适宜机械化收获的矮杆紧凑型油菜的育种设计及鉴定方法

专利名称：适宜机械化收获的矮杆紧凑型油菜的育种设计及鉴定方法
技术领域：
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种适宜机械化收获的矮杆紧凑型油菜的育种 设计、筛选及鉴定方法。
背景技术：
随着经济的发展，农作物种植上的劳动力及相关的栽培管理等成本投入5显增加，选育 高产优质，特别是适应机械化收获的新品种是降低生产成本、提高经济效益的一个方面，开 发新的栽培方法等是增强经济效益的另一个方面。显然，培育理想的作物新品种是农作物增 产、增收，促进农业生产发展的首选方法，而新品种的培育与合理的育种方法及特异基因资 源的发掘、利用等密切相关。传统的常规育种技术主要依赖于杂交后代的自交重组及人工选 择，这不仅需要有很大的分离群体、可靠的环境条件，而且需要准确的筛选技术及较长的试 验周期。现代转基因技术及分子标记辅助育种技术虽然可以对特定的植物群体进行改良，但 改良的目标性状数量有限。
长期以来，自然选择及进化等使油菜形成了植株比较高大，分枝及角果比较分散等特点。 这些特点使得油菜不利于进行机械化、规模化操作以降低生产成本。为便于油菜能够实现机 械化收获，目前人类对油菜进行的遗传改良主要在于抗裂角、矮化选择等方面。但由于油菜 为无限花序，花期较长(一般持续l个月左右)，使得油菜茎、枝上不同层次的角果成熟时间 不能一致，常常下部角果已经成熟变黄，而上部角果仍未能成熟(青色)，为能够进行脱粒， 加拿大等国家的做法是成熟期先将油菜机械化割倒，经过几天后熟再进行机械化脱粒，显然 这增加了油菜生产成本。但是，即便如此，这些国家的油菜种植成本仍比完全依赖于人工的 中国低40%以上。发现并培育株型紧凑、花期较短、结荚层集中、抗裂角等新型油菜品种以
适应机械化操作是国内外油菜遗传改良的发展趋势。此外，由于具有上述特点，这类品种无 疑也有利于抗病、抗倒，有利于高密度种植，有利于油菜的增产增收。
知识产权保护及农作物种苗市场等常常需要进行品种、特异新型材料的鉴别。通常可用 于农作物品种鉴别的方法主要有形态学标记法、生化标记法和分子标记鉴定法等。前两种方 法是比较经典的方法，但由于这两类标记数量很少，易受环境影响，且具有组织特异性，在 作物品种数量日益增多及人们对作物产品品质等要求円益严格的情况下，这两种方法的应用
范围及能力日显不足。分子标记技术是二十世纪八十年代以来发展起来的、基于物种DNA 指纹特征的标记技术。这类标记不易受环境影响，且理论上数量可以是无限的。由于不同遗 传材料具有不同特征的分子指纹，因此分子标记可以用于品种的鉴别。目前'RFLP、 SSR、 AFLP、 SCAR等标记技术己用于水稻、小麦、玉米、油菜等作物DNA指纹分析及品种(杂 种)鉴定。迄今为止尚未见到适宜机械化收获的矮杆紧凑型油菜的育种设计、筛选及鉴定方法的报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种选育矮杆紧凑型油菜的育种技术以及提供应用改育种技术选 育获得矮杆紧凑型油菜的鉴定方法。利用该育种方法培育适应高密度种植、适应机械化收获 的油菜品种，以解决当前油菜生产中面临的突出高种植成本问题。
本发明通过以下技术方案实现
一种适宜机械化收获的矮杆紧凑型油菜的育种设计方法，包括歩骤
U)以甘蓝型油菜5148-2(该品系于2006年1月18 R保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC-P200601,专利申请号200610018257.5)为母本，加拿大GRakow教授 提供的人工合成黄籽油菜DH系YN90-101参见文献Dargl J Somers等.Identification of molecular markers associated with linoleic acid desaturation in 5nxss!.ca wapws. Theoretical and Applied Genetics, 1998， 96(6-7》897-903; Dargl J Somers等.Identification of a major gene and RAPD markers for yellow seed coat colour in Srass!'ca "apws. Genome, 2001, 44: 1077-1082为父 本进行杂交，得到杂种F,;
