合的主要蛋白(Cho.C， Willis. Haploinsuff iciency of protamine_l or -2 causes infertility in mice. Nature Genet: 2001， 28:82-86)。人类精蛋白基因族包括三个紧密调节的基因，PRM1、 P腿2和TNP2， 在精子形成过程中，三个基因的产物能够重新包装父系基因组形成有功能的配子
(Martins RP， Krawetz SA. Nuclear organization of the protamine locus. Soc R印rod Fertil Suppl， 2007,64:1-12)。在精子的形成中发挥了重要作用。在以往的研 究中，PRM1被认为与男性的不育有很重要的关系(Ravel C， Chantot-Bastaraud S.Mutations in the protamine 1 gene associated with male infertility. Mol Hum R印rod, 2007, 13 (7) :461-464)。
人PRM1基因是CT抗原家族的成员之一，关于PRM1基因与结肠癌的关系尚不清楚， 也未见文献报道过。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种PRM1基因的应用，该PRM1基因可作为 结肠癌诊断的标记分子，提高了结肠癌诊断的准确性。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现
在本发明的一个方面，提供了一种PRMl基因在制备诊断结肠癌的产品中的应用。 所述诊断结肠癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR或免疫检测诊断结肠癌 的产品。
在本发明中，所述用RT-PCR诊断结肠癌的产品至少包括一对特异扩增PRM1基 因的引物。
所述用实时定量PCR诊断结肠癌的产品至少包括一对特异扩增PRM1基因的引物。
所述用免疫检测诊断结肠癌的产品包括与PRM1蛋白特异性结合的抗体，包括 多克隆抗体和单克隆抗体。
在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对PRM1蛋白特异的抗 体。例如，将提纯的人PRM1基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆 抗体。同样，表达人PRM1蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产 生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技 术制备(例如，Kohler et al. ， Nature 256: 495， 1975; Kohler et al.， Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976; Kohler et al. ， Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976)。本发 明的抗体包括可以阻抑PRM1功能的抗体，也可以是不影响人PRM1功能的抗体。每一 类抗体都可以通过对人PRM1基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人PRM1基因 产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的PRM1 基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例如AcoW中产生的基因产物来免疫动 物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化PRM1蛋白或多肽结合的抗体，可以 利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。本发明实验证明PRM1基因在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此PRM1 基因可作为诊断结肠癌的特异标志基因，使结肠癌诊断更加准确、快速。
图1是本发明通过RT-PCR检测PRM1基因在人类正常组织中的表达图； 图2是本发明通过RT-PCR检测PRM1基因在人结肠癌组织和癌旁组织中的差异表 达图3是本发明通过实时荧光定量RT-PCR检测PRM1基因在人结肠癌组织和癌旁组 织中差异表达的箱线图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条 件的实验方法,通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议 的条件。
实施例1
RT-PCR实验检测PRM1基因在人类正常组织及结肠癌组织中的表达情况。
1. 组织分离(Tissue isolation)
本发明所用结肠癌及癌旁组织均来自临床结肠癌的手术病人。手术切除的结肠 癌组织一经离体，迅速切取病灶及周围5公分以外正常组织，并放入液氮中保存。癌 和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。15种人体正常组织(脑、心、肺、脾、肾、 胃、食管、小肠、卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、肝、胎肝及睾丸)RNA均购自Clontech 公司。逆转录酶为M-MLV Reverse Transcriptase, Promega CO. 。 PCR试剂Taq DNA 聚合酶、dNTP等均为大连宝生物技术有限公司。PRM1基因(GeneID: 5619)的引物 是Forward: 5' -CAGAGTTCCACCTGCTCACA-3' (SEQ ID NO: 1) 、 Reverse: 5， -TTCTCAGGCA GGAGTTTGGT-3' (SEQ ID N0:2)， PCR产物长度为280bp。作为内对照的p-actin引物 是Forward:5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3' (SEQIDN0:3)、 Reverse: 5'-CAGCGG AACCGCTCATTGCCAATGG-3' (SEQ ID N0:4); p-actin扩增片断长度为400bp。
2. 总RNA的抽提试剂盒
抽提RNA试剂采用TRIzol reagent (GIBC0/BRL)，该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA 酶的环境。
3. RNA的抽提步骤
将碾杵和匀浆器等器皿在20(TC干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷， 将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀 浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C 离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4。C离心分层；将 上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4。C离心沉淀RNA;用75%乙醇洗 涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定紫外分光光度 计测定260/280比值(比值均在1. 7 2. 0);并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解， 本发明所用MA均无降解。为了去除基因组DNA的污染,全部RNA均用无RNA酶的DNA 酶I (美国Ambion公司)消化。
