专利名称：一种烟草用高效抗病解磷菌肥及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种菌肥，同时还涉及该菌肥的生产方法，尤其涉及一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法。
背景技术：
微生物肥料能够减少和缓和农产品，尤其是蔬菜和水果中硝酸盐的污染，并且能改善作物的品质，目前在玉米、小麦和水稻等农作物及蔬菜生产中应用较多。
土壤中栖息着大量的微生物，其中对植物生产影响较大的是那些生活在植物根际的微生物，这些根际微生物多而活跃，构成了根际特有的微生物区系，根际微生物区系又主要以细菌为主，根据其对植物
的作用，根际细菌(rhizobacteria)分为有益(2^ 5X)，有害(8% 15%)和中性(80% 90%)3类，能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物被称为促生根际菌(plant growth-promotingrhizobacteria，简称PGPR), PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物(deleterious rizosphere microorganisms,简称DRM0)都有生防作用，对植物吸收利用矿物质营养也有促进作用，并可以产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
在上世纪70—80年代，我国曾大规模推广应用根瘤菌肥。目前，国内外应用的PGPR的作用机理主要有固氮、解磷、解钾、抗生、产生植物激素和植物修复等。固氮菌包括共生固氮菌根瘤菌和自生固氮菌如固氮螺菌daspz>77/w")、固氮菌Uzoto6a"w)、芽孢杆菌(Ba"7/ws)、肠杆菌C& &ra6acfer)和黄色杆菌(Xaw^ok cter)等。解磷细菌，能够使土壤中无效态磷转化为有效态磷，如假单胞菌、巨大
芽孢杆菌和短小芽孢杆菌(及/7"m说M)等。解钾细菌，能够使土壤
中矿物态钾转化为有效形态的细菌，目前发现的主要有扭脱芽胞杆菌
(及to^i/ms)、胶质芽胞杆菌(5. mz/"7g/wos)、环状芽胞杆菌 (万."Vrw&w》等。抗生菌通过定殖于植物根系，优先占领根际，产生 抗生素、铁载体、诱导植物的系统抗性、产生HCN等，拮抗根际的病 原菌和DRMO来保护促进植物生长发育。植物激素产生菌，其产生的 植物激素有生长素(IAA)、细胞分裂素和赤霉素，以及降低植物的 乙烯水平。乙烯产生于植物根部，可加快植物对生物的或非生物的环 境条件的变化的反应。高浓度的乙烯抑制植物根的生长，导致植物生 产不正常。许多PGPR可分泌l-氨基环丙烷-l-羧酸盐
(l-aminocyclopropane國l-carboxylate ， ACC)脱氨酶，ACC脱氨基酉每 可降解ACC生成-丁酸和氨，使得ACC不再被植物能够氧化ACC生 产乙烯，从而降低植物苗期根部及其周围乙烯的含量，刺激植物生长， 提高植物对盐分、高温、干旱、水涝、病害和土壤污染物等的抗性， 提高产量。植物修复菌已报道的有放射农杆菌(^gro6"cten'"m rad/o6acto-) 、 v4w/zraZ ac敏myswms、黄杆菌(i^vo6acfm'w附)、 固氮螺菌、假单胞菌、5^"ofra/ /70附os、肠杆菌、Cra6ac她.w附、K/，ra awcor6虛等。
我国推广的菌肥主要是融有益微生物、有机肥、无机肥的生物复 肥，所用的菌种主要是解磷菌、解钾菌和固氮菌。现有微生物肥料的 生产厂家仅400家左右，年产300万t，只占化肥产量的0.5%。如北京
世纪阿姆斯生物技术有限公司研制开发成功的"阿姆斯"世纪生物 肥料，己在全国近20个省市自治区的34种作物上试用，可使蔬菜增产 13—21%，棉花增产28%。北京绿源生物技术研究所开发的生物肥， 可使水稻小麦等增产10%—20%。武汉利泰技术有限公司及北京大学
6也分别研究开发成功多功能生物肥，可使作物增产10%以上。湖北德
隆生化有限公司提出利用一种多效有机生物肥料的生产方法。海南兰 德工贸技术公司提出一种生物复混肥料的制造工艺，它含有耐氨菌 剂、改造后的铵态氮肥和微量元素化合物。
菌肥在玉米、小麦和水稻等农作物及蔬菜生产中应用较多，在烟 草生产中应用很少，即使有应用，也只是起到单纯的解磷作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草用高效抗病解磷菌肥，既能防治 烟草病害又能够解磷的作用。同时，本发明的目的还在于提供一种烟
草用高效抗病解磷菌肥的生产方法。
本发明的技术方案是提供一种烟草用高效抗病解磷菌肥，包括
吸附剂和菌悬液，菌悬液中含有绿针假单胞菌XQ902 Wo/ora; ;^. XQ902 )，即绿针假单胞菌CGMCC No. 2324。