(2) 于油菜开花期取杂种F,植株主花序和上部分枝花序上幼蕾，用常规方法，通过酒 精和升汞消毒、研磨破碎、离心提取小孢子，加入秋水仙碱以诱变并加倍染色体，进行小孢 子培养见文献余风群等.提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究.作物 学报，1997， 23 (2): 165-168，获得双单倍体(DH)分离群体；
(3) 对双单倍体(DH)分离群体进行多年(三年)、多点(两个试验点湖北武汉，甘 肃和政)田间表型特征鉴定，考察株高、分枝特性、花序长度、角果数量、生育期共五个主 选性状，获得矮杆、株型紧凑、分枝及主花序短小簇生、花期集中、结荚层紧密的矮杆紧凑 型油菜品种。
(4) 利用分子标记方法对歩骤(3)的矮杆紧凑型油菜品种进一步鉴定。 其中，表性特征的鉴定方法如下。
选择株高为100cm左右；主花序有效长度为8cm左右，结角数量为40个左右，平均结 角密度每厘米5个左右； 一次分枝数约为5个左右，平均每个分枝长度为10 cm左右，结角 数为12个左右；无二次分枝；全株角果总数为100个左右；结角层长度为20 cm左右；开花 期为15天左右；同期角果成熟度为100%,植株冠幅小于0.013平方米(即长江流域JH常栽 培条件下每666.7平方米种植密度可以达到50000株以上)，若鉴定的油菜品种形态特征特性 与对照矮杆紧凑型油菜品种相似，表明该品种为矮杆紧凑型油菜或其衍生后代；若存在差异， 表明该材料为异品种。
分子标记鉴定方法包括如下歩骤 (1)选取待测品种(材料)及对照(矮杆紧凑型油菜)植物幼嫩叶片，-70^保存叶片总DNA的提取采用改良的SDS法进行见文献李佳等. 一种有效提取油菜叶片总DNA 的方法.华中农业大学学报，1994, 13(5): 521-523；DNA纯化采用苯酚-氯仿-异戊醇法见文 献:J.萨姆布鲁克等著.分子克隆实验指南(第二版).北京:科学出版社,1998, pp954-956; 纯化后的DNA-2(TC保存以用于分子鉴定。
(2)以待测品种及对照DNA为模版，进行SSR扩增见文献沈金雄等.甘蓝型油菜 SSR、 ISSR标记的遗传多样性及其与杂种表现的关系.中国农业科学,2004, 37(4): 477-483， 并对扩增产物进行电泳分离、银染鉴定见文献陆光远等.应用于油菜研究的简便银染AFLP 标记技术的构建.华中农业大学学报,2001, 20: 413-415。若待测品种的全部9对SSR引物扩 增的带型与对照矮杆紧凑型油菜带型完全相同，表明该材料为矮杆紧凑型油菜或其衍生后代； 若存在差异，表明该材料为异材料。
更具体的技术方案由以下所述
1、油菜小孢子培养方法
在油菜开花期取杂种F,主花序和上部分枝花序上2.8 3.8 mm的花蕾，放入已灭菌的小 烧杯中，加入70%酒精消毒1 min，再用0.1%升汞消毒10 min，然后用无菌水冲洗3次，每 次5min。取消毒好的花蕾放入试管中，加入1 ml的BsGu(含B5基本成分，蔗糖浓度为13%， pH为5.8)培养液，用玻棒碾成匀浆，经300目双层尼龙网过滤，用10 ml的离心管收集滤 液，1000rpm离心5min，去上清液，加入B5G13培养液悬浮小孢子，再离心，重复3次。去 上清液，用含50mg/L秋水仙碱的NLNu培养液(含NLN基本成分，附加13%蔗糖，pH5.8) 悬浮小孢子，并分装于150ml三角瓶中(每瓶40-45个花蕾，20 25ml培养液)，用灭菌的 尼龙纸封口 ，在32°C黑暗条件下培养48 h后用不含秋水仙碱的NLN13培养液稀释，分装于cp75 培养皿(每皿约5-6个花蕾，7.5ml培养液)，并转移至25'C黑暗条件下培养，当肉眼可见胚 状体时(约需2周)，换成摇床培养(25°C，黑暗)，转速为60卬m。小孢子培养约3周后， 胚状体转移至固体BsG2 (含B5基本成分，附加2%蔗糖，琼脂7.5g， pH 5.8)培养基上，置 于25'C下光照培养室(光照强度为30001ux)培养16h，进行分化成苗，成苗后用固体BsG2 培养基继代培养越夏，适时移栽至大田。
