专利名称：一种双色荧光报告载体的构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和抗病毒研究领域，可以高通量地筛选出抗病毒的 siRNA药物。更具体地讲，本发明涉及一种双色荧光报告载体，同时涉及到双色荧 光报告载体的构建方法，以及该发明在高通量且精确评估siRNA效率中的应用。
背景技术：
RNA干扰(RNAi)是一种从酵母到人都保守的分子机制双链的小干扰RNA(siRNA) 中的一条链被整合到RISC (RNA—Induced Silencing Complex)中去> 当此条链找 到与之配对的耙标mRNA时，革E标mRNA随之将被RISC序列特异性的切割然后降解掉 (Fire A, Xu SQ, Montgomery MK， Kostas SA, Driver SE， Mello CC 1998 Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. jVo/we 391: 806-811.)。现在RNAi被越来越多的应用到在单个基因或者是基因组水平来研究 基因的功能(Hannon GJ, Rossi JJ 2004 Unlocking the potential of the human genome wkh RNA interference. Atowe 431: 371-378.; Dorsett Y, Tuschl T 2004 siRNAs: applications in functional genomics and potential therapeutics. Atowre Wev. Z)/ w, 3: 318-329.)，同时对于那些基于基因沉默的治疗方法而言RNAi更代表着一种有应用 价值的新手段(Dorsett Y, Tuschl T 2004 siRNAs: applications in functional genomics and potential therapeutics. iVa/匿Drag Zfccov. 3: 318-329.; Shuey DJ, McCallus DE, Giordano T 2002 RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention. Z)rag ￡fccov. 7b— 7: 1040-1046.; Sioud M 2004 Therapeutic siRNAs. 7>e *尸/ 簡腳/.5W. 25: 22-8.)。 siRNA的应用所面临的一个最主要的挑战就是设计出有效的siRNA来沉默基 因的表达。平均而言，被挑选出来的siRNA中，仅有五分之一能够引起有效的基因沉默(Kumar R, Conklin DS, Mittal V 2003 High-Throughput Selection of Effective RNAi Probes for Gene Silencing. G細附e紐13: 2333-2340.; McManus MT, Shaqp PA 2002 Gene silencing in mammals by siRNAs. iVaf. i ev. 3: 737-747,; Kapadia SB,Brideau-Andersen A, Chisari FV 2003 Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs. Prac. A^/. Jew/. 5W. 100: 2014—2018.)。 siRNA不能引起有 效的基因沉默的可能原因可以归结为siRNA在体内的不稳定性；siRNA同RISC的组 分不可相互作用性；或者由于靶标mRNA的本地二级结构的束缚所导致的靶标的不可 进入性等等。最近由于深刻理解了RNAi介导的基因沉默的生化机制和大规模地分析 耙向同一个基因的各不相同的siRNA，很多关键地影响siRNA效果的规则都被揭示出 来。这些规则明显优化了设计出合理s i RNA的方案(Mittal V 2004 Improving the efficiency of RNA interference in mammals. iVa/. i ev. Ge赠.5: 355-365.; Reynolds A, Leake D， Boese Q, Scaringe S， Marshall WS, Khvorova, A 2004 Rational siRNA design for RNA interference.淑5/她c力wo/. 22: 326-330.; Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K 2004 Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. M/c/e/c J"V/y 32: 936-948.; Khvorova A, Reynolds A， Jayasena SD 2003 Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias, Ce〃 115: 209-216.; Schwarz DS, Hutvagner G" Du T, Xu Z， Aronin N, Zamore PD 2003 Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Ce// 115: 199-208.; Holen T, Amarzguioui M, Wiiger MT, Babaie E, Prydz H 2002 Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. iVwc/e/c爿c油及e兄30: 1757-1766.; Ameres SL, Martinez J, Schroeder R 2007 Molecular basis for target RNA recognition and cleavage by human RISC. Ce〃 130: 101-112.)。即使这种经过改进之后的方案增加了设计出有 效的siRNA的机率，但是它既不能确保单个预测的siRNA的有效性更不能确保所预测 出的就是现实中最有效的siRNA。因此，现在人们花费大量的人力物力投入到从一大 群siRNA中筛选出有效siRNA序列这一工作中去。(Vickers TA, Koo S， Bennett C F， Crooke ST, Dean NM, Baker BF 2003 Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. 乂 278: 7108-7118.; Kumar R, Conklin DS, Mittal V 2003 High-Throughput Selection of Effective RNAi Probes for Gene Silencing. Gewowe 13: 2333-2340,; Kasim V, TairaK, Miyagishi M 2006 Screening of siRNA target sequences by using fragmentized DNA.Med 8: 782-791.; Hung CF, Lu KC, Cheng TL, Wu RH， Huang LY, Teng CF, Chang WT 2006 A novel siRNA validation system for functional screening and identification of effective RNAi probes in mammalian cells. 5io/7/7少s. Cowhw". 346: 707-720.; Echeverril CJ, Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. jV抓Gewe/. 7: 373-384.)。如果是出于治疗的目的，那么对一个siRNA探针的效率进行定量变得特别重要。 对一大群si题A进行精确的定量可以筛选出最有效的siRNA探针以进行动物实验和 临床实验。许多定量分析的方法己经被发展出来以报告siRNA的效率，这些方法大 体可以归结为两类第一类是利用细胞群体破碎后不同荧光素酶表达水平来量化 siRNA的沉默效果(Vickers TA, Koo S, Bennett C F, Crooke ST, Dean NM, Baker BF 2003 Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. 細/. C7 缀278: 7108-7118.; Smart N， Scambler PJ, Riley PR 2005 A rapid and sensitive assay for quantification of siRNA efficiency and specificity. Pracet/. 7: 1-7.)。
例如Du等人设计了一种名为siQuant的质粒，此种质粒将作为siRNA靶标的寡核苷酸序列通过Bgl II和Apa I双酶切克隆到 萤火虫荧光素酶之后，使得被克隆的序列紧随萤火虫荧光素酶的起始密码子，这样 有活性的siRNA就会下调萤火虫荧光素酶的表达。为了评估siRNA的抑制效率， Du等人借助Promega公司的双荧光素酶报告基因系统进行分析。在实验时，将 siRNA同siQuant质粒和另外一个能表达海肾荧光素酶的质粒这三者一起共转染入 细胞中。此系统中， 一个报告基因(萤火虫荧光素酶)活力的改变，直接相关于siRNA 的抑制活性，而第二个报告基因(海肾荧光素酶)的组成性活力则提供了内参，使 实验值可以规一化，这样也就达到了定量的目的。在结果检测时，此方法需要破解 细胞并在细胞裂解液中加入萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶各自对应的荧光素底 物，Du等人随后使用荧光素酶检测仪进行检测得到了较好的实验结果(Du Q, Thonberg H, Zhang HY, Wahlestedt C, Liang ZC 2004 Validating siRNA using a reporter made from synthetic DNA oligonucleotides, 5/ochem. 5z'op/ ys. Commtm. 325:243-249.)。第二类定量分析si脂A效率的方法就是用不同的质粒表达两个荧光蛋白， 一个荧光蛋白基因作为内参放在一个载体上，另一荧光蛋白基因放在另一个载体被靶标 所融合，它们同siRNA/shRNA(小发夹RNA)共转染之后，利用仪器在不破碎细胞的 前提下测出两种荧光的强度以其比值来表征siRNA的活性(Hirano T, Yamauchi N, Sato F, Soh T, Hattori MA 2004 Evaluation of RNA interference in developing porcine granulosa cells using fluorescence reporter genes. J", i eprat/ Z)ev. 50: 599-603.; Sipa K， Sochacka E， Kazmierczak陽Baranska J, Maszewska M, Janicka M， Nowak G, Nawrot B 2007 Effect of base modifications on structure, thermodynamic stability, and gene silencing activity of short interfering. T^A^. 13:30卜16.)。例如Kumar等人设计出了一 种RNAi微阵列(microarray)的方法以达到高通量地筛选出有效的siRNA/shRNA。 为了能够达到在基因芯片上进行高通量筛选的目的，作者们构建了一个能表达绿色 荧光蛋白的质粒，在此质粒中EGFP和靶标基因前后融合在一起，与此同时还利用 了一个能表达红色荧光蛋白的质粒pDsRed2—Nl作为内参以规一化试验结果达到 定量RNAi效率的目的。在实验中，此两种质粒与各自不同的siRNA/shRNA以液体 的形式混匀在一起，随后将得到的各自不同的混和液分装于384孔板中。利用阵列 仪(armyer)将此液体印刻到一种特殊的载玻片表面。为了达到转染的目的，转染 溶液被吸入到一个特殊的孔槽中，随后将上面载玻片被印刻的那一面向下盖在这个 孔槽上。45分钟后，移去装有转染溶液的孔槽，将处理过的载玻片面朝上放入一个 特殊的培养瓶中与一定数目的细胞进行共转染。24小时后，将生长在载玻片上的细 胞固定包装好，用激光扫描仪扫描载玻片，随后用相应的软件分析获得绿色荧光蛋 白和红色荧光蛋白各自的荧光强度。这样得到载玻片上每个点的绿/红荧光强度之 后，利用绿色荧光强度除以红色荧光强度的数值进行规一化之后，就能定量地计算 出各个样品中RNAi的效率(Kumar R， Conklin DS, Mittal V 2003 High-Throughput Selection of Effective RNAi Probes for Gene Silencing. Ge"cw/e 13: 2333-2340.)