专利名称：基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定金属铅离子的方法
技术领域：
本发明涉及基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定金属铅离子 的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
核酸酶是具有催化功能的寡聚核苷酸(参考文献Robertson, D. L.; Joyce, G. F.， Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.脂匿1990， 344， (6265)， 467-468; Joyce, G. F., Directed evolution of nucleic acid enzymes, ^4w皿Wev. 肠c/zem. 2004， 73, 791-836; Breaker, R. R.， DNA enzymes.脂. 胸e如/. 1997， 15, (5)， 427-431)，其可催化的反应范围很广，包括 对核酸碱底物的剪切反应、DNA连接反应、磷酸化反应、卟啉金属 化反应等。恰如一些蛋白质类型的酶，其催化活性与金属离子辅因子 有关， 一些核酸酶的催化活性也与特定的二价金属离子密切相关。人 们利用核酸酶的这种性质，发展了各种基于核酸酶检测金属离子的方 法。譬如，17E型核酸酶的催化活性具有铅离子特异性，因而在铅离 子检测方面得到了广泛应用(参考文献Li， J.; Lu, Y., A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. /力m. C/zew. 2000， 122, (42), 10466-10467)。
铅离子是常见的一种有害重金属离子，故其监测/检测对人类健康
和环境监测都有着十分重要的意义。过去几十年中，人们已经发展了 如原子吸收/发射光谱、电化学方法、荧光光谱、质谱等多种方法对 铅离子进行监测/检测。近来，基于对铅离子有特异性的17E型核酸
酶，研究人员应用各种电化学方法(参考文献Xiao,Y.;Rowe,A.A.; Plaxco, K. W.， Electrochemical detection of parts-per-billion lead via an electrode-bound DNAzyme assembly. / 」w. C/2em. Soc. 2007， 129, (2), 262-263)和荧光方法(参考文献Chiuman, W.; Li， Y. F., Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Wwc/e/d油to. 2007， 35， (2), 401-405)来检测 铅离子。
较之其它方法，比色方法更为简单，无需使用特殊的分析仪器， 因而受到研究人员的日益青睐。近来，研究人员17E型核酸酶作为铅 离子识别元，而用金纳米粒子作为探针，发展了多种比色方法以测定 铅离子(参考文献Liu, J.; Lu， Y.， Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. iV齒re Pratoco/s 2006， 1, (1 )， 246-252; Liu， J. W.; Lu， Y., A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. /爿m. C72泄Soc. 2003， 125, (22), 6642-6643)。这些比色传感器需要 将含巯基的17E型核酸酶(或其底物)修饰在GNPs表面，还需进一 步分离除去游离的17E型核酸酶(或其底物)。这些修饰操作费时费 力。若能免去这种修饰操作，设计免修饰的金纳米比色传感器，则可 以大大简化实验操作，能有效提高实验效率。
Rothberg研究小组近来发展了一种新型无标记的金纳米比色DNA 传感器。他们的传感器设计基于单双链DNA在金纳米表面有着的不 同吸附行为(参考文献Li， H. X.; Rothberg， L., Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.尸rac. 7Va//.爿cad 5W. <7&4 2004， 101, (39), 14036-14039; Li, H. X.; Rothberg, L. J., Label-free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA amplified by the polymerase chain reaction. / 勘.C7z缀 2004, 126, (35),
10958-10961) c
发明内容
基于和Rothberg等人研究工作类似的原理，本发明提供了一种 基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子的方法。此免标记金 纳米比色方法具有简单、灵敏的特点。
该方法可用于铅离子的简单、灵敏、特异性比色检测，从500纳 摩尔每升到1000微摩尔每升浓度范围内对铅离子检测呈现好的响 应，检测限为500纳摩尔每升。
图1为利用金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子的示意 图。从图1可知，首先，17E型核酸酶与其底物杂交，形成双链结构。 之后，若待测样品中含铅离子时，则铅离子能够极大地提高17E型核 酸酶催化切断底物的速度，底物被切断后，双链结构解离产生游离的 单链DNA，此单链DNA可吸附在金纳米探针表面，保护其不被盐诱 导聚集，故金纳米探针溶液呈酒红色；若待测样品中不含铅离子时，
则17E型核酸酷与其底物的双链结构不会被破坏，此双链结构不与 金纳米探针作用，故金纳米探针会被盐诱导聚集而呈蓝紫色。这样， 通过金纳米探针颜色的变化，能够实现铅离子的检测。
利用金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子的步骤如下