2、 SSR扩增及产物电泳分离、银染技术 (1) SSR扩增
以-20。C保存的待测油菜材料品种及对照(矮杆紧凑型油菜)DNA为模板，以下列反应 体系进行PCR扩增25 ng.W1样本总DNA 2 10 mmol丄-1 dNTPs 0.2 pl， 10x扩增缓冲液 (MBI公司产品)1 5 U T叫酶(MBI公司产品)0.1 pl， 25 mmol.L" Mg2+ 0.8 pl， 50 ，1" 引物(上下游引物混合液)0.5 pl， ddH20 5.4 ^l，总体积10pl。 PCR热循环程序为
95°C 2min; 1个循环；
94。C lmin; 60°C 30s，每循环降0.5。C; 72'C 45s; IO个循环； 94'C lmin; 55°C 30s; 72°C 45s; 36个循环;72 °C 10min， 1个循环； 常温保存。
取出扩增产物放置于4"C冷藏保存备用。
本发明中利用的9对SSR引物如下
上游引物5， TTG AAG TAG TTG GAG TAA TTG GAG G 3 ，
下游引物5'CAG CAG CCA CAA CCTTAC G 3，；
上游引物5'TGGATG AAA GCATCAACG AG 3，
下游引物5' ATC AAT CAA CAC AAG CTG CG 3';
上游引物5 ， GTG TGC AGG AAA CGA TGT TC 3 ，
下游引物5 ， GGG AGT TTG AAG AG A AAG CG 3';
上游引物5' CTTTGT GGT GGG TAG TGG 3，
下游引物5， ACT TAG CCT CAA TAC GGT CTT 3，；
上游引物5' AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3'
下游引物5' ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3，；
上游引物5， ACG GTG CCG AAT CTC AAC G 3'
下游引物5， AAA TGG GTC AC A GCC GAG AA 3，；
上游引物5，CCC GTC AAC CAA ATC AC A 3 ，
下游引物5 ， CGC AAG GTT GTT ATC TAA TC 3';
上游引物5， TCT CAA AAG GAT ATG CGT GAA 3，
下游引物5' C AA AAC TC A TC A GGG TTG TAG 3 ，；
上游引物5' AAG CGC GCA TAA CTA CAC 3'
下游引物5'AAC ACT GCT CCT TTC CCT 3'。 (2)扩增产物的电泳分离
用去污粉等清洁剂将玻璃板彻底洗净并晾干，用无水乙醇擦拭干净待用。在长玻璃板 (38x32.5cm)上用光滑的试纸均匀涂抹2 ml硅化液(AMRESCO公司产品)，在短玻璃板 (38x30.5cm)上均匀涂布1 ml反硅化液(95%乙醇，0.5%冰乙酸，2 ^反硅化剂)，10 min 后用沾有无水乙醇的试纸轻轻擦洗，除去多余的硅化液和反硅化液并晾干。然后将长、短玻 璃涂布有硅化液、反硅化液面朝内，以厚0.4mm的塑料边条隔开装配好电泳系统，并用底板 封闭其下方。迅速混匀50 ml变性凝胶液(含6%丙烯酰胺'7mol/L尿素'0.5xTBE缓冲液) 及200 nl 10%过硫酸钹和20 TEMED，用注射器将混合液从底板中间小孔缓缓注入'最后 于上部插入梳子并加压保护，凝聚大约2 h即可电泳。
