专利名称：：重组长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及重组蛋白，具体涉及重组长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法。
背景技术：
：糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，已成为现代社会严重危害人类健康与生命的主要疾病。根据世界卫生组织(WHO)提供的数据，发达国家糖尿病患病率己高达5%-10%，在我国则为3%左右；到2030年，全世界糖尿病患者人数将比2000年翻一番。其中2型糖尿病患者人数目前约占所有糖尿病患者人数的90%以上。胰高血糖素样肽-1(glucagon,likep印tide.1GLP—1)可以与GLP-1受体相结合，通过多种作用控制血糖，包括刺激胰岛素分泌、同时抑制胰高血糖素和胃排空，但是不会产生低血糖，对II型糖尿病的治疗具有较好的效果。天然胰高血糖素样肽-1在体内很快被DPP-IV降解，半衰期只有2-3分钟，在给药上具有很大的困难。肠促胰岛素类似物(exendin-4)最初由毒蜥属动物唾液中分离，是由基因exendin-4表达产生，可激活人体内GLP-1受体，可以通过促进胰岛素分泌和细胞再生、抑制食物摄入而降低血糖。但它不是DIP-IV的底物，因而具有较长的半衰期和较强的生物活性。exendin-4注射给药后，能够模拟调控机体胰岛素的激素在体内发挥作用，从而达到控制血糖的效果。exendin-4—天注射两次，优点在于不需要根据糖化血红蛋白(HbAlc)或血糖水平来调整剂量,在早餐和晚餐前给予固定剂量即可，从而减少患者频繁监测血糖的不便。HGS公司的Albugon，它是GLP-1和人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)的融合体，它在猴子体内的半衰期为3天，目前已进入临床II期。人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中的蛋白质总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。人血清白蛋白是一种球状非糖基化的，分子量为65Kd的蛋白质。人血清白蛋白的基因位于4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区，经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白在经过高尔基体的转化加工，去除分泌信号而分泌到细胞外。人血清白蛋白有35个半胱氨酸，构成17个二硫键的单体(BrownJR，Thestructure,functionalandapplicationofhumanalbumin,Pergamon，NY1977)。人血清白蛋白具有多种多态形及30种不同的遗传分子(Weikamp，CR，humangenomicAnnual,37:219-226，1973)。人血清白蛋白分子的三维结构已经由X光衍射法测定(Carter,Science,244，1195-1198，1989)。人血清白蛋白是血液种的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，半衰期寿命为14-20天。综上所述，人血清白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，并可使治疗性蛋白质以较高的剂量使用。目前用于临床的人血清白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产专利已经公开，EP330451和EP361991。
发明内容本发明的目的在于提供一种长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法。本发明中的长效胰高血糖素样肽类似物为将exendin-4和人血清白蛋白通过基因工程的方法融合在一起的融合蛋白，融合蛋白分子既保持exendin-4蛋白的生物学功能，又含有HSA稳定的惰性性质，极大的延长了exendin-4的半衰期。在临床使用中可减少注射给药次数，减轻患者的痛苦，提高疗效并降低医疗费用。以往不同基因融合表达中，在考虑两个蛋白生物学活性上，两个基因之间往往需要连接肽(linker)连接，而连接肽在临床治疗中可能造成高的免疫原性。本发明在研究exendin-4蛋白和人血清白蛋白构象和活性中心后，充分利用两个不同蛋白N端和C端的序列特征，使两个基因直接相连融合表达，避免了免疫原性的担忧，同时保留了exendin-4的降糖活性。本发明在获得了表达长效胰高血糖素样肽类似物的基因工程菌的基础上，又对其发酵和纯化工艺进行了选择及优化，在保证产物活性的基础上，进一步提高了蛋白表达效率及纯化产物得率。本发明公开了一种长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，将长效胰高血糖素样肽类似物通过带有长效胰高血糖素样肽类似物基因的工程酵母发酵表达，长效胰高血糖素样肽分泌表达于培养基中。