(1 )用参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献；Grabar， K. C.; Freeman, R. G.; Hommer, M. B.; Natan， M. J.， Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers. Jwg/. CVzem. 1995, 67， (4)， 735-743);
(2) 在含有140 mM的NaCl, 5 mM KC1和20 mM pH=7.5的 三羟甲基氨基甲垸-盐酸缓冲溶液中，配制17E型核酸酶与其底物的 溶液；17E型核酸酶的序歹ij为5， CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG AGT 3，； 17E型核酸酶底物的序列为5， ACT CAC TAT /v4 GGA AGA GAT G 3，；
(3) 将1 的17E型核酸酶及1 |iM的17E型核酸酶底物混 合均匀，在90。C水浴反应5分钟，降至室温，得到lpM双链产物； 在4°C存放备用；所述的1 的17E型核酸酶1 ^M17E型核酸酶 底物的体积比为1:1;
(4) 取l |aM (3)中双链产物，加入铅离子溶液，4。C反应10 分钟；所述的1 |lM双链产物铅离子溶液的体积比为2: 1;待测
铅离子的浓度范围可从500纳摩尔每升到1000微摩尔每升；
(5) 将(4)中的反应液与13 nm金纳米探针溶液混合，室温 反应5分钟；所述的(4)中反应液13 nm金纳米探针溶液的体积
比为1: 5;
(6)接着向(5)中的反应液中，加入0.5 M的氯化钠溶液；加 入氯化钠后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶 液的颜色变化，完成基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定金属铅 离子的方法；所述的0.5M氯化钠溶液13nm的金纳米探针溶液体 积比为1: 10。
利用本发明的比色方法对铅离子检测的表征如图2和图3所示。 从图2数据可以看出，我们的方法对于铅离子有很好的比色响
应；通过金纳米探针溶液的颜色变化，很容易用肉眼进行铅离子的比
色检测。
从图3数据可以看出，比色的响应与铅离子的浓度有很好的相关 性；该方法对于铅离子的检出限为500纳摩尔每升。
为考察利用金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子方法的 特异性，按步骤如下进行了对比实验
(1) 参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献Grabar, K. C.; Freeman, R. G.; Hommer, M. B.; Natan, M J.， Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers, /iwa/. C/2ew. 1995， 67, (4), 735-743);
(2) 在含有140 mM的NaCl, 5 mM的KC1和20 mM pH=7.5 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，配制17E型核酸酶与其底物 的溶液；17E型核酸酶的序列为5' CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG AGT 3'; 17E型核酸酶底物的序列为5' ACT
C AC TAT /v4 GGA AG A GAT G 3,;
(3) 将1 (iM 17E型核酸酶及1 ^M17E型核酸酶底物混合均匀， 在90 。C水浴反应5分钟，降至室温，得到l )iM双链产物；4。C存 放备用；所述的1 nM 17E型核酸酶1 ^M17E型核酸酶底物的体积 比为1: 1;
(4) 取1 的(3)中双链产物，加入50 pM的不同的金属离 子，4°C反应10分钟；所述的1 pM双链产物金属离子溶液的体 积比为2: 1;
(5) 将(4)中的反应液，与13 nm金纳米探针溶液混合，室 温反应5分钟；所述的(4)中反应液13 nm金纳米探针溶液的体 积比为1: 5;
(6) 接着向(5)中的反应液中，加入0.5M氯化钠溶液；加入
氯化钠后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液
的颜色变化；所述的0.5M氯化钠溶液13 nm的金纳米探针溶液体
积比为1: 10。
利用本发明的比色方法对于铅离子检测特异性的表征如图4所示。
从图4数据可以看出，Mg2+、 Ca2+、 Mn2+、 Cd2+、 N产和012+对 该金纳米比色方法没有响应，Z^+和Co^有微弱的响应，这证明该方 法对铅离子的比色检测有好的特异性。
本发明的有益效果本发明中我们利用无修饰的金纳米探针，实 现了基于核酸酶对铅离子的简单灵敏的比色检测。该方法具有如下优
势l)通过金纳米探针颜色的变化，可以方便地进行铅离子检测；2) 制备金纳米探针所需原料廉价易得；3)金纳米探针无需进行修饰， 省去了修饰和分离的操作；4)进一步拓宽了免标记金纳米探针比色 传感器的应用范围。
图1为利用金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子的示意
图。图中，绿色线条为17E型核酸酶链，中间有红色片段的黑色线条 为底物链。
图2为利用金纳米探针进行铅离子比色测定的照片。左，不含铅
离子；右，含50一铅离子。
图3为吸收比率(A620/A520)与铅离子浓度的关系图。 图4为含50 nM不同金属离子(或者缓冲溶液)的样品先与17E
型核酸酶及其底物的杂交双链反应，接着加入200 pL金纳米探针，
再加入20nL0.5M氯化钠后所测得吸收比率(A620/A520)。
具体实施例方式
实施例l
利用金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子的步骤如下
(1) 参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献；Grabar， K. C.; Freeman, R. G.; Hommer， M. B.; Natan, M. J.， Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers, ^wa/. C7z缀1995， 67, (4)， 735-743);