取下底板，将其垂直固定于电泳槽底座上，上槽和下槽分别加入500ml 0.5xTBE缓冲液， 拔出梳子，接通电源稳压1 500V电泳预热30min，电泳所用仪器为Sequi-Gen sequencing cell (Bio-Rad,USA)。预热完成后，将梳齿朝下插入梳子，并冲洗点样孔。取出步骤(1)中4'C冷藏保存的扩增产物，加入等体枳的变性上样缓冲液(内含98%去 离子甲酰胺，10mmol/LEDTA, 0.005%二甲苯青FF， 0.005。/。溴酚蓝)，95。C变性3min后立 即冰浴冷却，上样后稳压1 500 V电泳40~60 min，待二甲苯青FF于1/3~1/2胶板处终止电泳。 (3)凝胶银染、显影
电泳完毕后，小心剥下胶板，用10%冰醋酸溶液(1L)固定30min或至二甲苯青FF蓝 色消失为止，然后用ddH20漂洗胶板2次，每次5 —10min。再用0.1%硝酸银溶液(1L。含 1-2 ml甲醛)染色30min，取出用ddH20迅速漂洗10 15s，然后用预冷的3%无水碳酸钠溶 液(1L。含1-2 ml甲醛，2mg/L硫代硫酸钠)显色，轻轻摇动至条带清晰可见，迅速取出放 回固定液(10%冰乙酸)中停止显影，再用ddH20漂洗l-5min，室温下自然晾干。 本发明的有益效果
本发明与背景技术相比，具有的有益效果是建立了快速有效的油菜设计育种技术体系， 并以此培育出适应高密度种植及机械化收获的矮杆紧凑型油菜育种材料，其利用将有利于降 低油菜种植成本；建立了科学、准确、客观、实用的油菜材料鉴定技术体系，为保护油菜育 种产权、新品种登记、鉴别和检测油菜材料的真实性、规范油菜种子经营市场等提供了技术 保障。


图l:矮杆紧凑型油菜的育种设计方法流程图。 图2:矮杆紧凑型油菜形态图。 图3:油菜与普通油菜的区别。
图4:引物上游引物5'CTTTGTGGTGGGTAGTGG3，，下游引物5'ACTTAG CCT CAATACGGTCTT3'扩增图谱，其中箭头所指为矮杆紧凑型油菜。
具体实施例方式
实施例l:矮杆紧凑型油菜育种设计与选育
(1) 杂交试验以华中农业大学选育的甘蓝型油菜5148-2 (该品系于2006年1月18 日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-P200601 ，专利申请号 200610018257.5)为母本，加拿大G Rakow教授提供的人工合成黄籽油菜DH系YN90-101参见文献Dargl J Somers等.Identification of molecular markers associated with linoleic acid desaturation in Z 譜w'co Theoretical and Applied Genetics, 1998, 96(6-7): 897-903: Dargl〗
Somers,等.Identification of a major gene and RAPD markers for yellow seed coat colour in 份aM化fl"op肌Genome, 2001,44: 1077-1082为父本进行杂交，得到杂种F,。秋季将亲本和 杂种F,种植于田间，杂种F,种植30株左右(2行〕。
(2) 建立双单倍体(DH)群体对歩骤(1)得到的F,植株主花序和上部分枝花序上 幼蕾的花粉进行小孢子培养见文献余风群等.提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某 些培养因素研究.作物学报，1997， 23(2): 165-168，利用秋水仙碱进行染色体加倍和诱变，得到331个双单倍体(简称DH)系群体。