所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。所述的 吸附剂优选为草炭，草炭的含水量为10—20%，粉碎至60—80目。 所述的高效抗病解磷菌肥中，每400—600g吸附剂中加入100ml
菌悬液。
所述的菌悬液的制备方法为-
(1) 选取菌种绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No. 2324;
(2) 斜面菌种培养，培养方法26—30°C培养2—3d;
(3) 摇瓶种子培养，培养方法500ml三角瓶装培养基100ml， 121。C灭菌30—40min，冷却后接入1环斜面菌种，28—3(TC振荡培 养，摇床转速190—210rpm，培养时间26—30h;
(4) 发酵，培养方法400L发酵罐装培养基280L， 121"C灭菌 30—40min，冷却后接入28L种子培养液，28—30'C振荡培养，搅拌 转速250—270rpm，通风比1: (0.5—0.8)，培养时间48—50h;所得即为菌悬液。
所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是葡萄糖6—15g、甘 油80—120ml、酪蛋白3—8g、 NaHC03 0.5—1.5g、 MgS04 7H20 0.5 —L5g、 K2HP04 2—3g、十二烷基硫酸钠(SDS) 0.4—1 g、蒸馏 水900—1200ml;
所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是玉
米水解液100—150ml，蔗糖10—40g，蚕蛹粉2-6g,卵磷脂0.1-0.5g， KH2P04 l-5g， CaC03 l-5g， MgS04 0.1-0.5g，水1000ml,另含有 FeSO4.7H2O3-10PPM， MnS04.H20 3-10PPM，复合维生素3-10PPM。
一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，按以下步骤进行菌悬液的制备
(1) 选取菌种绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No. 2324;
(2) 斜面菌种培养，培养方法26—3(TC培养2—3d;
(3) 摇瓶种子培养，培养方法500ml三角瓶装培养基100ml， 12rC灭菌30—40min，冷却后接入1环斜面菌种，28—30"C振荡培 养，摇床转速190—210rpm，培养时间26—30h;
(4) 发酵，培养方法400L发酵罐装培养基280L， 121"C灭菌 30—40min，冷却后接入28L种子培养液，28—3(TC振荡培养，搅拌 转速250—270rpm，通风比1: (0.5—0.8)，培养时间48—50h;所 得即为菌悬液。吸附剂灭菌
吸附剂含水量10% 20%，粉碎至60 80目，1 1.5kg装/袋， 布袋或塑料袋，0.1MPa高压灭菌2 3小时，取出冷却备用； [3]吸附剂接种和培养
将吸附剂置于洁净塑料布上，每400—600g吸附剂拌入100ml 菌悬液，搅拌均匀，使含水量达"手握成团、触之即散"程度，将已接种菌悬液的吸附剂置于20 3(TC培养2 7天，使细菌进一步繁殖， 达到每克菌肥中活菌数不低于1亿，包装后即为高效抗病解磷菌肥产
P
叩o
所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是葡萄糖6—15g、甘 油80—120ml、酪蛋白3—8g、 NaHC03 0.5—1.5g、 MgS04 7H20 0.5 一1.5g、 K2HP04 2—3g、十二垸基硫酸钠(SDS) 0.4—1 g、蒸馏 水900—1200ml;
所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是玉 米水解液100—150ml，蔗糖10—40g，蚕蛹粉2-6g，卵磷脂0.1-0.5g， KH2P04 l-5g， CaC03 l-5g， MgS04 0.1-0.5g，水1000ml，另含有 FeSO4.7H2O3-10PPM， MnS04.H20 3-10PPM，复合维生素3-10PPM。
所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。所述的 吸附剂优选为草炭，草炭的含水量为10—20%，粉碎至60—80目。