含有胰高血糖素样肽的培养上清通过蓝色染料亲和层析进行粗纯化，再经过疏水层析中纯化和离子交换层析精纯化获得纯度大于95%的胰高血糖素样肽精制本发明的制备方法具体包括下列步骤1)在发酵罐中接种前述基因工程毕赤酵母菌种；2)在适合表达长效胰高血糖素样肽类似物的条件下，发酵罐发酵培养基因工程毕赤酵母菌种；3)发酵液离心并收集上清；4)发酵液上清液中长效人胰高血糖素样肽类似物的分离纯化发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化，再经疏水层析中纯化，再经离子交换层析精纯化后获得纯度大于95%的产物。上述长效胰高血糖素样肽类似物，是由肠促胰岛素类似物exendin-4与人血清白蛋白(humanser咖albumin)直接连接获得的多肽，exendin-4与人血清白蛋白(humanserumalbumin)之间没有连接肽。上述基因工程毕赤酵母菌株，为被基因工程载体转化的毕赤酵母菌株，基因工程载体含有编码上述长效胰高血糖素样肽类似物的蛋白的基因。较佳的，上述编码上述长效胰高血糖素样肽类似物的蛋白的基因为针对酵母表达优化过的序列。上述步骤2)的发酵罐发酵培养条件为采用基础盐培养基，控制溶解氧大于30%，温度为30'C，pH6.0，培养16-20小时后，补加甘油溶液，再培养4-6小时；甘油培养阶段结束后，以向发酵罐中补加甲醇，发酵约70小时后结束发酵；上述步骤2)中，在酵母中表达融合蛋白时，通过分泌到酵母细胞外的培养液中完成。进一步的，本发明还对发酵产物的发酵及纯化工艺条件进行了优化对前述步骤1，先将基因工程菌菌种以YPD培养基摇瓶培养14小时_18小时后接种发酵罐。对前述步骤2，包括下述几方面的工艺条件优化1.所述基础盐培养基中加有6ml/L培养基的微量元素添加剂PTM1。2.补加甘油溶液的浓度为50%(v%)，且甘油溶液中含有12ml/L的PTMl。此阶段培养主要为生物量的增长阶段，使菌体的量在短时间内得到扩增。3.补加甲醇的过程为先控制补加甲醇的速度为3.6ml/小时/升培养基，其中甲醇中含有12ml/L的PTM1，而后逐步提高甲醇补料速度到10.8ml/小时/升培养基，并以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。采用上述工艺条件，发酵液上清液中的长效胰高血糖素样肽类似物的含量可达到300mg—600mg/L。对于前述步骤3，包括下述几方面的工艺条件优化1.发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化的步骤为发酵上清液pH到7.0，上样到经20mMpH为7.0的磷酸盐、500mMNaCl缓冲液平衡的蓝色染料(BlueS印hroase)亲和层析柱，上样完毕后先用20mMpH为7.O的磷酸盐、128rnMKSCN缓冲液冲洗去未结合的物质，再用20mMpH为7.0的磷酸盐、230rnMKSCN缓冲液冲洗脱结合在柱上的融合蛋白，以紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰。2.疏水层析中纯化的步骤为收集的蛋白溶液，调节硫酸铵的终浓度为0.46M，调节pH到7.0，此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.5M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的PhenylHighPerformance层析柱，上样完毕后先用20mM的磷酸盐加0.3M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质，使紫外280nm吸收的降回到基线，再用20mM磷酸盐加上0.1M硫酸铵pH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。3.离子交换层析精纯化的步骤为收集的蛋白溶液调节pH到5.0，并用水稀释到电导率小于3ms/cm，此溶液上样到经20mM的醋酸钠pH为5.0缓冲液平衡的CMFF层析柱，上样完毕后先用80mM的醋酸钠pH为6.5缓冲液缓慢洗脱，收集pH为6.2时的目标峰。重组长效胰高血糖素样肽类似物经亲和层析、疏水层析和离子交换层析后的纯度已大于95%，细菌内毒素、宿主DNA或蛋白残留等指标都能到达药典的一般要求，样品可用于下一步的制剂或除菌过滤后于一2CTC冻存。本发明制备获得的长效胰高血糖素样肽类似物极大的延长了exendin-4的半衰期。在临床使用中可减少注射给药次数，减轻患者的痛苦，提高疗效并降低医疗费用。此外，本发明制备方法，工艺条件容易控制，可以获得具有生物活性的长效胰高血糖素样肽类似物，且蛋白表达效率高及纯化产物得率高。具体实施例方式以下列举具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例并非用于限制本发明的保护范围，实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆试验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例1基因工程菌的培养和表达摇瓶菌种培养5个容量为1L的三角瓶，装YPD培养基各200ml，培养基配方为酵母提取物(1%)10g、蛋白胨(2%)20g,葡萄糖(2%)20g，用去离子水溶解并定容到1L，115。