。上面的两类定量分析RNAi效率的方法各有优缺点。第一类方法优点是比较简 便，容易实施，第二类方法优点是能进行高通量筛选。但是这两大方法都存在一个 主要的缺点就是在进行定量的时候，不能够精确地放映出siRNA的抑制效率。例 如这两大方法需要将三种物质(两个荧光载体和siRNA)共转染进细胞，所以它们 都避免不了进行共转染所导致的两个荧光报告基因间转染效率的差异这一共同挑战(Echeverril CJ， Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Ato. Gen" 7: 373-384.)。当这些荧光物质的基因被转染进细胞后 会出现如下情况有的细胞无荧光信号；有的细胞只能检测到其中一种荧光信号； 有的则两种荧光信号兼而有之。因此上述两类方法中用整个细胞群而不是挑选出符 合要求的细胞进行定量分析的方法显然是不精确的。而且在第一类方法中细胞不是 在生理条件下实施检测的，所以检测细胞必须被裂解掉，这无疑也影响到定量的精 确性。在药物治疗和功能基因组学方面，我们尤其需要建立一个精确的定量系统以 在单体活细胞水平高通量地评估出siRNA/shRNA的效率。发明内容本发明的目的是在于提供了一种双色荧光报告载体，该载体pEGFP/DsRed及其 衍牛载体pEGFP/DsRed-HBx是在同一个载体上利用两套不同的顺式作用元件同时独 立地能在真核细胞中表达出绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体。该载体明显克服 了先前将两个荧光报告基因分别放在两个不同的载体中进行共转染所导致的两个 荧光报告基因间转染效率的差异这一共同难题，此发明为在单体活细胞水平精确定 量siRNA的效率奠定了坚实的物质基础。本发明的另一个目的是在于提供了一种双色荧光报告载体pEGFP/DsRed及其衍 生质粒pEGFP/DsRed-HBx的构建方法，方法简便易行，试验操作方便。本发明的再一个目的是在于提供了双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx在高通 量筛选且精确定量siRNA效率中的应用。基于本发明中的双色荧光报告载体 pEGFP/DsRed-HBx而提出的定量荧光流式细胞术的方法大大提升了评估siRNA效率 的精确性。定量荧光流式细胞术是一种灵敏高效且简单易行的方法，数据可以被连 续的收集并且细胞能够根据需要马上被分成多个亚区(subp叩ulation)以进行分 析；同时其每次可以测量大量的细胞以提供进行统计学分析的需要。更为重要的是， 此种方法可以在单体活细胞水平进行检测，而且计算出的结果具有高度的可信性和 可重复性。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施本发明所述的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed及其衍生载体pEGFP/DsRed-HBx是可在同一个载体上分别表达出绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的真核表达载体。其 首次由发明人提出并构建成功。本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和 pEGFP/DsRed-HBx中的红色荧光蛋白基因(DsRed-Monomer)克隆自BD Biosciences Clontech公司生产的pDsRed-Monomer-Nl质粒，其由CMV立即早期启动子(PcMvn3) 来表达，绿色荧光蛋白基因(EGFP)克隆自BD Biosciences Clontech公司生产的 pEGFP-Nl质粒，其由SV40早期启动子(PSV4()e)来表达。乙肝病毒(HBV)的X蛋 白(HBx)基因作为靶标经过Not 1和Xba I酶切被融合到双色荧光报告载体 pEGFP/DsRed中的红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer的终止密码子之后，因此HBx 就成为了 DsRed-Monomer的3' UTR而不被翻译出来。此衍生质粒在本发明中被命 名为pEGFP/DsRed-冊x。这样此衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx就可以仅仅表达出完整 的红色荧光蛋白而避免了红色荧光蛋白遭融合后的影响。在本发明的这个双色荧光 报告系统pEGFP/DsRed-HBx中，EGFP发出的绿色荧光被用来筛选出那些被转染进了 双色荧光报告载体的细胞，同时其发出的绿色荧光强度也能反映出被转染的双色荧 光报告载体上类似基因的表达水平；另一方面由于靶定冊x的siRNA的干扰作用导 致了 DsRed-Monomer红色荧光蛋白表达水平发生了改变，也就是导致了红色荧光强 度发生了变化。红色荧光强度的这种变化就关联于siRNA的抑制效果。将红/绿荧 光蛋白基因设计在同一个载体中且用不同的顺式作用元件进行表达有着明显的好 处。这种方法明显克服了先前将两个荧光报告基因分别放在两个不同的载体中进行 共转染所导致的两个荧光报告基因间转染效率的差异这一共同难题(Echeverril CJ， Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. AW.7: 373-384.)。本发明中的pEGFP/DsRed-HBx双色荧光报告系统确保了同 样拷贝的EGFP和DsRed-Monomer基因被转染进同一个单体活细胞中。因此EGFP的 表达应当与DsRed-Monomer的表达成线形关系，并且此相关性在细胞状态一致的前 提下不会受转染效率变化之影响。本发明中的pEGFP/DsRed-HBx双色荧光报告载体上红/绿荧光蛋白间的相关性， 依据流式细胞术通过测量单个细胞内发射的红/绿荧光强度最后计算出目的细胞群 的平均红/绿荧光强度来进行确定。基于各自对应的平均荧光强度(MFI)，在多次 验中申请人都模拟出了平均红/绿荧光强度间关联度很好的直线。此结果证明了在同一批次的实验中，双色荧光报告系统pEGFP/DsRed-HBx中的红绿荧光蛋白间确实 存在着不受转染效率变化影响的直线关系，具体直线关系请见图11 (C)，图13(A)、 (B)、 (C)。这条直线申请人称之为校准曲线。当能引起干扰作用的siRNA与本发 明中的pEGFP/DsRed-HBx —起被共转染进细胞时，目的细胞群的平均红色荧光强度 将会发生明显的改变；与此同时其对应的平均绿色荧光强度(MFI of EGFP)的整 体水平在干扰发生前后不会改变(见图12)。因此目的细胞群的平均绿色荧光强度 可以作为内参以衡量siRNA起作用之后平均红色荧光强度的变化。基于上面的校准 曲线，通过平均绿色荧光强度这一内参，可以计算出siRNA在还没有起作用时的理 论平均红色荧光强度(tMFI of DsRed-Monomer)。当siRNA发挥生物学功能之后， 利用流式细胞仪测出目的细胞群此时的平均红色荧光强度(MFI of DsRed-Monomer)。那么siRNA的抑制效率就可以用公式表示为siRNA抑制效率=(藩I 一 MFI)DsRed—Monomer / tMF工DsRed X 100%。基于此，申请人将本发明中的pEGFP/DsRed-HBx同si脂A共转染进Linx细胞系(其来源见Tong WP, Zhou Y， Wang X， Yang F， Wu KL， Wu J， Zhang Y 2008 An accurate quantitative method for screening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcript in single living cells. Biochem Biophys Res Com腿n. 367:866-73。)中去，利 用定量流式细胞术快速高效的筛选并计算出了有效的siRNA的抑制效率(见图13)。 此种方法计算出的结果同在荧光显微镜下检测的实验结果非常一致(见图12)。本 发明提供了一种在单体活细胞水平精确快速定量siRNA效率的方法。构建一种双色荧光报告载体pEGFP/DsRed及其衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx的具 体试验技术可以参考Joe Sambrook, David Russell等编写的Molecular Cloning: A Laboratry Manual, Cold Spring Harbor Lab(CSHL) Press, 2001。本发明中 转化大肠杆菌DH5 a (Gibco BRL公司产品)和ER2925 (New England Biolabs公司产 品)采取的都是氯化钙转化法，所用限制性内切核酸酶购买自New England Biolabs 公司、Fermentas或者是Takara公司，并且对所有以PCR扩增方式做出的克隆都进 行了测序。本发明通过以质粒pEGFP-Nl和pDsRed-Monomer-Nl (均购买自BD Biosciences Clontech公司)为基本平台，构建双色荧光报告载体所采取的设计10思路和技术措施如下1、 衍生质粒pEGFP-N卜Ampicillin的构建。将带有启动子和转录终止信号的氨 苄基因插入到pEGFP-Nl载体中，由此衍生出的质粒被命名为pEGFP-Nl-Ampicillin(见图1)。带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列是以pUC18 (Takara公 司产品)为模板利用KOD DNA聚合酶(TOYOBO公司产品)扩增出pUC18中从1566 到 2617 的 一 段 DNA 序歹U 。 所用 5'引物 Pl 为 CCTAGATCTTAAGAAATTAAAAATGAAGTTT (下划线为引入的Bgl II酶切位 点)；3'弓I物P2为TAATAATGGTTTCACGTAGTGCAGGTGGC (下划线为引 入的DraIII酶切位点)。质粒pEGFP-Nl被Afl II单酶切后通过KOD DNA聚合酶 补成平末端。随后用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司产品)纯化被补成平末端的 pEGFP-Nl质粒。为了提高克隆成功的概率，减少载体自连，接着对被补成平末端的 pEGFP-Nl质粒进行了去磷酸化操作，同时对上述扩增出带有启动子和转录终止信号 的氨苄抗性基因序列进行磷酸化操作。然后用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司产品)分 别纯化已经去磷酸化的和磷酸化的上述体系。将纯化后得到的被磷酸化的1086bp 长度的带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列(KOD DNA聚合酶的产物本 身就是平末端)与被纯化后的平滑化的被去磷酸化的pEGFP-Nl进行连接反应。连接 后的产物转化完大肠杆菌E.coli DH5a感受态细胞之后，直接将被转化的细菌放入 含60 |xg/ml氨苄青霉素和50 (xg/ml卡那霉素的LB液体培养基中于37 °C摇床中过 夜培养。24小时后收集生长起来的细菌，用碱法抽提出质粒，将所得质粒再次转化 DH5a感受态细胞，将被转化细胞铺板于含60 (ag/ml氨苄青霉素和50 pg/ml卡那霉 素的双抗平板上，于37。C培养箱中培养过夜。挑选单克隆，酶切证明有插入；测 序结果表明了带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列的插入方向。故得到 了具有氨苄抗性的质粒。此衍生质粒被命名为pEGFP-Nl-Ampicillin，并转化大肠 杆菌E.coli DH5 a感受态细胞，用于基因的增殖和保藏。2、 衍生质粒pMD18-EGFP的构建。首先，利用PCR扩增出在EGFP基因5'端含 有 Stu I-Sal I 酶切位点的中间产物。5'弓|物 P3 为 AGGCCTGTCGACCGCCACCATG(下划标记为引入的Stu I禾Q S al I酶切位点)； 3'引物P4为TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。然后此中间产物被连接到pMD18-T vector(Takara公司产品)。此克隆命名为pMD18-EGFP,克隆示意过程见 图2。3、 衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建。利用PCR扩增出pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech公司产品)中从3424到3860间的一段序列(此序列为单纯 疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号——HSV TK poly A)，使得该序列的两边分别含 有 Pst I 和 Hind III 酶切位点。所用 5' 引物 P5 : TTGCTGCAGGCGGGACTCTGGGGT(下划标记为引入的Pst I酶切位点)；3，引 物P6: GCCAAGCTTAGGGCCTGCCGC (下划线为引入的Hind III酶切位点； 虚线为模板序列中本身含有的Dra II酶切位点)。