本发明的菌肥应用于烟草可增加上等烟率，并可使烟叶的化学成 分协调性好，杂气和刺激性减少。本发明的菌肥能够明显促进烟草根 系发育、提高上等烟比例，并有改善烟草香吃味的作用。在拌种或育 苗时使用本发明的菌肥，苗齐苗壮，可有效防治苗期烟草病菌的侵染； 能够提高土壤磷的利用率，本发明的菌肥含有高效溶磷菌，可将土壤 和有机肥中难溶性的磷(无效磷)分解成速效磷(有效磷)，容易被 烟草吸收利用；可以增强植物抗病能力，抑制病菌和病毒的侵染，本 发明的菌肥能够在植物根际迅速繁殖，形成根际微生物屏障，阻止病 原菌和病毒的侵染，从而提高作物的抗病性，减少化学农药的使用量， 降低成本，减少环境污染，生产出绿色烟叶；还可以促进作物生长， 增加作物产量，本发明的菌肥能产生多种烟草生长促进物质，烟株生 长健壮，烟草产量、产值和均价可分别提高15%—30%、 20%—35% 和5%—10%。本发明的菌肥既能防治烟草病害又能够解磷，具有很
9好的社会价值和经济价值。
菌种保藏倍息
本发明的菌种绿针假单胞菌XQ902 (尸^wt/omo"os c/w/orap/^. XQ902 )保藏在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)。保藏日期是2008年01月07日。菌种的保藏号是 绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No. 2324。
具体实施例方式
下面描述本发明的抗病解磷菌菌种绿针假单胞菌XQ902的筛选。
1、 初筛
(1) 培养基葡萄糖5 — 10g、 NaC10.2—0.5g、 KC10.2—0.5g、 MgS04 7H20 0.2 —0.5g、 (NH4)2 S04 0.2 — 0.5g、 FeS04'7H20 0.02-0.05g、 MnS04 H20 0.02-0.05g、 Ca3(P03 )4 2.0-5.0g、蒸馏;R 1000ml、 pH7.0 7.5。
(2) 筛选方法
采用平板稀释分离法，选出生长速度快、水解透明圈大的菌落， 经划线分离纯化后，转解斜面保藏。
2、 拮抗实验
(1)培养基解磷菌培养基葡萄糖5 — 10g、 NaC10.2—0.5g、 KC1 0.2—0.5g、 MgS04 '7H20 0.2—0.5g、 (,)2 S04 0.2—0.5g、 FeS04 7H2O0.02-0.05g、 MnS04 H20 0.02-0.05g、 Ca3(P03 )4 2.0-5.0g、蒸 馏水lOOOrnl、 pH7.0 7.5。
原真菌用PDA培养基马铃薯100-200 g，葡萄糖10-20 g,琼脂 15-25 g，蒸馏水1 000 ml 。
10病原细菌用牛肉汁培养基牛肉浸膏1.0-3.0g，蛋白胨2.0-5.0g， 酵母膏1.0-3.0g，葡萄糖5.0-10.0g，琼脂15.0-25.0g，蒸馏水1 OOOml。
(2)实验方法对峙平板法测定抑菌活性。分别将各种病原菌 的菌苔或孢子用0.85%的灭菌生理盐水制成菌悬液，每个平板加入 0.2 ml，涂匀，30'C培养，24h后，用直径1 cm的滤纸片沾取摇瓶 培养的解磷菌菌株，进行接种；或病原细菌和待测的解磷菌菌株同时 接种。病原菌和待测菌株接种后，3(TC培养48h，观察有无抑菌圈， 并测量抑菌圈的直径。 3、盆栽试验
选在平板抑菌试验中对烟草病原菌有明显抗性的解磷菌对应于炭 疽病、猝倒病、黑胫病、根黑腐病，病原细菌青枯病、野火病病原菌 为指示病原菌，将待测菌的发酵液接种在盆栽烟株上或蘸根处理，然 后接种病原菌，置于适于发病的条件下使其感病，根据是否感病或感 病轻重而选出有效拮抗菌，并对植株感病情况进行分级，计算病情指 数、防治效果、叶发病率及出苗率。根据解磷菌的抗病效果选择高效 菌株，这里所述的高效菌株即为本发明的绿针假单胞菌XQ902,该 菌的属名是绿针假单胞菌，其拉丁文学学名是P化^fo附o"w
下面描述与本发明有关的其它技术问题。本发明的烟草高效抗病
解磷菌(绿针假单胞菌)菌肥可有多种使用方法，简单介绍如下
1、 拌种将浸泡、消毒后的烟草种子冲洗干净后，加入适量的 菌肥进行拌种。
2、 漂浮育苗每1000kg营养液加入l一2kg菌肥，充分搅拌均匀后用于漂浮育苗。
3、 营养钵育苗
营养土按常规方法配制后，装入营养钵中达2/3处，每10平方 米均匀撒施1—2公斤菌肥，直接播种覆土。
4、 用作基肥
移栽前每公顷沟(穴)内施入菌肥20—30kg，按常规施用N肥 肥的使用量比常规用量减少20% — 30% 。 本申请人进行了应用试验，情况如下-
1、实验地基本情况
在湖北兴山县进行，土壤类型为粘土。 土壤理化性状见表l
表l实验地土壤基本理化性状
土壤类型PH有机质g/kg碱解氮mg/kg速效磷mg/kg速效钾mg/kg
粘土5.622.61125.3028.07252.5
2、 实验处理
试验田应安排在历年来发病的地块,自然发病，具有代表性。每 个处理试验小区面积4亩，采用随机区组排列，每个处理设置3个重 复。所有试验小区的条件(如土壤、灌溉、肥料、移栽期、生育期和 行株距等田间管理措施以及坡向、光照等因素) 一致，且符合当地科 学的农业实践。