C蒸汽灭菌20分钟。每瓶接甘油菌种lOOul，3(TC摇床300rpm培养24小时，此时菌浓度0D600在6-20之间。30L罐发酵培养30L全自动发酵罐(Biostatc-dcu，Sartourius)，具体操作可参照其使用说明书。30L罐中装入基础盐培养基15L，配方为CaS04'2&00.93g/l，K2S0418.2g/l，MgS047H20，K0H4.13g/l，H3P0426.7ml/l，甘油40g/l用去离子水溶解并定容到15L。连接好pH电极、溶氧电极，温度电极等，开动搅拌500rpm，12rC在位灭菌30分钟。灭菌结束后，待其温度降到95'C时开始通气，继续待其冷却道3(TC时，加大通气量到30L每分钟，搅拌速度调到900rpm。调整溶氧电极读数到100，接上氨水调节发酵罐中的培养基pH到6.O，加入66ml经无菌过滤的微量元素添加剂70ml(PTMl:GuS04别206g/1，Nal0.08g/l，MnS04'H203g/l，CoCl20.5g/l，ZnCl20g/l，H3B030.02g/lNaMo03,2H200.2g/l，FeS047H2065g/l，Biotin0.2g/l，6MH2S0430ml/l)，加入已培养好的菌种开始培养。培养条件为温度3(TC、溶氧大于30%、pH用氨水控制在6.0、搅拌速度900rpm、空气流量为30L每分钟。如此培养20小时后，培养基中的甘油逐渐被耗尽，此时溶氧开始上升。当溶氧上升后，开始以280ml/小时的速度向发酵罐中补加50%的甘油(含12ml/L的PTM1)溶液，如此再培养6小时，停止甘油补料。此时菌体浓度OD600在150左右，开始以50ml/小时向发酵罐中补加甲醇(含12ml/LPTM1)。稳定2小时后提高甲醇补料速度为100m1/小时，此流速再稳定2小时后提高甲醇补料速度到150ral/小时，以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。取出发酵液，6000rpm离心10分钟，收集上清液。共收集上清液22L，上清液中的目标蛋白表达量在470mg/L。实施例2基因工程菌表达产物的分离纯化蓝色染料亲和层析将实施例1获得的发酵上清液用6MNaOH调节pH到7.0，上样到经20rnMpH为7.0的磷酸盐、500mMNaCl缓冲液平衡的蓝色染料亲和层析柱，柱床直径100mm，柱床高度15cm，柱床体积为1000ml。流速8L/小时，经3小时后上完样。上样完毕后先用20mMpH为7.0的磷酸盐、128mMKSCN缓冲液冲洗去未结合的物质，再用20mMpH为7.0的磷酸盐、230mMKSCN缓冲液冲洗脱结合在柱上的融合蛋白。以紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰，共收集洗脱液3200ml。疏水层析收集的蛋白溶液加入3M的硫酸铵溶液630ml，使溶液中的硫酸铵的终浓度到0.46M，调节pH到7.0。此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.5M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的PhenylHighPerformance层析柱，柱床直径50mm,柱床高度10cm，柱床体积为300ml。流速为1.2L/小时，经3小时上样完毕，然后先用20mM的磷酸盐加0.3M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质，使紫外280nm吸收的降回到基线。再用20mM磷酸盐加上0.1M硫酸铵pH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。共收集蛋白峰780ml。离子交换层析收集的蛋白溶液加入lM醋酸调节pH到5.0，加入1500ml去离子水使电导率小于3ms/cm。此溶液上样到经20mM的醋酸钠pH为5.0缓冲液平衡的CMFF层析柱，柱床直径50mm，柱床高度15cm，柱床体积为300ml。流速1.2L/小时，上样完毕后先用80mM的醋酸钠pH为6.5缓冲液缓慢洗脱，收集pH为6.2时的目标峰。共收集蛋白溶液820ml。实施例3小鼠的口服葡萄糖耐受实验采用8—10周的昆明小鼠，购买后适应性词养l周，自由采食和饮水。试验前l天禁食16_18小时，按体重静脉注射5mg/Kg人血清白蛋白或上述配置的重组胰高血糖素样肽类似物白蛋白融合蛋白注射液。给药后l小时口服灌注给予1.5mg/g体重的葡萄糖，分别在给糖前IO分钟和给糖后的IO、20、30、60、120分钟通过尾静脉取血并测定葡萄糖水平。结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果表明本发明获得的重组胰高血糖素样肽类似物白蛋白融合蛋白有明显的降糖活性。图1:重组长效胰高血糖素样肽类似物表达电泳图图2:蓝色染料亲和层析图谱图3:疏水层析图谱图4:离子交换层析图谱图5:纯化后的重组长效胰高血糖素样肽类似物电泳图图6:小鼠口服葡萄糖耐受实验血糖浓度随时间图。权利要求1.