此PCR产物经PstI和Hind III双酶切后连接到上述衍生质粒pMD18-EGFP相应位点。由此生成的质粒命名为 pMD18-EGFP-polyA，克隆示意过程见图3。4、 衍生质粒pEGFP/EGFP的构建。用Dra II (Eco0109 I)和Stu I双酶切上 述衍生质粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小为1， 188bp的片断(此片断 包含EGFP和HSV TK poly A的DNA序列)。将此片段亚克隆进上述已经制备好的衍 生质粒pEGFP-Nl-Ampici 11 in相应位置处。由此衍生出的质粒被命名为pEGFP/EGFP， 克隆示意过程见图4。5、 目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建。用Nhe I和Not I切下质粒 pDsRed—Monomer—Nl上从多克隆位点至廿DsRed—Monomer基因(BD Biosciences Clontech公司产品)末尾处的一段775bp的片断。将此片段亚克隆进上述已经构建 好的衍生质粒pEGFP/EGFP的相应位点。由此得到所述的双色荧光报告载体 pEGFP/DsRed，克隆示意过程见图5。用此载体转化大肠杆菌E. coli DH5 a感受态 细胞，用于其增殖和保藏。6、 基于目的质粒pEGFP/DsRed， 一种衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx的克隆示意过 程见图6。衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx的制备方法如下a、 HBx基因片断的PCR扩增制备含有HBx基因的质粒(来源见Wu KL, Zhang X, Zhang J, Yang Y, Mu YX, Liu M， U L， Li Y, Zhu Y， Wu 了 2005 Inhibition of Hepatitis B virus geneexpressionbysingleanddualsmallinterfering RNAtreatment. /Pes. 112:100-7.)为模板，利用PCR扩增出在HBx基因两边分别含有Not I禾B Xba I酶切位点的片断，所用5'引物P7: ATAGCGGCCGCATGGCTGCTGCTAGGCTGTGCT (下划线为引入的Not I酶切 位点)；3'引物P8: ATATCTAGAGGCAGAGGTGAAAAAG (下划线为引入的 Xba I酶切位点)。b、 可被Xba I酶切的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的获得 因为本发明中的载体pEGFP/DsRed在大肠杆菌E.coli DH5 a内增殖时所抽提出的pEGFP/DsRed质粒上的Xba I酶切位点被甲基化了 ，这样使得pEGFP/DsRed不 可被Xba I消化。为了获得可被Xba I消化的pEGFP/DsRed, pEGFP/DsRed质粒被 转化到了 ER2925菌株中，然后从ER2925菌株中抽提出pEGFP/DsRed质粒，这样 就避免了甲基化对Xba I酶切活性的影响。c、 pEGFP/DsRed-HBx克隆的获得用Not I和Xba I分别双酶切HBx基因的PCR产物和从ER2925菌株中抽提出 来的pEGFP/DsRed质粒，将HBx基因产物连接到pEGFP/DsRed的相应位置，转化 ER2925菌株。测序结果证实了克隆的准确性。所得克隆就是pEGFP/DsRed-HBx。本发明提供了双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的全部DNA序列为SEQ ID NO: 1 所不的核苷酸序列。这些序列是基于亚克隆操作过程中和克隆载体的母本 pEGFP-Nl上的核苷酸序列没有突变这一假设而提出的。本发明中的pEGFP/DsRed 只被我们部分测序，其中多克隆位点和DsRed-Monomer基因是亚克隆自 pDsRed-Monomer-Nl; P-内酰胺酶(氨苄抗性基因)部分测序；绿色荧光蛋白基因 EGFP和单纯疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号(HSVTKpolyA)完全测序。本发明提供了双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx的图 谱，分别见图5和图6。 pEGFP/DsRed全长5686bp，具体位置信息描述如下 CMV立即早期启动子(P v,e): 1—589 多克隆位点(MCS): 591-671 红色荧光蛋白基因DsRed-MonomerKozak保守的翻译起始位点672-682起始密码子(ATG): 679-681;终止密码子1354-1356 SV40早期mRNA聚腺苷酸化信号聚腺苷酸化信号1510-1515 & 1539-1544; niRNA3'末端1548 & 1560 0-内酰胺酶基因(氨苄抗性基因)e-内酰胺酶起始密码子(ATG): 1755-1757;终止密码子2615-2617e-内酰胺酶启动子1624-1754; -35区:1685-1690; -10区:1708-1713e-内酰胺酶转录终止信号2618-2675e-内酰胺酶转录本核糖体结合位点1743-1747 ，fl单链DNA origin: 2699-3154 .SV40早期启动子(Psv他)3328-3596 SV40 Origin: 3495-3630 ，绿色荧光蛋白基因EGFPKozak保守的翻译起始位点3638-3648 起始密码子(ATG): 3645-3647;终止密码子4362-4364 PCR扩增时发生了突变使得酪氨酸-183突变为天冬酰胺(^+ A): 4191 单纯疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号(HSV TK poly A) 聚腺苷酸化信号4612-4617 & 4625-4630 pUC质粒复制的origin: 4961-5604一种双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx在高通量筛选且精确定量siRNA效率 中的应用。为了验证pEGFP/DsRed-HBx表达的红/绿荧光蛋白间的相关性，12个不 同浓度的pEGFP/DsRed-HBx分别同一个无关的siRNA (siNC，具体信息参见表1) 进行共转染Linx细胞。转染后48小时，用倒置荧光显微镜观察(见图10)。结果 表明在相同质量浓度下，本发明中的pEGFP/DsRed-HBx所表达出的红色荧光信号和 绿色荧光信号，其强度大致相等(见图10)。从图10的试验结果中我们可以观察到， 在不同的pEGFP/DsRed-HBx的质量下，当绿色荧光增强时，此时对应质量下样品的 红色荧光也必定同时增强。例如当样品的质量从100 ng上升到160 ng的时候，160ng 时的绿色荧光信号明显强于100ng时的绿色荧光信号；于此同时160ng时的红色荧 光信号也明显强于100ng时的红色荧光信号。而当所用pEGFP/DsRed-HBx的质量增 加而绿色荧光减弱时，对应样品的红色荧光也必定同时减弱。例如当样品的质量从400 ng上升到500 ng的时候，500 ng时的绿色荧光信号明显弱于400ng时的绿色 荧光信号；于此同时500 ng时的红色荧光信号也明显弱于400 ng时的红色荧光信 号。在同一个样品中，当绿光减弱时，红光必定也减弱；反之依然。图10结果可 以定性说明本发明中的pEGFP/DsRed-朋x载体所表达的红/绿荧光蛋白间存在着一 种直线关系，这就为后面的用绿色信号作为内参来精确定量红色荧光信号的变化打 下了坚实的基础。红/绿荧光信号间的相关性用激发波长为488 nm的流式细胞术进行分析，分析 结果见图11。从图11 (A)上，可以看到没有经过转染操作的细胞绝大部分都分布 在B3区，从图11 (B)中，可以看出那些转染了双色荧光报告载体和4nM的siNC 的细胞有相当一部份分布在Bl， B3和B4区。我们知道，流式细胞仪给出的结果 中，分布在B1区的是那些只发红光的细胞；分布在B2区的是那些既发红光又发绿 光的细胞；分布在B4区的是那些只发绿光的细胞。同时每个区的细胞数目以及各 自区域内细胞的平均绿色荧光强度数值(X-mean)和平均红色荧光强度数值 (Y-mean )流式细胞仪都能测出，具体参数见图11 (A)禾U (B)。因为流式细胞 仪的488 nm的激发波长更适用于EGFP被激发而不利于DsRed-Monomer的被激发， 所以在图11 (B)的B4区中，被转染的细胞仅仅检测到中等表达水平的EGFP而检 测不到红色信号是可以理解的；但是，在Bl区中存在着表达相当水平的红色信号 而没有检测到绿色信号则令人吃惊。此结果表明，位于图11 (B)的B4区中的这 些细胞EGFP的表达被部分抑制了。因为没有荧光信号的细胞以及那些仅仅只有红 色荧光而没有绿色荧光的细胞都被筛选出局，而那些能够发出作为内参的绿色荧光 的单体活细胞才被确定下来作为分析的对象以提高分析的精确性；所以Bl和B2区的细胞在随后的定量分析中不予考虑。红/绿荧光信号的相关性是基于各自对应的平均荧光强度(MFI)来计算的，其 数值分别对应于Y-mean和X-mean。而绿/红荧光信号的MFI又经由下面的两个公式计 算得来MF1 (EGFP) = [X-mean(B2) X N(B2) + X-mean(B4) X N(B4)/ [N(B2) + N(B4)—方程(1)MF1 (DsRed-Monomer) = lY-mean(B2) X N(B2) + Y-mean(B4) X N(B4)/ [N(B2) + N(B4)I-—方程(2)基于上面的公式我们可以计算出不同质粒浓度的pEGFP/DsRed-HBx同4 nM的 siNC共转染后各自对应的红/绿平均荧光强度(MFI)，这样依据不同浓度下的MFI， 我们可以用DsRed-Monomer的MFI对相应的EGFP的MFI来做图。由此我们拟合出了 一条相关性非常好的直线。Y (平均红色荧光强度)-0.519WX (平均绿色荧光强度) -19.31 ，请见图11 (C)。此结果证明了双色荧光报告载体中红/绿荧光蛋白间的表 达确实存在着一种内源性的直线关系。为了抑制乙肝病毒的表达，申请人向广州市锐博生物科技有限公司订购了10个 靶定HBx mRNA的siRNA和一个作为参照的无关siRNA (siNC)，并挑选出了其中5 个有效siRNA在单体活细胞水平来进行高通量和精确定量分析。具体信息如表l所示表l.本研究中耙定HBx的siRNA序列信息siRNA编号siRNA有义链序列5'—3'_si9 CCCGUCUGUGCCUUCUCAUdTdTsil2 GACCGUGUGCACUUCGCUUdTdTsil9-l GUGAACGCCCACCGAAUGUdTdTsi22 CGACCGACCUUGAGGCAUAdTdTsi2 5 GGGAGGAGAUUAGAUUAAAdTdTsiNC UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT为了方便高效地评估出这些siRNA的效率，基于流式细胞术我们提出了一种新 的评估方法。申请人选取5个siRNA (si9, sil2， sil9-l， si22,禾tlsi25)做浓度梯度实验。 250 ng的pEGFP/DsRed-HBx分别同浓度递减的siRNA禾口siNC (25 nM, 50 nM and 100 nM) —起共转染Linx细胞(来源见Tong WP, Zhou Y, Wang X， Yang F, Wu KL, Wu J, Zhang Y 2008 An accurate quantitative method for screening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcript in single living cells. Biochem Biophys Res Commim.367:866-73.)。细胞被吹撒上样到流式细胞仪器中进行测量。这种基于单体 活细胞的siRNA的抑制作用通过如下的方程(3)来计算抑制百分率-(tMFI-MFI)DsRed/tMFIDsRed X 100%。 tMFI表示的是理论MFI。—方程(3)为了计算出DsRed-Monomer的理论MFI (tMFI )， 一条对应的校准曲线根据 pEGFP/DsRed-HBx和不同浓度的siNC共转染时的结果通过方程(l)和方程(2)依据 上面所述的方法被拟合出来(见图13)。在共转染了报告质粒和有活性作用的siRNA 的细胞中，基于方程1我们可以计算出细胞中表达的EGFP的MFI，另一方面在此校 准曲线上与EGFP的MFI相对应处就有一个红色荧光蛋白的MFI，我们把此从校准曲 线上推导出来的理论上的红色荧光蛋白的MFI定义为tMFI。 tMFI表示的是当RNAi 没有发生时细胞中红色荧光蛋白的MFI。当RNAi发生后，利用方程(2)可以计算 出此时观测到的红色荧光蛋白的MFI 。那么siRNA的抑制效率就可以用 DsRed-Monomer的tMFI和MFI间的差值推导出来，也就是方程(3)所表示的意义。 