移栽前每公顷沟(穴)内施入菌肥20kg，按常规施用N肥和K 肥，P肥的使用量比常规用量减少200/^—30X。
3、 试验结果调査与数据分析
(1)病情调査每处理根据烟田实际情况划分4个调査小区， 每小区采用5点取样方法，每点固定调查20株，记录调查总株数及
12各级病株数。三次调查时间分别为发病初期、发病高峰期间和收获期。 调查应在晴日午后进行。按国家标准进行病害等级调査。
(2)经济性状调査各小区挂牌采烤，烟叶分级按国家40级标
准分别分级、称重计产。考核指标产量、产值、均价、上等烟比例、 中上等烟比例。
4、实验结果如表2、 3、 4、 5所示
表2、对几种烟草主要病害的防效
黑胫病赤星病青枯病病情指数防效病情指数防效病情指数防效
施本发明菌肥260.33655.680.565.00
对照1.581
表3、不同生育期烟叶含磷量测定结果
团棵期旺长期成熟期
施本发明菌肥1.0670.9120.571
对照1.0110.8200.548
比对照提高5.5411.224.20
表4、烤后烟叶化学成分分析结果
处理等级总糖(％)还原糖 (%)烟碱 (%)总氣 (%)总糖/ 烟碱总氮/烟 碱
本发明的菌肥CF324. 0322. 022. 532. 239. 140. 85
对照CF323.0621.012.852. 455.恥0. 65
表5、》因叶经济性状调查结果
上等烟比例 (%)中上等烟 比例(％)产量(kg)均价 (元/kg)产值(元/亩)
施本发明菌肥30.192.917591575
对照26.583.61528.251255
比对照提高13.5811.1215.13925,50
从上述表格中看出，本发明的菌肥能够在植物根际迅速繁殖，形 成根际微生物屏障，阻止病原菌和病毒的侵染，从而提高作物的抗病
13性，减少化学农药的使用量，降低成本，减少环境污染，生产出绿色 烟叶；还可以促进作物生长，增加作物产量，本发明的菌肥能产生多
种烟草生长促进物质，烟株生长健壮，烟草产量、产值和均价可分别
提高15%—30%、 20%—35%和5%—10%。本发明的菌肥既能防治烟 草病害又能够解磷，具有很好的社会价值和经济价值。 本发明的菌肥的产品标准如下
(1) 外观粉状、湿润松散、细度80目
(2) 有效活菌数》2亿/g、杂菌数《15%
(3) 水份(105'C烘干2小时)，水分《20% 30%
(4) 有机质(C计)》20%
(5) pH 6.0 7.5
(6) 有效期6个月
权利要求
1、一种烟草用高效抗病解磷菌肥，包括吸附剂和菌悬液，其特征在于菌悬液中含有绿针假单胞菌XQ902(Pseudomonas choloraphis.XQ902)，即绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No.2324。
2、 根据权利要求1所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特 征在于所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。
3、 根据权利要求2所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特 征在于所述的吸附剂为草炭，草炭的含水量为10—20%，粉碎至60 —80目。
4、 根据权利要求1所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特 征在于所述的高效抗病解磷菌肥中，每400—600g吸附剂中加入 100ml菌悬液。
5、 根据权利要求1所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特 征在于所述的菌悬液的制备方法为(1) 选取菌种绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No. 2324;(2) 斜面菌种培养，培养方法26—3(TC培养2—3d;(3) 摇瓶种子培养，培养方法500ml三角瓶装培养基100ml， 12rC灭菌30—40min，冷却后接入1环斜面菌种，28—3(TC振荡培 养，摇床转速190—210rpm，培养时间26—30h;(4) 发酵，培养方法400L发酵罐装培养基280L， 121〔灭菌 30—40min，冷却后接入28L种子培养液，28—3(TC振荡培养，搅拌 转速250—270rpm，通风比1: (0.5—0.8)，培养时间48—50h;所 得即为菌悬液。