一种长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，包括下列步骤a)在发酵罐中接种表达长效胰高血糖素样肽类似物的基因工程毕赤酵母菌种；b)发酵罐发酵培养；c)发酵液离心并收集上清；d)发酵液上清液中长效人胰高血糖素样肽类似物的分离纯化:发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化，再经疏水层析中纯化，再经离子交换层析精纯化后获得纯度大于95％的产物。2.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述长效胰高血糖素样肽类似物是由exendin-4与人血清白蛋白直接连接获得的多肽，exendin-4与人血清白蛋白之间没有连接肽。3.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述步骤a为将基因工程菌菌种以YPD培养基摇瓶培养14小时_18小时后接种发酵罐。4.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述发酵罐培养的条件为采用基础盐培养基，控制溶解氧大于30%，温度为30°C，pH6.0，培养16-20小时后，补加甘油溶液，再培养4-6小时；甘油培养阶段结束后，以向发酵罐中补加甲醇，发酵约70个小时后结束发酵。5.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述基础盐培养基中加有6ml/L培养基的微量元素添加剂PTM1。6.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述甘油溶液为体积百分比50%的甘油溶液，且甘油溶液中含有12ml/L的PTM1。7.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所补加甲醇的过程为先控制补加甲醇的速度为3.6ml/小时/升培养基，其中甲醇中含有12ntl/L的PTM1，而后逐步提高甲醇补料速度到10.8ml/小时/升培养基，并以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。8.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤d中，所述发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化的步骤为发酵上清液pH到7.0，上样到经20rnMpH为7.0的磷酸盐、500rnMNaCl缓冲液平衡的蓝色染料(BlueS印hroase)亲和层析柱，上样完毕后先用20mMpH为7.0的磷酸盐、128mMKSCN缓冲液冲洗去未结合的物质，再用20mMpH为7.0的磷酸盐、230mMKSCN缓冲液冲洗脱结合在柱上的融合蛋白，以紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰。9.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤d中，所述疏水层析中纯化的步骤为收集的蛋白溶液，调节硫酸铵的终浓度为0.46M，调节pH到7.0，此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.5M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的PhenylHighPerformance层析柱，上样完毕后先用20mM的磷酸盐加0.3M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质，使紫外280nm吸收的降回到基线，再用20mM磷酸盐加上0.1M硫酸铵PH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。10.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤d中，所述离子交换层析精纯化的步骤为收集的蛋白溶液调节pH到5.0，并用水稀释到电导率小于3ms/cm，此溶液上样到经20mM的醋酸钠pH为5.0缓冲液平衡的CMFF层析柱，上样完毕后先用80mM的醋酸钠pH为6.5缓冲液缓慢洗脱，收集pH为6.2时的目标峰。全文摘要本发明涉及重组蛋白，公开了一种长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，包括下列步骤在发酵罐中接种基因工程毕赤酵母菌种；发酵罐发酵培养；发酵液离心并收集上清；发酵液上清液中长效人胰高血糖素样肽类似物的分离纯化，最终获得纯度大于95％的产物。本发明的长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，工艺条件容易控制，可以获得具有生物活性的长效胰高血糖素样肽类似物，且蛋白表达效率高及纯化产物得率高。文档编号C12R1/84GK101372705SQ20081004359公开日2009年2月25日申请日期2008年7月4日优先权日2008年7月4日发明者丁剑锋,朱化星,王英明,蔡丽君申请人:上海欣百诺生物科技有限公司