基于此种定量方法，我们一次性地计算出了此5种siRNA分别在25 nM、 50 nM 和100 nM这三个不同的浓度下的抑制效率，快速高效地得到了15个样品的抑制结 果，见表2。表2.不同浓度下siRNA抑制效果表\ siRNA浓度 \(nM) siRNA名称 \1005025si983%83%84%sil286%88%88%sil9-l80%82%82%si2281%81%81%si2581%82%从表2中，可以看Hti所有挑选出来的siRNA在三种不同浓度下都取得了80X以上的抑制效率，而且每个siRNA的抑制效率在三种不同浓度时都几乎相同。这表明5 个siRNA在25nM的时候全都达到了饱和抑制。在25 nM、 50 nM和lOO nM这三个不 同的浓度下，很有意思的是，每个siRNA都产生出了高度一致的抑制效率sil2的抑 制效率在86-88%之间；si9在83-84。/。之间；si22都是81^; sil9-l和si25都在80-82。/。之间。具体siRNA的抑制效率请见图13。抑制效率高度一致性表明本发明的方法是 极其可靠的。综上所述本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx的主要优点特征总结如下1、 具有pUC质粒的复制子，是松弛型质粒。依据常规培养大肠杆菌和抽提质 粒的方法，4 ml大肠杆菌DH5a可以抽提出4. 4到8. 6微克的质粒量(见图7)， 因此本发明中的pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx两种质粒经过常规的抽提方法可 以很方便地得到微克级的量以满足常规生物试验的需要。2、 pEGFP/DsRed转染24小时后在荧光显微镜下可同时观察到两种荧光蛋白各a清晰明亮的荧光信号，表明载体上的红/绿荧光蛋白基因可同时被正常有效地表达(见图8)。3、 分别在转染pEGFP/DsRed-朋x后24小时、48小时、72小时用荧光显微镜 观察，可同时观察到两种荧光蛋白各自清晰明亮的荧光信号，并且对应荧光信号随 着时间的推移有越来越强的趋势，表明载体在一定时间范围内能稳定地表达出红/ 绿荧光蛋白(见图9)。4、 荧光蛋白EGFP和DsRed-Monomer适合在流式细胞细胞仪平台上进行双标检 测(0rengo JP， Bund腿n D， Cooper TA. 2006 A bichromatic fluorescent reporter for cell-based screens of alternative splicing. 7Vuc_/eic /Jcicfe /tes. 34:el48. )。 EGFP和DsRed-Monomer在被488nm的激光激发时，会产生各自的 发射波谱。检测时我们选择了 PMT2 (FL1)通道和PMT4 (FL3)通道分别来收集波 长范围为[515nm， 535nm]的绿色荧光信号和波长范围为[610, 630]的红色荧光信号。 因此将荧光间的干扰降低到了最低限度，这为精确定量提供了物质基础。5、 在EGFP基因的两端分别存在一个Sal I位点(见图谱5和6),用Sal I单 酶切就可以将EGFP基因切下来，这为以后载体的升级改进提供了很好的条件。6、 耙标基因可以融合在DsRed-Monomer的终止密码子之后，因此耙标基因就 成为了 DsRed-Monomer的3' UTR而不被翻译出来(见图谱6)。这样就可以仅仅表 达出完整的红色荧光蛋白而避免了红色荧光蛋白遭融合后的影响。这为精确定量系 统的稳定性提供了保证。7、载体表达出的红/绿荧光蛋白各自所发出的荧光强度间存在着相关性，利用 定量荧光流式细胞术，可以绘制出相关性很好的校准曲线(见图11和13)。这为精 确定量提供了方法上的支持。综上所述，本发明中所述的定量分析siRNA效率的方法与现有技术相比具有以 下优点-1、 仅只需要对双色荧光报告质粒和siRNA进行共转染即可；2、 整个操作过程中，细胞在活体的状态下被分析，不需要打破细胞更不需要 从细胞中抽提出蛋白和RNA;3、 没有荧光信号的细胞以及那些仅仅只有红色荧光而没有绿色荧光的细胞都 被筛选出局，而那些能够发出作为内参的绿色荧光的单体活细胞才被确定下来作为 分析的对象以提高分析的精确性；4、 在不同批次的实验甚至在同一批次所用不同浓度的siRNA实验中，我们都 用无关的负对照siRNA作为参照计算出了双色荧光报告载体中红绿荧光蛋白之间的 校准曲线以此来提高我们定量的精确性；5、 目的细胞群中的每一个细胞的红/绿荧光强度都被利用来计算各个siRNA抑 制耙标的效率，因此基于校准曲线的定量结果具有高度的可信性和可重复性(见图 13)。
本发明的上述和其他目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优 选实施例的详细描述和附图示出的内容得到，不同视图中相同的参考符号代 表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施 和效果。图1为衍生质粒pEGFP-N卜Ampicillin的构建示意图；图2为衍生质粒pMD18-EGFP的构建示意图；图3为衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建示意图；图4为衍生质粒pEGFP/EGFP的构建示意图；图5为双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的构建及其图谱示意图；图6为双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx的构建及其图谱示意图；图7为依据常规的抽提超纯质粒的方法，所得的超纯双色荧光报告载体 pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx对其定量的电泳图片。最左边的条带为 maker: lkb plus;泳道1为本发明中的超纯质粒pEGFP/DsRed.;泳道2为 本发明中的超纯质粒pEGFP/DsRed-HB;依据常规的定量算法对其进行定量， 定量结果证明用4ml DH5a可以抽提出8. 6微克本发明中的双色荧光报告载 体pEGFP/DsRed和4. 4微克本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx;图8为Hela细胞被转染了 250ng本发明中的pEGFP/DsRed, 24小时之后在 荧光显微镜下观察到的结果示意图。EGFP表示用蓝光激发在荧光显微镜下观察到 的绿色荧光信号，DsRed-Monomer表示在EGFP信号观察完之后在同一个视野下用 绿光激发后所观察到的红色荧光信号。结果显示本发明中的pEGFP/DsRed能够同时 检测到绿色荧光信号和红色荧光信号，表明本发明中的pEGFP/DsRed载体能够在 真核细胞中同时顺利表达出绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白；图9为Linx细胞被转染了 250 ng本发明中的双色荧光报告载体 pEGFP/DsRed-HBx之后，在转染24小时，48小时，72小时在荧光显微镜下观察到 的结果示意图。EGFP和DsRed-Monomer表示在24小时、48小时、72小时等时间 段时分别检测到的绿色荧光和红色荧光信号。从图上我们可以观察到，本发明中的 双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx能在真核细胞中顺利表达出绿色荧光蛋白和 红色荧光蛋白。而且随着时间的推移，荧光信号有增强的趋势，此结果表明本发明 中的pEGFP/DsRed-HBx载体有很好的稳定性，适合于长时间的荧光信号检测；图10为用不同质量本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体和4 nM siNC (无 关siRNA)共转染Linx细胞，48小时之后在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号和 红色荧光信号的结果。具体转染所用质粒的质量如图所示为100 ng、 120 ng、 140 ng、 160 ng、 180 ng、 200 ng、 220 ng、 250 ng、 300 ng、 350 ng、 400 ng、 500 ng。在同一个样品中，当绿光减弱时，红光必定也减弱；反之依然。图10结果可以定性说明本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体所表达的红/绿荧光蛋白间存在着一种直线关 系，这就为后面的用绿色信号作为内参来精确定量红色荧光信号的变化打下了坚实 的基础。图11为图IO中用不同质量(分别为100 ng、 120 ng、 140 ng、 160 ng、 180 ng、 200 ng、 220 ng、 250 ng、 300 ng、 350 ng、 400 ng、 500 ng )的pEGFP/DsRed-HBx 和4 nM siNC (无关siRNA)共转染Linx细胞在荧光显微镜下观察之后，全部 样品都用流式细胞仪检测完毕后所给出的部分流式分析结果。流式结果中的Y轴(PMT4 Log)表征的是DsRed-Monomer的红色荧光强度；X轴(PMT2 Log)表征的 是EGFP的绿色荧光强度。图11 (A)为未进行转染操作的细胞作为流式分析的空白 对照所显示的结果。空白样品的流式结果表明在未转染本发明的细胞中既没有红色 信号也没有绿色信号。图11 (B)为用100 ng pEGFP/DsRed-HBx同4 nM siNC 共转染后用流式细胞仪检测到的结果。图ll (B)的上部分显示的是流式细胞仪基 于所分析细胞的荧光信号特征，将细胞分成了 4个区域，分别为Bl、 B2、 B3、 B4 区。当转染了本发明中的pEGFP/DsRed-HBx之后，那些检测到荧光信号的细胞大 部分位于B2区，另有一小部分位于Bl和B4区。流式细胞仪同时将不同区域内的 细胞参数都在图B的下部分分别显示出来。例如位于该区中细胞的数目(N咖ber)、 区内每个细胞的平均绿色荧光强度(Xie肌)、区内每个细胞的平均红色荧光强度(Yiean)等等。图11 (C)为基于流式细胞仪分析的数据，依据方程(1)(2)计算 出每个质量下样品各自的平均红/绿荧光强度，由此决定橙色点的坐标，橙色点的 坐标表示细胞在转染siNC后细胞表达荧光的情况。每个橙色点所用的载体质量都 在对应点下进行了标明。然后用平均红色荧光强度对平均绿色荧光强度进行作图， 用软件R package (http:〃www. r-project, org)于是模拟出了一条如图11 (C)所 /下的直线。直线的方程及其相关特性在图C的左上角标出。图12为荧光显微镜下观察到的在100 nM， 50 nM和25 nM不同浓度的siRNA 的抑制效果图。将250 ng本发明中的pEGFP/DsRed-HBx同挑选出的有效的5个 siRNA (si9, sil2, sil9-l， si22，和si25)分别在不同的浓度下(100 nM， 50 nM 和25 nM)共转染Linx细胞系。同时将siNC也在逐渐降低浓度(100 nM， 50 nM 和25 nM)下与250 ng本发明中的pEGFP/DsRed-HBx共转染Linx细胞系并在每 个浓度下都做了 IO个样品以绘制出校准曲线。EGFP表示荧光显微镜下所检测到的 绿色荧光蛋白所发出的信号，DsRed-Monomer表示荧光显微镜下检测到的红色荧光 蛋白所发出的信号。从转染SiNC的试验结果可以发现，在100nM， 50nM和25nM浓度下，同一个siNC自身所发出的红/绿荧光信号强度都彼此相当；但是当转染进 了 5个有效的siRNA (si9， sil2, sil9-1， si22，和si25)之后，与同浓度下的 siNC的转染结果对比我们可以发现，绿色荧光信号没有什么变化，但是红色荧光信 号却大大地降低了。表明挑选出的有功能的siRNA很有效地抑制了 DsRed-Monomer 的表达。图13为基于不同浓度下的校准曲线所计算出的不同浓度下siRNA的抑制效果 图。当用实验证实了本发明所表达的红(绿)荧光蛋白的平均荧光强度间的确存在 着直线关系之后，我们就开始运用本发明进行高通量筛选有效siRNA。将图12中的 试验样品在荧光显微镜下观察之后，随即将其上样到流式细胞仪中进行定量分析。 所用本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体都为250ng， siNC的浓度和有效siRNA 的浓度都分别为100 nM， 50 nM， 25 nM。不同浓度下的效果图分别对应于 图13 (A)， (B)， (C)。橙色点的坐标表示细胞在转染siNC后细胞表达荧光的情 况，不同siNC浓度下，橙色点的坐标数值计算以及校准曲线的确立都同图11， 校准曲线的特征都在其左上角标出。绿色点的坐标表示细胞在转染有效siRNA后细 胞表达荧光的情况，绿色点的坐标数值的确定也是依据方程(l) (2)计算出每个有效 siRNA样品各自的平均红/绿荧光强度来决定的。siRNA抑制效率依据方程(3)计 算得出。si9的抑制效率计算如下例如在图13 (A)中，当转染了 100 nM的si9 之后，利用方程(1)(2)可以确定其绿色点的坐标，因为与此同时转染了 100 riM的 siNC的样品可以确定橙色点的坐标及在此浓度下的校准曲线，那么当si9的平均绿 色荧光被测出来之后，就可以在校准曲线上找到对应此点时的理论平均红色荧光强 度(tMFI)，水平直线指向的就是tMFI。最后依据方程(3)方便地算出si9在100 nM下可以达到83%的抑制效果，基于此可以轻易算出其他浓度下si9的抑制效果。 100 nM, 50 nM， 25 nM下对应的具体抑制结果分别在图13 (A)， (B)， (C)的 右边被标记出来。对图13 (A)， (B)， (C)结果分析对比，我们发现在不同 浓度下，每个siRNA自身的抑制效率都极其一致，表明本发明在25 nM的时候这5 个siRNA都达到了饱和抑制。此结果也证明了基于本发明的定量流式细胞术具有高 度的可重复性和可信赖性。