(3)获得矮杆紧凑型油菜对331个DH系群体种植于田间进行株型、株高、分枝数、 主花序长度、主花序结角密度、全株角果总数、生育期等性状鉴定，发现编号为06-6585的 材料这些性状表现与其它材料不同，进行多点(湖北武汉、甘肃和政)、多年(2003-2006年) 鉴定，株型、株高、分枝及主花序、结荚层、开花期等性状十分稳定。这些性状具体表现为-. 株高100cm左右(60-120cm，普通油菜180cm左右)；主花序有效长度8cm左右(6-12cm)， 结角40个左右(30-80个)，平均结角密度每厘米5个左右(普通油菜主花序有效长度普遍 30cm以上，结角密度一般不超过1.5个/厘米)； 一次有效分枝5个左右(3-10个)，每个平均 长度10cm左右，结角12个左右(普通油菜一次有效分枝7-15个，平均每个结角40个左右)； 无二次分枝(普通油菜一般有二次分枝)；全株角果总数平均IOO个左右(普通油菜大多400 个左右)；结角层20cm左右(普通油菜超过40cm);开花期10-15天(普通油菜30天左右)； 角果成熟期基本一致(普通油菜上下层角果成熟不一致)。正常栽培条件下，本发明培育的矮 杆紧凑型油菜种植密度可超过50000株/亩(植株冠幅小于0.013平方米，普通油菜不超过15000 株/亩)。
实施例2:矮杆紧凑型油菜的鉴定
(1) 形态鉴定鉴定方法参照前述《发明内容》的记载。由于矮杆紧凑型油菜株型紧凑， 矮杆，主花序及分枝短小簇生，开花期集中，结荚层紧密，成熟期一致(附图2),与普通油
菜(附图3)区分十分明显。因此，株型形态性状等是鉴别矮杆紧凑型油菜及其衍生后代的
特征性状，利用形态性状可以鉴别矮杆紧凑型油菜及其衍生后代。
(2) 分子标记鉴定
①用于分子标记鉴定的油菜品种均来自于中国公开报道和应用的油菜品种，主要包括
浙双3号、华双3号、沪油17号、中双7号、中双9号、湘油15号、陕油8号、苏油3号、 宁油12号、豫油2号、甘油5号、新华8号、安康胜利油菜、华黄1号、云油8号、中油低 芥1号、农村27号、青油2号、万油17号、川油11号等待测油菜品种及矮杆紧凑型油菜植 株的幼嫩叶片，提取油菜幼嫩叶片总DNA;提取方法参考SDS法进行；DNA纯化采用苯酚
-氯仿-异戊醇法参见文献J.萨姆布鲁克等著.分子克隆实验指南(第二版).北京科学出
版社,1998， pp954-956；纯化后的DNA-2(TC保存以用于分子鉴定。
②以①中提取的待测品种DNA为模版，以下列反应体系进行PCR扩增25 ng^—1样本 总DNA2 pi, lOmmol'L" dNTPs 0.2 pl， l()x扩增缓冲液1 ^1， 5 U 7i g酶0.1 pl， 25 mmol-U1 Mg2+0.8^1， 50ng卞r1引物(上下游引物混合液)0.5^1， ddH20 5.4^1，总体积10 pl。 PCR
热循环程序为
95 °C 2min; 1个循环；
94°C lmin; 60。C 30s'每循环降0.5。C; 72°C 45s; 10个循环;94°C lmin; 55°C 30s; 72°C 45s; 36个循环；
72 。C 10min， 1个循环；
常温保存。
取出扩增产物放置于4'C冷藏保存备用。 用于矮杆紧凑型油菜分子鉴定的9对SSR引物如下 上游引物5， TTG AAG TAG TTG GAG TAATTG GAG G 3' 下游引物5， CAG CAG CCA CAA CCT TAC G 3'; 上游引物5， TGG ATG AAA GCA TCA ACG AG 3' 下游引物5， ATC AAT CAA CAC AAG CTG CG 3，； 上游引物5， GTG TGC AGG AAA CGA TGT TC 3' 下游引物5 ， GGG AGT TTG AAG AGAAAGCG3，； 上游引物5' CTT TGT GGT GGG TAG TGG 3 ， 下游引物5' ACT TAG CCT CAA TAC GGT CTT 3' ， 上游引物5' AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3' 下游引物5'ACC TCCATT GTG TCT GAT3，； 上游引物5'ACG GTG CCG AAT CTC AAC G 3， 下游引物5， AAA TGG GTC ACA GCC GAG AA 3'; 上游引物5' CCC GTC AAC CAA ATC ACA 3， 下游引物5 ， CGC AAG GTT GTT ATC TAA TC 3'; 上游引物5' TCT CAA AAG GAT ATG CGT GAA 3' 下游引物5' CAA AAC TCA TCA GGG TTG TAG 3 ，； 上游引物5' AAG CGC GCA TAA CTA CAC 3' 下游弓1物5， AAC ACT GCT CCT TTC CCT 3，。