4. cDNA的合成
取总RNA 2Pg，随机引物1W， 70。C保温3min，立即冰上变性5 min。加入5X buffer, DTT和0. 05g *L—1的dNTP各2 W及1 W的逆转录酶，充分混匀后，42°C 2h。 模板使用终浓度通常为0. Olg L—、
5. 半定量RT-PCR
以cDNA为模板，PCR扩增PRM1基因，同时以P-actin作为模板量的对照。PCR 条件为94。C预变性3min; 94。C变性30s， 57。C退火30s， 72。C延伸40s，共35循环 (e -actin为25循环)；72'C延伸5min。用2%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物。
6. 实验结果显示，PRM1基因仅在睾丸中表达，其它组织中均无表达(见图l)。 利用半定量RT-PCR方法检测PRM1基因在人类结肠癌组织及癌旁组织中的表达情况， 结果发现PRM1基因在33% (3/9)的结肠癌中明显上调，3例阳性结果见图2。在图2 中，"N"指癌旁组织，"C"指结肠癌组织。
7. 根据上述实验结果，可通过RT-PCR诊断结肠癌设计PRM1基因的PCR引物， 检测肿瘤组织中PRM1基因RNA的含量，RNA含量高则说明患结肠癌的可能性高，反之 则低。
实施例2实时荧光定量RT-PCR实验
使用TaKaRa生物公司的新型实时荧光定量PCR仪(Thermal Cycler Dice
6Detection System,日本)，检测PRM1基因在12对人类结肠癌组织及其对应的癌旁 组织中的表达。反应体系如下总体积20ul， SYBRPremixEXTaq 10ul，引物(10uM) 各0.4 ul ， DNA 2ul， ddH20 7.2ul，上下颠倒混匀试剂，离心后放入PCR仪中进行 扩增反应。仪器使用按厂家的说明操作。(3-Actin被用来当作内对照。所述实验均重 复三次以确保结果的可靠性。结肠癌和癌旁组织中的PRM1基因的表达水平按以下方 法进行计算PRMl厶Ct =平均PRM1—Ct -平均(5-actin—Ct， PRM1A A Ct= PRM1A Ct— 癌组织-PRM1A Ct一癌旁组织，癌和癌旁组织中的PRM1基因的倍数关系用2—""""来计 算。实验数据用SPSS软件统计(x2检验)，P〈0.05定义为有统计学意义。
结果显示，与癌旁组织相比，PRMl基因在50y。 (6/12)的结肠癌组织中有高于2 倍的上调(P<0.01)，因此，PRM1基因在结肠癌组和癌旁组中的表达有明显差异(见 图3)。在图3中，"*"代表p〈0.01，方框内横线代表每组检测值ACt的中值，方框 外的上下短线分别代表检测值中的最高值和最低值。本发明荧光定量PCR检测的阳性 率高于上述普通RT-PCR的结果，这可能与荧光定量PCR的高灵敏度有关。
该实验结果表明，可通过实时荧光定量PCR诊断结肠癌设计PRM1基因的PCR 引物，检测结肠癌组织中PRM1基因RNA的含量，RNA含量高则说明患结肠癌的可能性 高，反之则低。
实施例3免疫检测
1. 抗原蛋白获得
(1) 利用基因工程表达可从Genbank数据库中获得人PRM1基因的cDNA序列， 通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达PRM1蛋白， 并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白质。
(2) 通过培养高表达PRM1基因的人体来源细胞或组织，再分离纯化PRM1蛋白。
2. 抗体制备
可采用以下几种方法制备抗体
(1) 细胞融合法用上述制备的PRM1蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得 脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。
(2) 利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程 单克隆抗体。
(3) 利用纯化的蛋白质免疫动物，制备多抗血清。3.检测
(1) 用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行结肠癌的病理检测，阳 性信号为结肠癌。
(2) 取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为结肠癌可疑病人。
(3) 将PRM1抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于多种肿瘤诊断。
8序列表
〈110〉 上海人类基因组研究中心
<120〉 PRM1基因的应用
〈130〉 NP-08-12214
<160> 4
〈170> Patentln version 3. 3
〈210〉 1
<211> 20
〈212〉 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
<222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
<400> 1
cagagttcca cctgctcaca 20
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
〈222〉 (l)..咖
〈223〉 引物
〈400〉 2
ttctcaggca ggagtttggt 20
〈210〉 3
〈211> 25
〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
〈220>
<221〉 misc—feature
<222> (1)..(25)
〈223〉 引物<400〉 3
tcacccacac tgtgcccatc tacga 25
〈210> 4
〈211〉 25
〈212〉 DNA〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
<222> (l),.咖
<223〉 引物
〈400〉 4
cagcggaacc gctcattgcc aatgg 2权利要求
1. 一种PRM1基因的应用，其特征在于，所述PRM1基因在制备诊断结肠癌的产品中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断结肠癌的产品包括用 RT-PCR、实时定量PCR或免疫检测诊断结肠癌的产品。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断结肠癌的产品至 少包括一对特异扩增P服l基因的引物。
4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断结肠癌的 产品至少包括一对特异扩增PRM1基因的引物。
5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用免疫检测诊断结肠癌的产品 包括与PRM1蛋白特异性结合的抗体。
全文摘要
本发明公开了一种PRM1基因的应用，用于制备诊断结肠癌的产品。本发明的PRM1基因，可作为诊断结肠癌的特异标志基因，使结肠癌诊断更加准确、快速。
文档编号C12Q1/68GK101497921SQ20081004310
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月2日 优先权日2008年2月2日
发明者滕小梅, 韩泽广, 健 黄 申请人:上海人类基因组研究中心