具体实施方式
实施例1 PCR扩增带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列 扩增引物合成引物根据氨苄抗性基因的ORF及载体设计，用primer premier 5. O软件(加拿大的Premi er公司产品)检测。所用5'引物P1为 CCTAGATCTTAAGAAATTAAAAATGAAGTTT (下划线为引入的Bgl II酶切 位点)；3'引物P2为TAATAATGGTTTCACGTAGTGCAGGTGGC (下划线 为引入的DraIII酶切位点)。本发明中所用引物均由武汉赛百盛公司合成。 以pUC18 (Takara公司产品)为模板，用上游引物和下游引物，利用PCR仪 扩增出pUC18中从1566至U 2617的一段DNA序列。 PCR体系组分:5 (il 10xl#buffer, 5 pl dNTP (2 mM)， 1 pl引物Pl (10 pM), 1… 引物P2(10(iM)， 0.1 pl模板pUC18， 2plMgcl2 (25mM)， 0.3 (xl TOYOBO KOD 酶(2.5U/pl)，补无菌ddH20至50n 1。用移液枪抽吸混匀，向无菌PCR管中加 上述组分的操作在冰上进行。1000rpra离心10sec后，将PCR管置于PCR仪 上。PCR反应条件94°C， 3min; 94°C ， 30 s; 40°C， 30 s; 74°C， 30s， 5 次；94°C， 30 s ; 55°C， 30 s ; 74°C， 30s ， 25次；74°C， 5min。 取5uL PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察 扩增结果。PCR扩增带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因，PCR产物在1.0% 的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察，有与目的基因大小相符的 目的条带，大小为1086bp左右。此步得到了带有启动子和转录终止信号的氨苄 抗性基因序列。实施例2带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因PCR产物的回收与纯化(1)将实施例1中的PCR产物用1.0。/。琼脂糖凝胶进行电泳(1XTAE)， 用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳， 在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。(2)在 Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液Binding Buffer, 65'C水浴 7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。(3)将融解的23样品加入层析柱中，12000rpm离心lmin，弃去液体。(4)加300nl Binding Buffer,离心弃去液体。(5)加750 u 1 Washing Buffer,离心弃去液体。(6)重复步骤(5) —次。(7)空柱子12000rpra离心lmin以甩干液体。(8) 将柱子放于1. 5ml Eppendorf管，加入30 y 1 EIution buffer, 37。C保温 2min， 12000rpm离心lmin，将得到的PCR产物取2 y 1电泳检测定量，其余 的贮于-2CTC备用。此步得到了纯化过的带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性 基因序列。实施例3质粒pEGFP-Nl被Afl II单酶切反应体系5 ii 1 10X0 buffer; pEGFP-Nl plasmid 15 u 1; 5" 1 Afl II 酶；补无菌水ddH20至50 u 1。反应过程将反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心10s， 置于37'C水浴锅中保温反应2-4h,用1%的琼脂糖凝胶电泳紫外灯下切下目 的条带，用胶回收试剂盒进行回收纯化。最后用30u 1无菌水洗脱。取2ul 样品1%琼脂糖电泳检测，其余贮于-2(TC备用。此步得到了被被AflII单酶 切过的pEGFP-Nl。实施例4质粒pEGFP-Nl被Af 1 II单酶切后通过K0D DNA聚合酶补成平末端 反应体系5^1被Afl II单酶切的pEGFP-Nl; 1 plMgCl2(25mM); 2 |il dNTP(2.5 mM); 1 pi 10x 1# buffer; 1 pl T0Y0B0 KOD酶(2.5 U4d)。反应过程将反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心10s，放入PCR仪中于7(TC反应30分钟。此步得到了通过KOD DNA聚合酶被补成平末端的pEGFP-Nl。实施例5用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司产品)纯化被补平的质粒pEGFP-Nl 具体过程如下(1)将实施例4中被Afl II单酶切的质粒pEGFP-Nl酶切体系转移到一个 千净的1. 5nd的离心管中，加入4一5倍体积的Buffer CP。 (2)完全振荡混和， 对离心管进行简短离心，将溶液集中于管底。(3)将HiBind DNA柱子置入 一个试剂盒中提供的2ml的收集管中。(4)将步骤(2)中的样品加入到HiBind DNA柱子中，在室温(20-25°C) 10， OOOXg离心l分钟。(5)倒掉管底离心下来的液体，将HiBindDNA柱子放回上述的收集管中。(6)用700 u 1被 无水乙醇稀释过的DNA wash溶液冲洗HiBind DNA柱子。在室温10， 000 Xg离心l分钟。(7)倒掉管底离心下来的液体，重复步骤(6) —次。(8) 倒掉管底离心下来的液体，以最大转速空转HiBind DNA柱子2分钟以甩干 柱子中的基质。(9)将HiBind DNA柱子放入到一干净的1.5ml离心管中， 直接滴加15-30y 1无菌水到柱子的基质上，在室温静置1一2分钟。以最大 转速离心1分钟将DNA洗脱下来。此步得到了被纯化过的补平的质粒 pEGFP-Nl。实施例6对被补平的pEGFP-Nl质粒进行去磷酸化操作，以及对扩增出的氨 苄抗性基因进行磷酸化操作去磷酸化反应体系1 20 pmol被补成平末端的pEGFP-Nl质粒；5 pl IOX碱 性磷酸酶buffer; 2plTaKaRa碱性磷酸酶(10U/pl);补无菌水ddH20至50 y1。磷酸化扩增出的氨苄抗性基因反应体系l 50pmol利用KOD扩增出的氨苄抗 性基因；5 |_U 10XT4多核苷酸激酶buffer; 2. 5 ^ ATP (10 mM); 2. 5 ^ T4多核 苷酸激酶；补无菌水ddH20至50 "1。反应过程分别将去磷酸化和磷酸化体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm 瞬时离心10s，随后于37'C反应30分钟，在7(TC变性15分钟失活蛋白，最后 分别用Cycle-Pure Kit (E.Z.N.A公司产品)进行纯化。此步分别得到了被去磷酸化和 被补平的pEGFP-Nl质粒和被磷酸化的氨苄抗性基因。实施例7将被去磷酸化的pEGFP-Nl质粒和被磷酸化的氨苄抗性基因进行连 接反应将以上被去磷酸化的pEGFP-Nl质粒和被磷酸化的氨苄抗性基因进行连接反 应，其连接体系为3^1 (lOng/pl )被去磷酸化的pEGFP-Nl质粒；3^1 (28 ng/pl )被磷酸化的氨苄抗性基因；6pl Solution I (Takara)。在冰上混合上述液 体，将12^1混合液放在250pl的无菌离心管中，用移液枪轻轻抽吸几下混 匀，5000rpm瞬时离心，将混合液集中在管底，然后4"C连接过夜。实施例8大肠杆菌的转化和带有氨节霉素和卡那霉素抗性质粒pEGFP-N卜Ampicillin的筛选(1) 采用冷氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞(a)以无菌牙签挑取 平板上的大肠杆菌DH5a单菌落，接种到5mL LB培养基中，37°C， 220rpm 活化过夜。(b)取10 20^上述活化大肠杆菌，接种到5mL新鲜的LB培养 基中，37°C, 220rpm培养2 3h,至0D600值为0. 4 0. 6。 (c)取1. 5mL 步骤(b)中的菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4， OOOrpm离心10min， 抽干上清。(d)加入800pl冰预冷的0. 1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀， 冰浴30min。 4， OOOrpm离心10rain,抽干上清。(e)加入100pl冰预冷的 0. 1M氯化钙重悬沉淀，得到制备好的感受态细胞。4。C保存，7 10天内使 用。(2) 质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(a)取12^U连接反应液， 加入到100pl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。 (b) 42 °C 水浴中热激90s，迅速移至冰中冰浴2-3min。 (c)加入390^1新鲜LB液体 培养基，37°C， 150rpm轻摇，50rain。 (d) 4， 000rpra离心5min，吸弃400W 上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。(e)将剩余的菌液接种到5mL含 有60叱/ml氨苄青霉素和50 (ig/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C摇床中 220rpm过夜培养。(f) 24小时后，观察结果。(3) 质粒pEGFP-N1-A卿icillin的筛选24小时后收集生长起来的细菌，用 碱法抽提出质粒，将所得质粒再次转化DH5a感受态细胞，将被转化细胞铺板于含 60吗/ml氨苄青霉素和50 pg/ml卡那霉素的双抗平板上，于37°C培养箱中培养过 夜。挑选单克隆，酶切证明有插入。同时将重组质粒pEGFP-N1-A即icilliri送往 上海联合基因研究院测序。所能测出的部分证明氨苄抗性基因以顺时针方向 插入。最终得到了有氨苄抗性的载体pEGFP-N1-Ampicillin。具体克隆过程及图 谱见图1。实施例9衍生质粒pMD18-EGFP的构建(具体图谱见图2) (l)扩增引物合成设计和合成方法以及操作过程同实施例1。所用5'引 物P3为AGGCCTGTCGACCGCCACCATG (下划标记为引入的Stu I和Sal I酶切位点)；3'引物P4为TTACTTGTAC AGCTCGTCCATGCC 。以pEGFP-N 1(BD Biosciences Clontech公司产品)为模板，用上游引物和下游引物，利 用PCR仪扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP。 PCR体系组分25 ^2xGCbufferl， 5^1 dNTP(2mM)，1 pl引物P3 (10 ^M)， 1 pl引物P4 (10 ^M)， 1 pl模板pEGFP-Nl， 0.4 pi Takara LA Taq酶(5 U/(xl)，补无菌ddH20至50 u 1 。PCR反应条件94°C， 3min; 94°C ， 30 s; 50°C ， 60 s; 72°C， 90s, 30次；74°C , 5min。(2) PCR产物的回收与纯化过程同实施例2。将回收和纯化过的EGFP 基因PCR产物与pMD18-T vector(Takara公司产品)迸行连接反应。其连接体系为EGFP PCR产物；0. 5|il pMD18-T vector; 5jJ Solution I; 0. 5fxl T4 DNA连接 酶。具体连接操作过程同实施例7。(3) 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备同实施例8，质粒转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞过程如下(a)取lOuL连接反应液，加入到lOOuL上述制 备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。 (b) 42'C水浴中热激90秒， 迅速移至冰中冰浴2-3min 。 ( c)加入390uL新鲜LB液体培养基，37 °C ， 150rpm 轻摇，50min。 (d) 4, 000rpm离心5min，吸弃400uL上清，将剩余的菌液用 移液枪轻轻混匀。(e)取100uL细菌悬液，用无菌三角玻璃涂棒涂布于含氨 苄青霉素的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被充分吸收，倒置平 板，于37'C培养箱中培养过夜。(f) 12-16小时后，观察结果。(4) 阳性重组子p腦18-EGFP的鉴定。(a)双酶切鉴定，反应体系lpl 10XK buffer; 7pl plasmid; 1^1 Hind III酶；lpl BamH I酶；补无菌水 ddH20至lOpl。反应过程将反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬 时离心10s，置于水浴锅中37'C保温反应2-4h,加反应量0. 1倍体积的10 X loading Buffer终止反应，取8|^1酶切产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 酶切结果。根据双酶切后是否有大小正确的带来判断该质粒是否为阳性重组 子pMD18-EGFP。 (b) EGFP序列测定将经过双酶切鉴定的p腦18-EGFP重 组质粒送往上海联合基因研究院测序。序列测定结果表明EGFP在PCR扩增 时发生了一个碱基的突变使得酪氨酸-183突变为天冬酰胺，即从起始密 码子开始的第547位的T突变为A。实施例10衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建(具体图谱见图3)(1) 以pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech公司产品)为模板，扩增出 pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech公司产品)中从3424到3860间的一段序 列(此序列为单纯疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号——HSV TK poly A),使得 该序列的两边分别含有Pst I和Hirul III酶切位点。扩增引物合成设和合 成方法以及操作过程同实施例1 。所用5'引物P5 : TTGCTGCAGGCGGGACTCTGGGGT (下划标记为引入的Pst I酶切位点)；3' 引物P6: GCCAAGCTTAGGGCCTGCCGC (下划线为引入的Hind III酶切位 点；虚线为模板序列中本身含有的Dra II酶切位点)。PCR体系组分5 pi 10xbufferl， 5 ^ dNTP(2mM)， 1^1引物P5 (lOpM)， 1 ^引物P6 (lOpM)， 1^1模 板pEGFP-Nl ， 2 |id Mgcl2 (25mM)， 1 ^ TOYOBO KOD酶(2.5 U/jlU)，补无菌 ddH20至50y 1。PCR反应条件94。C， 30 s; 58°C， 30 s; 74°C ，60s,30次；74。C ， 5m i n 。(2) PCR产物的回收与纯化过程同实施例2。将回收和纯化过的PCR产 物与pMD18-EGFP (衍生质粒)进行双酶切后连接反应。其双酶切体系为11.5^1 pMD18-EGFP或者PCR产物；1. 5^1 10 X M buffer; l^il Hind III酶；l|til Pst I酶；补无菌水dd&O至15^1。酶切后纯化回收，具体操作同实施例2。随 后进行连接反应，其连接体系为2plpMD18-EGFP质粒；6|id PCR回收产物； l^il 10Xbuffer; lplT4DNA连接酶。具体连接操作过程同实施例7 。(3) 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备和转化同实施例8。(4) 阳性重组子pMD18-EGFP-polyA的鉴定。(a)双酶切鉴定大体上同 实施例9中的(4a)，所用限制性内切酶为Pst I和Hind III。 (b) polyA 信号的序列测定，同实施例9中的(4b),测序结果正确。实施例11衍生质粒pEGFP/EGFP的构建(具体图谱见图4) (1)用Fermentas公司生产的Dra II (Eco0109 I)和Stu I双酶切上述衍生 质粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小为1， 188bp的片断(此片断包含EGFP 和HSV TK poly A的DNA序列)，同时也用Dra II (Eco0109 I)和Stu I双酶切pEGFP-Nl-Ampici]in。具体双酶切实施过程如下(a)首先Stu I单酶切 pMD18-EGFP-polyA禾口 pEGFP-N卜Ampicillin,体系如下2^1 10XB buffer; 16. 5pl plasmid; 1. 5pl Stu I酶；补无菌水ddH20至20^1。 (b)分别回收纯 化被StuI切动的质粒，具体操作过程同实施例2。 (c)然后用DraII单酶 切被纯化回收的质粒，体系如下2j_il lOXTango buffer; 16.5^1 plasraid; 1.5^U Dra II酶；补无菌水ddH20至20W。 (d)分别回收纯化被切出的大小 约1. 2Kb的和4. 5Kb的条带，具体操作过程同实施例2。(2 )将此1, 188bp的片断亚克隆进上述已经制备好的衍生质粒 pEGFP-Nl-Arapicillin相应位置处。具体连接体系如下4pl 1, 188bp的EGFP-polyA 片断；l)nlpEGFP-Nl-Ampici 11 in vector; 5pl Solution I; 0. 5^1 T4 DNA连接酶。具 体连接操作过程同实施例7。(3) 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备和连接产物的转化同实施例8。(4) 阳性重组子pEGFP/EGFP的鉴定。因为在载体的设计中，申请人在 EGFP基因的两端都带上了 Sal I酶切位点，当用Sal I单酶切时如果能切 出大约为750bp的条带，则说明构建的质粒成功。具体Sal I (Takara公司 产品)单酶切体系如下lpl 10XH buffer; 4^1 plasmid; 0.5nlSalI酶； 0. 5plRnaseA (降解质粒中的RNA);补无菌水ddH20至10M1。最后有目的条带 被切出，证明亚克隆构建成功。实施例12目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建(具体图谱见图5)(1) 用NheI和Not I切下质粒pDsRed-Monomer-Nl (BD Biosciences Clontech 公司产品)从多克隆位点到DsRed-Monomer基因(BD Biosciences Clontech公司产 品)末尾处的一段775bp的片断。将此片段亚克隆进上述已经构建好的衍生质粒 pEGFP/EGFP的相应位点。具体双酶切方法和克隆过程同实施例11，只是过程中 使用的限制性内切酶分别为Nhe I和Not I，并且从pDsRed-Monomer-Nl上回 收的插入片断大小为768bp，从pEGFP/EGFP上回收的载体片断大小为5000bp。(2) 阳性重组子pEGFP/DsRed的鉴定。对DsRed-Monoraer基因序列的测 序，具体实施方式
同实施例9中的(4b)，测序结果正确。实施例13目的质粒pEGFP/DsRed-HBx的最终构建(具体图谱见图6)(1) 以含有HBx基因的质粒为模板，利用PCR扩增出在HBx基因两边分 别含有Not I和Xba I酶切位点的片断，所用5'引物P7 : ATAGCGGCCGCATGGCTGCTGCTAGGCTGTGCT (下划线为引入的Not I酶切 位点)；3'引物P8: ATATCTAGAGGCAGAGGTGAAAAAG (下划线为引入的 Xbal酶切位点)。扩增引物合成设计和合成方法以及操作过程同实施例1。PCR体系组分5 pi 10x buffer ， 5 ^ dNTP (2 mM)， 1 pi引物P7 (10阔，1 |il 引物P8 (10 nM)， 1 Hl模板pCMV-flag2a-HBx, 0.4 pi Pfu酶(2.5 ,)，补无菌 ddH20至50y 1。PCR反应条件94°C, 3min; 94°C ， 30 s; 58°C， 60 s; 72°C ， 卯s， 30次；74°C， 5min。(2) 可被Xba I酶切的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的获得 因为本发明中的载体pEGFP/DsRed在大肠杆菌E.coli DH5 a内增殖时所抽提出的pEGFP/DsRed质粒上的Xba I酶切位点被甲基化了 ，这样使得pEGFP/DsRed不 可被Xba I消化。为了获得可被Xba I消化的pEGFP/DsRed, pEGFP/DsRed质粒被 转化到了 ER2925菌株(New England Biolabs公司产品)中，然后从ER2925菌株 (New England Biolabs公司产品)中抽提出pEGFP/DsRed质粒，这样就避免了甲基化 对Xba I酶切活性的影响。大肠杆菌ER2925感受态细胞的制备和载体 pEGFP/DsRed的转化同实施例8。(3) HBx基因的PCR产物的回收与纯化过程同实施例2。将回收和纯化 过的HBx基因PCR产物与pEGFP/DsRed (衍生质粒)分别进行双酶切反应以便将HBx 插入到pEGFP/DsRed的相应位置处。具体双酶切方法和克隆过程同实施例11。只 是过程中使用的限制性内切酶分别为Xba I和Not I，并且回收的HBx基因 的PCR片断大小约为465bp，回收的载体pEGFP/DsRed片断大小约为5600bp。具 体连接体系和操作过程同实施例11。(4) 阳性重组子pEGFP/DsRed-朋x的鉴定。HBx基因的序列测定，同实 施例9中的(4b)，测序结果正确。实施例14载体pEGFP/DsRed在真核细胞内表达荧光蛋白功能的鉴定(具体 试验结果见图8)因为本发明pEGFP/DsRed理论上可以在真核细胞中既表达出绿色荧光蛋白也 可以表达出红色荧光蛋白，如果将质粒转染入真核细胞内，在显微镜下既可以观察 到绿色荧光信号而且也可以观察到红色荧光信号的话，那么可以表明pEGFP/DsRed 所克隆进入的EGFP基因和DsRed-Monomer基因具有生物学功能。具体细胞的相关操 作技术如下(1) 本发明中所用Hela细胞的培养。Hela细胞系从中国典型培养物保藏 中心购买，保藏编号CCTCC GDC009，为普通细胞株。Hela细胞系培养于含 10。/。热失活小牛血清FCS (FCS; Gibco)、 lmM L-谷氨酸的DMEM (DMEM; Invitrogen， Gibco)培养基中于37。C、 5%0)2中培养。(a)细胞的传代培养。待细 胞长到80%丰度时，吸去培养瓶内的陈旧培养液。(b)用无菌PBS缓冲液(0.2g KC1， 0.2gKH2PO4,8.0gNaCl， 1.56gNa2HP04 . 7H20，融解在1 L双蒸水中)漂洗细胞 单层两次，吸去漂洗液，以除去少数老化或死去的细胞。(c)用无菌吸管吸取lml 0.25%的胰酶加入培养瓶中，置于37'C培养箱消化至细胞变圆(胰酶约2-5分钟)。(d)加入10ml新鲜DMEM完全培养基，迅速吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形 成细胞悬液。(e)把细胞悬液分成等份，分装入两个无菌的细胞培养瓶内，置培养 箱中培养。(2) 本发明中所用Hela细胞进行的转染操作。本发明中的细胞转染都是在24 孔板中进行。转染全过程必须严格无菌操作。具体过程如下(a)在转染前一天将 待转染细胞接种于24孔板中，37'C培养。转染前的细胞密度以60 — 70%为准。(b) 准备以下溶液①稀释250ng pEGFP/DsRed于50W无血清、无抗菌素的DMEM培养 基中。混匀后室温(20-25°C，以下相同)静置10分钟。②稀释Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司产品)试剂于50W无血清、无抗菌素的DMEM培养基中。混 匀后室温静置5分钟。(c)混合①、②两种溶液，室温静置15 — 20分钟。(溶液 可能会呈雾状浑浊，但不影响转染)。(d)弃掉培养板中的旧培养基，用0.5 ml 无血清、无抗菌素的DMEM培养基清洗细胞2次，最后每孔加入400W无血清、无抗 菌素的DMEM培养基。(e)将以上Lipofectaraine 2000 — DNA混合物加入到此24 孔板中，前后左右振荡24孔板使溶液均匀。(f) 37'C温育6小时。(g)吸出转染 液，加入正常生长培养基，37'C培养。(h)转染24-72小时后检测。(3) 细胞转染24小时后在荧光显微镜下的观察。24小时后，细胞用倒置荧光 显微镜(Leica DMIRB)进行观察。本发明表达的DsRed-Monomer用绿光激发；而 本发明表达的EGF用蓝光激发。 一旦找到合适的视野之后，那么当分别用绿光和蓝 光进行激发时必须保证所观察结果是在同一个视野下观察的结果，而这可以通过仅 仅只改变激发光源而达到。(4) 在荧光显微镜下观察到的结果如图8所示，表明pEGFP/DsRed能够表达 出有生物活性的EGFP和DsRed-Monomer的荧光蛋白。实施例15分别在转染Linx细胞24小时，48小时，72小时后在荧光显 微镜下检测pEGFP/DsRed-HBx中荧光蛋白的表达(具体试验结果见图9)(1) 本发明中所用的Linx细胞系来源请见Tong WP， Zhou Y, Wang X， Yang F, Wu KL， Wu J"， Zhang Y 2008 An accurate quantitative method for screening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcript in single living cells. A'o/ 力"^fe C。鹏肌367:866-73。