③用去污粉等清洁剂将玻璃板彻底洗净并晾干，用无水乙醇擦拭干净待用。在长玻璃板 (38x32.5cm)上用光滑的试纸均匀涂抹2 ml硅化液(AMRESCO公司产品)，在短玻璃板 (38x30.5cm)上均匀涂布1 ml反硅化液(配方95%乙醇，0.5。/。冰乙酸，2 ^反硅化剂)， lOmin后用沾有无水乙醇的试纸轻轻擦洗，除去多余的硅化液和反硅化液并晾干。然后将长、 短玻璃涂布有硅化液、反硅化液面朝内，以厚0.4mm的塑料边条隔开装配好电泳系统，并用 底板封闭其下方。迅速混匀50 ml变性凝胶液(含6%丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5><TBE缓 冲液)及200 nl 10%过硫酸铰和20 td TEMED，用注射器将混合液从底板中间小孔缓缓注入， 最后于上部插入梳子并加压保护，凝聚大约2 h即可电泳。
取下底板，将其垂直固定于电泳槽底座上，上槽和下槽分别加入500ml0.5xTBE缓冲液， 拔出梳子，接通电源稳压1 500V电泳预热30min，电泳所用仪器为Sequi-Gen sequencing cell (Bio-Rad,USA)。预热完成后，将梳齿朝下插入梳子，并冲洗点样孔。取出步骤②中4TT冷藏保存的扩增产物，加入等体积的变性上样缓冲液(98%去离子甲酰 胺，10mmol/LEDTA， 0.005%二甲苯青FF， 0.005%溴酚蓝)，95。C变性3 min后立即冰浴冷 却，上样后稳压1 500 V电泳40-60 min，待二甲苯青FF于1Z3 1/2胶板处终止电泳。
④电泳完毕后，小心剥下胶板，用10%冰醋酸溶液(1L)固定30min或至二甲苯青FF 蓝色消失为止，然后用ddH20漂洗胶板2次，每次5 10min。再用0.1%硝酸银溶液(1L。 含1-2 ml甲醛)染色30 min,取出用ddH20迅速漂洗10 15s，然后用预冷的3%无水碳酸 钠溶液(1L。含l-2ml甲醛，2mg/L硫代硫酸钠)显色，轻轻摇动至条带清晰可见，迅速取 出放回固定液(10%冰乙酸)中停止显影，再用d胆20漂洗l-5min，室温下自然晾干，备用。 比较待测品种SSR扩增带型与矮杆紧凑型油菜的带型(附图4)，若9对SSR引物扩增 的带型与矮杆紧凑型油菜完全相同，表明该品种为矮杆紧凑型油菜或其衍生后代，若存在差 异，则为异品种。
权利要求
1、选育适应于高密度种植和机械化收获的矮杆紧凑型油菜的方法，其步骤如下(1)以保藏编号为CCTCC-P200601的甘蓝型油菜品种5148-2为母本，以加拿黄籽油菜DH系品种YN90-1016为父本进行杂交，得到杂种F1；(2)于油菜开花期取杂种F1植株主花序和上部分枝花序上大小为2.8-3.8mm的幼蕾提取小孢子，以50mg/L的秋水仙碱加倍染色体48小时，通过小孢子培养获得双单倍体(DH)分离群体；(3)对步骤(2)的分离群体进行三年、每年两个试验点田间表型特征鉴定，选择株高、分枝特性、花序长度、角果数量、生育期五个主选性状与普通油菜存在差异的表型为矮杆、株型紧凑、分枝及主花序短小簇生、花期集中和结英层紧密的油菜变异类型材料，得到矮杆紧凑型油菜品种；(4)利用分子标记方法对步骤(3)的矮杆紧凑型油菜品种进一步鉴定。