6、 根据权利要求5所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特征在于所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是葡萄糖6—15g、 甘油80—120ml、酪蛋白3—8g、NaHC03 0.5—1.5g、MgS04 7H20 0.5 一1.5g、 K2HP04 2—3g、十二烷基硫酸钠(SDS) 0.4—1 g、蒸馏 水900—1200ml;所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是玉 米水解液100 — 150ml，蔗糖10—40g，蚕蛹粉2-6g，卵磷脂0.1-0.5g， KH2P04 l國5g， CaC03 l曙5g， MgS04 0.1-0.5g，水1000ml，另含有 FeSO4.7H2O3-10PPM, MnS04.H20 3-10PPM，复合维生素3-10PPM。
7、 一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，其特征在于所述的生产方法包括以下步骤 [1]菌悬液的制备(1) 选取菌种绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No. 2324;(2) 斜面菌种培养，培养方法26—3(TC培养2—3d;(3) 摇瓶种子培养，培养方法500ml三角瓶装培养基100ml， 121"C灭菌30—40min，冷却后接入1环斜面菌种，28—3(TC振荡培 养，摇床转速190—210rpm,培养时间26—30h;(4) 发酵，培养方法400L发酵罐装培养基280L， 121。C灭菌 30—40min，冷却后接入28L种子培养液，28—3(TC振荡培养，搅拌 转速250—270rpm，通风比1: (0.5—0.8)，培养时间48—50h;所 得即为菌悬液；[2]吸附剂灭菌吸附剂含水量10% 20%，粉碎至60 80目，1 1.5kg装/袋， 布袋或塑料袋，0.1MPa高压灭菌2 3小时，取出冷却备用； [3]吸附剂接种和培养将吸附剂置于洁净塑料布上，每400—600g吸附剂拌入100ml 菌悬液，搅拌均匀，使含水量达"手握成团、触之即散"程度，将己接种菌悬液的吸附剂置于20 3(TC培养2 7天，使细菌进一步繁殖， 达到每克菌肥中活菌数不低于1亿，包装后即为高效抗病解磷菌肥产叫o
8、 根据权利要求7所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产 方法，其特征在于所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是葡萄糖6—15g、甘 油80—120ml、酪蛋白3—8g、 NaHC03 0.5—1.5g、 MgS04 7H20 0.5 一1.5g、 K2HP04 2—3g、十二烷基硫酸钠(SDS) 0.4—1 g、蒸馏 水900—1200ml;所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是玉米水解液100—150ml，蔗糖10—40g，蚕蛹粉2-6g，卵磷脂0.1-0.5g， KH2P04 l-5g， CaC03 l誦5g， MgS04 0.1-0.5g，水1000ml，另含有 FeSO4.7H2O3-10PPM， MnS04.H20 3-10PPM，复合维生素3-10PPM。
9、 根据权利要求7所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，其特征在于所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。
10、 根据权利要求9所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产 方法，其特征在于所述的吸附剂为草炭。
全文摘要
本发明公开了一种烟草用高效抗病解磷菌肥及其生产方法，涉及一种菌肥，同时还涉及该菌肥的生产方法。烟草用高效抗病解磷菌肥包括吸附剂和菌悬液，菌悬液中含有绿针假单胞菌XQ902(Pseudomonas choloraphis.XQ902)，吸附剂为草炭、活性炭、蛭石或它们中的混合物。高效抗病解磷菌肥中，每400-600g吸附剂中加入100ml菌悬液。菌肥的生产方法，按以下步骤进行[1]菌悬液的制备；[2]吸附剂灭菌；[3]吸附剂接种和培养。本发明的菌肥可增加上等烟率，使烟叶的化学成分协调，杂气和刺激性减少。能促进烟草根系发育，可有效防治烟草病菌的侵染；能够提高土壤磷的利用率。
文档编号C12N1/20GK101497541SQ20081004683
公开日2009年8月5日 申请日期2008年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者毕庆文, 健 汪, 王海明, 王豹祥, 邱立友, 敏 韩, 根 黎 申请人:武汉烟草(集团)有限公司