Linx 细 胞系具体的培养、转染和荧光显微镜相关操作技术同实施例H。(2) 在荧光显微镜下观察到的结果如图9所示。表明本发明在一定时间范 围内能稳定地表达出红/绿荧光蛋白。实施例16定量荧光流式细胞术对pEGFP/DsRed-HBx表达出的红/绿荧光蛋白各 自所发出的荧光强度之间相关性的检测(具体试验结果见图10和11)(1) 将4 nM的siNC与不同浓度的pEGFP/DsRed-HBx进行共转染Linx细胞系。 转染质粒的质量分别如下100 ng， 120 ng， 140 ng， 160 ng, 180 ng， 200 ng, 220 ng， 250 ng， 300 ng， 350 ng， 400 ng， 500 ng。 Linx细胞系具体的培养、转 染相关操作技术同实施例14。(2) 在荧光显微镜下观察到的结果如图10所示。荧光观察完之后准备对细胞 进行流式细胞术分析。(3) 流式细胞术分析之前对细胞的处理。(a)弃掉24孔培养板中的培养基， 用冰冷的1XPBS清洗两次；(b)在每个孔中加入lml冰冷的1XPBS，所后用移液 管滴入数滴0. 25%胰酶，前后左右振荡平板混匀溶液，将24孔板置于37'C培养约 10分钟；(c)用移液器反复吹打约50次以吹散Linx细胞；(d)将打散的Linx细胞悬液吸入到2ralEP管中于冰上放置；(e)于4'C在转速为600Xg的冷冻 离心机下以加速度为6进行离心；(f)弃掉上层液体，在此加入lml冰冷的1XPBS， 重悬细胞，重复5中操作；(g)最后加入500W冰冷的1XPBS于冰上放置以进行 流式细胞仪分析。(4) 分析细胞之前对流式细胞仪的设置。选用EPICS ALTRA IKBeckman Coulter 公司产品)此款流式细胞仪来分析已经处理好的细胞。(a)选取流式细胞仪的PMT2 和PMT4通道来收集对应的绿色和红色荧光。其中PMT2对应的波长范围为[515， 535]收集EGFP发出的绿色荧光信号，PMT4对应的波长范围为[610， 630]收集 DsRed-Monomer发出的红色荧光信号；(b)用空白样品作为流式分析的对照；(c) 样品的流式结果用软件Expo32 VI. 2B (Beckman Coulter公司产品)统一分析；(5) 为了更进一步地研究本发明所表达的红绿荧光间确实存在着一种曲线关 系，将图10中的细胞用流式细胞仪进行了分析。对流式细胞仪的参数进行设置之后， 上样分析的细胞被分成了4个区域仅仅只发红色荧光的细胞位于B1区；既发红光 也发绿光的细胞位于B2区；既不发红光也不发绿光的细胞位于B3区；仅仅只发绿光 的细胞位于B4区。流式结果中的Y轴(PMT4Log)表征的是DsRed-Monomer的红色 荧光强度；X轴(PMT2 Log)表征的是EGFP的绿色荧光强度。没有经过转染处理 过的细胞(空白样品)作为进行流式分析时的内参。空白样品的流式结果表明在未 转染本发明的细胞中既没有红色信号也没有绿色信号，见图ll (A)。当转染了本 发明之后，那些检测到荧光信号的细胞大部分位于B2区，另有一小部分位于B1和 B4区，见图ll (B)。流式细胞仪同时将不同区域内的细胞参数都具体地显示出来。 例如位于该区中细胞的数目(Number)、区内每个细胞的平均绿色荧光强度(X-mean)、区内每个细胞的平均红色荧光强度(Y-mean)等等。将图ll (A)和 (B)中的流式结果按照发明内容中提到的方程(1)和(2)计算得到不同质粒浓 度下的平均红/绿荧光强度，然后用平均红色荧光强度(MFIofDsRed-Monomer)对 与之相应的平均绿色荧光强度(MFI of EGFP)作图拟合而成曲线关系图。方程如 下所示.-MFI (EGFP)=X-mean(B2) X N(B2) + X-mean(B4) X N—/N(B2) + N(B4)—方程(1)MFI (DsRed-Monomer) = (Y-mean(B2) X N(B2> + Y-mean(B4> X N(B4>/N(B2> + N(B4)1—-方程(2)图11 (C)的结果证明了本发明所表达的红/绿荧光蛋白的平均荧光强度间的确 存在着直线关系。将此曲线称之为校准曲线。方程用R package软件 (http:〃w冊.r-project. org)拟合而成。实施例17 pEGFP/DsRed-朋x在高通量筛选和精确定量siRNA效率中的应用(具 体试验结果见图12和13)(1) 本发明中使用的siRNA的合成。本发明中所用的5个靶向HBx的siRNA 和一个耙向无关序列的siRNA (siNC)(详细信息见发明内容中的表1)均由广州市 锐博生物科技有限公司合成。所有siRNA干粉溶于无核酸酶的水中以达到25 txM 的储存浓度。(2) 选取5个siRNA (si9， sil2, sil9-l, si22,和si25)做浓度梯度实验。 250 ng的pEGFP/DsRed-冊x分别同浓度递减的siRNA和siNC (25 nM， 50 nM和100 nM) —起共转染Linx细胞。Linx细胞系具体的培养、转染和荧光显微镜相关操作 技术同实施例M。转染之后48小时，荧光显微镜下观察到的结果如图12所示。 在每个浓度下，siNC与250 ng pEGFP/DsRed-HBx共转染10次，以拟合出在此浓 度下的校准曲线。(3) 每个浓度下的校准曲线都根据各自浓度下的siNC与250 ng pEGFP/DsRed-HBx共转染的10个样品的流式数据拟合而成。流式细胞术分析及各自 浓度下校准曲线的绘制同实施例16。(4) 依据方程式(3)，直接计算出siRNA的效率(图3b)。方程如 下所示抑制百分率-(tMFl-MFI)DsRed/tMFIDsRe<l X 100%。 tMFI表示的是理论MFI。—方程(3)憶FI表示的是DsRed-Monomer的理论MFI。为了计算出DsRed-Monomer的理论 MFI (tMFI),根据实施例16中所述的方法，在25 nM， 50 nM和100 nM下依据 siNC的转染结果，3条不同浓度下各自对应的校准曲线通过方程(l)和方程(2)被 拟合出来(见图13)。基于校准曲线，可以轻易地计算出siRNA的效率。基于方程(1)可以计算出待求样品中细胞表达的EGFP的MFI,另一方面在此校准曲线上与 此EGFP的MFI相对应处就有一个红色荧光蛋白的MFI,把此从校准曲线上推导出来 的理论上的红色荧光蛋白的MFI定义为tMFI。 tMFI表示的是当RNAi没有发生时细 胞中红色荧光蛋白的MFI。当RNAi发生后，利用方程(2)可以计算出此时观测到 的红色荧光蛋白的MFI。那么siRNA的抑制效率就可以用DsRed-Monomer的tMFI和 MFI间的差值推导出来，这也就是方程(3)所表示的意义。基于此中方法， 一次性 地计算出了此5种siRNA分别在25 nM、 50 nM和100 nM这三个不同的浓度下的抑 制效率，快速高效地得到了 15个样品的抑制结果(见图13)。SEQUENCE LISTING<110〉武汉大学〈120〉 一种双色荧光报告载体构建方法和应用〈130〉 一种双色荧光报告载体构建方法和应用〈160〉 1<170〉 Patentln version 3. 5〈210〉 1〈211〉 5686<212> 腿〈213〉 人工构建的重组DNA序列〈400〉 1cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccattatgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagtacatggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg gatccaccgg tcgccaccat ggacaacacc gaggacgtca tcaaggagtt catgcagttc aaggtgcgca tggagggctc cgtgaacggc cactacttcg agatcgaggg cgagggcgag ggcaagccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgcagg tgaccaaggg cggccccctg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 84036cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttccagtacg gctccaaggc ctacgtgaag 900caccccgccg acatccccga ctacatgaag ctgtccttcc ccgagggctt cacctgggag 960cgctccatga acttcgagga cggcggcgtg gtggaggtgc agcaggactc ctccctgcag 1020gacggcacct tcatctacaa ggtgaagttc aagggcgtga acttccccgc cgacggcccc 1080gtaatgcaga ag犯gactgc cggctgggag ccctccaccg agaagctgta cccccaggac 1140ggcgtgctga agggcgagat ctcccacgcc ctgaagctga aggacggcgg ccactacacc 1200tgcgacttca agaccgtgta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg caaccactac 1260gtggactcca agctggacat caccaaccac aacgaggact acaccgtggt ggagcagtac 1320gagcacgccg aggcccgcca ctccggctcc cagt卿gcg gccgcgactc t卿tcataa 1380tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 1440tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 1500atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcaLttt ttttcactgc 1560attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta agtaataatg gtttcacgta 1620gtgcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 1680tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 1740gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 1800cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 1860atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 1920agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg l卿gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 20402100cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 2160ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 2220atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 2280gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 2340tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 