2、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的分子标记鉴 定步骤如下 (1 )选取待测品种及对照为矮杆紧凑型油菜的植物幼嫩叶片，用SDS法提 取叶片总DNA,采用苯酚-氯仿-异戊醇法纯化总DNA以进行PCR鉴定； (2)以步骤(1)中提取的待测品种DNA为模版，按照下列反应体系进行 SSR扩增25 ng.^r1样本总DNA2 pi, 10 mmol.U1 dNTPs 0.2 pi, lOx扩增缓冲 液1 pi, 5 U 7h《酶0.1 pl， 25 mmol-i;1 Mg2+ 0.8 pi, 50 ng卞r1引物(上下游引 物混合液)0.5^, ddH20 5.4^，总体积10 pl。 PCR热循环程序为 95 °C 2min; 1个循环； 94。C lmin; 60。C 30s,每循环降0.5。C; 72°C 45s; IO个循环； 94。C lmin; 55°C 30s; 72°C 45s; 36个循环； 72 。C lOmin， 1个循环； 常温保存； (3)扩增产物加入等体积的变性上样缓冲液，95。C变性3 min后立即冰浴 冷却，然后在预先制好的丙烯酰胺变性凝胶板上加样，再在1 500V稳压条件下电泳40~60 min后终止电泳；(4 )小心剥下胶板，经过冰醋酸固定、ddH20漂洗、硝酸银溶液染色、ddH20 漂洗、无水碳酸钠溶液显影、冰乙酸停影、ddH20漂洗等过程，将分离的DNA 指紋用于鉴定；(5)比较待测品种SSR扩增带型与矮杆紧凑型油菜的带型的差异；用于矮杆紧凑型油菜SSR鉴定的引物如下上游引物〗 下游引物f上游引物 下游引物TTG A AG TAG TTG GAG TAA TTG GAG G 3， CAG CAG CCA CAA CCT TAC G 3，；TGG ATG AAA GCA TCA ACG AG 3， ATC AAT CAA CAC AAG CTG CG 3，上游引物5， GTG TGC AGG AAA CGA TGT TC 3，下游引物5' GGGAGTTTGAAGAGAAAGCG3';上游引物5， CTT TGT GGT GGG TAG TGG 3'下游引物5' ACT TAG CCT CAA TAC GGT CTT 3';上游引物5， AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3'下游引物5' ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3';上游引物5， ACG GTG CCG AAT CTC AAC G 3，下游引物5' AAA TGG GTC ACA GCC GAG AA 3';上游引物5， CCCGTCAACCAAATCACA3'下游引物5' CGC AAG GTT GTT ATC TAA TC 3，；上游引物5， TCT CAA AAG GAT ATG CGT GAA 3，下游引物5， CAA AAC TCA TCA GGG TTG TAG 3'上游引物5' AAG CGC GCA TAA CTA CAC 3'下游引物5' AAC ACT GCT CCT TTC CCT 3'。
全文摘要
本发明属于油菜育种领域。公开了一种适应高密度种植和机械化收获的新型矮杆紧凑型油菜的选育及鉴定方法。以华中农业大学选育的保藏号为CCTCC-P200601的油菜品种5148-2和加拿大人工合成的黄籽油菜DH系YN90-1016为亲本杂交，得到F₁。开花期选用F₁植株主花序和上部分枝上大小在2.8-3.8mm的花蕾，用秋水仙碱加倍染色体，小孢子培养获得双单倍体分离群体。对分离群体进行多年多点田间表型特征鉴定，选择株高、分枝特性、花序长度、角果数量、生育期五个主选性状与普通油菜存在差异的表型为矮杆、株型紧凑、分枝及主花序短小簇生、花期集中和结荚层紧密的油菜变异类型材料，得到矮杆紧凑型适于机械化收获的油菜新品种。本发明还公开了分子鉴定方法。
文档编号C12Q1/68GK101292626SQ20081004809
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者傅廷栋, 刘志文, 静 文, 斌 易, 李新华, 军 杨, 沈金雄, 涂金星, 漆丽萍, 马朝芝 申请人:华中农业大学