240037gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 2460gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 2520tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 2580ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 2640tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttcttaa gatctaggct taaggcgtaa 2700attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 2760tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttatetaat caaaagaata gaccgagata 2820gggttgagtg ttgttccagt ttggaac犯g agtccactat taaagaacgt ggactccaac 2880gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 2940tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 3000cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 3060aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 3120cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 3180cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 3240caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga 3300accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 3360gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 3420ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 3480ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 3540gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 3600ag犯gtagtg aggaggcttt tttggaggcc tgtcgaccgc caccatggtg agcaagggcg 3660aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggEtcggcgac gt￡ia￡LCggcc 3720acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 3780agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 3840ccteicggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 3900agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 3960actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 4020tg犯gggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 4080acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 4140tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac aaccagcaga 4200acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 4260ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 4320ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagtcgac ctgcaggcgg 4380gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga 4440ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg 4500gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccta gggggaggct 4560aactgaaaca cggaaggaga c犯taccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag 4620acagaataaa acgcacggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg 4680ctggcactct gtcgataccc caccgagacc ccattggggc caatacgccc gcgtttcttc 4740cttttcccca ccccaccccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg 4800ggcggcaggc cctgccatag cctcaggtta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 4860tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 4920cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4980ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 5040accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 5100cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 5160cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5220tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5280taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg Ucgtgcaca cagcccagct tggagcg認 5340gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 5400aggg鄉卿gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5460ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5520acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5580 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5640 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc atgcat 568权利要求
1. 一种双色荧光报告载体，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
2、 一种用于制备权利要求1所述的双色荧光报告载体的方法，它包括下列步骤A. 衍生质粒pEGFP-Nl-Ampicillin的构建PCR扩增出带有启动子和转录终 止信号的氨苄基因，此序列是以pUC18为模板利用KOD DNA聚合酶扩增出的 pUCI8中从1566至lj 2617的一段DNA序列，将此序列以平末端的方式插入到 pEGFP-Nl载体的Afl II酶切位点，由此衍生出的质粒为pEGFP-Nl-A卿icillin;B. 衍生质粒pMD18-EGFP的构建PCR扩增出在EGFP基因5'端含有Stu I-Sal I酶切位点的产物，然后将此产物连接到pMD18-T vector中，为pMD18-EGFP;C. 衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建利用PCR扩增出pEGFP-Nl中从3424 到3860间的一段序列，该序列的两边分别含有Pst I和Hind III酶切位点，此 PCR产物经Pst I和Hind III双酶切后连接到上述衍生质粒pMD18-EGFP相应位点， 由此生成的质粒为pMD18-EGFP-polyA;D. 衍生质粒pEGFP/EGFP的构建用Dra II和Stu I双酶切上述衍生质粒 pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小为1, 188bp的片断，将此片段亚克隆进 上述己经制备好的衍生质粒pEGFP-Nl-Ampicillin相应位置处，由此衍生出的质粒 为pEGFP/EGFP;E. 目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建用Nhe I和Not I切下质粒 pDsRed-Monomer-Nl从多克隆位点到DsRed-Monomer基因末尾处的一段775bp的片 断，将此片段亚克隆进上述己经构建好的衍生质粒pEGFP/EGFP的相应位点，由此得 到双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，用此载体转化大肠杆菌E. coli DH5 a感受态细 胞，用于其增殖和保藏；F. 双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的 一 种衍生双色荧光载体 pEGFP/DsRed-HBx的制备方法，步骤如下a.HBx基因片断的PCR扩增制备:利用PCR扩增出在HBx基因两边分别含有NotI和Xba I酶切位点的片断；b. Xba I酶切的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的获得为了获得Xba I消 化的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，将双色荧光报告载体pEGFP/DsRed转化到 ER2925菌株中，然后从ER2925菌株中抽提出pEGFP/DsRed质粒；c. pEGFP/DsRed-朋x克隆的构建用Not I和Xba I分别双酶切HBx基因的 PCR产物和从ER2925菌株中抽提出来的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，将HBx基 因产物连接到pEGFP/DsRed的相应位置，转化ER2925菌株，得到双色荧光报告载体 pEGFP/DsRed-HBx。
3、 一种双色荧光报告载体在高通量筛选且定量siRNA效率中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种双色荧光报告载体的构建方法和应用，一种双色荧光报告载体，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其构建方法步骤为A.衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin的构建；B.衍生质粒pMD18-EGFP的构建；C.衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建；D.衍生质粒pEGFP/EGFP的构建；E.目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建；F.双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的一种衍生双色荧光载体pEGFP/DsRed-HBx的制备。本发明方法易行，操作方便，该载体在高通量筛选且定量siRNA效率中的应用。
文档编号C12N15/63GK101260408SQ200810047159
公开日2008年9月10日 申请日期2008年3月27日 优先权日2008年3月27日
发明者翼 张, 王欣欣, 童文平, 谢茂华 申请人:武汉大学