(2) 在含有140 mM的NaCl, 5 mM的KC1和20 mM pH=7.5
的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，配制17E型核酸酶与其底物
的溶液；17E型核酸酶的序列为5， CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG AGT 3'; 17E型核酸酶底物的序列为5， ACT CAC TAT M GGA AGA GAT G 3 ，；
(3) 将1 的17E型核酸酶及1 的17E型核酸酶底物混 合均匀，在90。C水浴反应5分钟，降至室温，得到liaM双链产物； 4。C存放备用；所述的1 17E型核酸酶1 ^M17E型核酸酶底物 的体积比为l: 1;
(4) 取1 uM (3)中的双链产物，加入铅离子溶液，4°C反应
IO分钟；所述的l 双链产物铝离子溶液的体积比为2: 1;待
测铅离子的浓度范围可从500纳摩尔每升到1000微摩尔每升；
(5) 将(4)中的反应液与13 nm金纳米探针溶液混合，室温 反应5分钟；所述的(4)中反应液13 nm金纳米探针溶液的体积 比为h 5;
(6) 接着向(5)中的反应液中，加入0.5M氯化钠溶液；加入 氯化钠后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液 的颜色变化，完成基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定金属铅离 子的方法；所述的0.5M氯化钠溶液13 nm的金纳米探针溶液体积
比为1: 10。
实施例2
为考察利用金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子的方法 特异性，按步骤如下进行了对比实验
(1) 参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献Grabar, K. C.; Freeman, R. G.; Hommer， M. B.; Natan, M. J.， Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers. Jwa/. Ozew. 1995， 67, (4), 735-743);
(2) 在含有140 mM的NaCl, 5 mM的KC1和20 mM pH=7.5 的三羟甲基氨基甲垸-盐酸缓冲溶液中，配制17E型核酸酶与其底物 的溶液；17E型核酸酶的序列为5' CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG AGT 3'; 17E型核酸酶底物的序列为5' ACT CAC TAT M GGA AGA GAT G 3 ，；
(3) 将1 17E型核酸酶及1 ^M17E型核酸酶底物混合均匀， 在90 。C水浴反应5分钟，降至室温，得到l pM双链产物；4。C存 放备用；所述的1 pM 17E型核酸酶1 ^M17E型核酸酶底物的体积 比为h h
(4) 取1 的(3)中双链产物，加入50 pM的不同的金属离 子，4。C反应10分钟；所述的1 双链产物金属离子溶液的体
积比为2: 1;
(5) 将(4)中的反应液与13 nm金纳米探针溶液混合，室温 反应5分钟；所述的(4)中反应液13 nm金纳米探针溶液的体积 比为h 5;
(6) 接着向(5)中的反应液中，加入0.5M氯化钠溶液；加入 氯化钠后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液 的颜色变化；所述的0.5 M氯化钠溶液13 nm的金纳米探针溶液体 积比为1: 10。
权利要求
1、基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定铅离子的方法，其特征在于，步骤和条件如下(1)用参考文献方法合成13nm的金纳米探针(参考文献；Grabar，K.C.；Freeman，R.G.；Hommer，M.B.；Natan，M.J.，Preparation andCharacterization of Au Colloid Monolayers.Anal.Chem.1995，67，(4)，735-743)；(2)在含有140 mM的NaCl，5 mM KCl和20 mM pH＝7.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，配制17E型核酸酶与其底物的溶液；17E型核酸酶的序列为5’CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTCGAA ATA GTG AGT 3’；17E型核酸酶底物的序列为5’ACT CACTAT rA GGA AGA GAT G 3’；(3)将1μM的17E型核酸酶及1μM的17E型核酸酶底物混合均匀，在90℃水浴反应5分钟，降至室温，得到1μM双链产物；在4℃存放备用；所述的1μM的17E型核酸酶1μM17E型核酸酶底物的体积比为11；(4)取1μM(3)中双链产物，加入铅离子溶液，4℃反应10分钟；所述的1μM双链产物铅离子溶液的体积比为21；待测铅离子的浓度范围可从500纳摩尔每升到1000微摩尔每升；(5)将(4)中的反应液与13nm金纳米探针溶液混合，室温反应5分钟；所述的(4)中反应液13nm金纳米探针溶液的体积比为15； (6)接着向(5)中的反应液中，加入0.5 M的氯化钠溶液；加入氯化钠后，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定金属铅离子的方法；所述的0.5 M氯化钠溶液13nm的金纳米探针溶液体积比为110。
全文摘要
本发明涉及基于金纳米探针和核酸酶无标记比色测定金属铅离子的方法。17E型核酸酶与其底物杂交形成双链结构。若待测样品中含铅离子时，则铅离子能够极大地提高17E型核酸酶催化切断底物的速度，底物被切断后，双链结构解离产生游离的单链DNA可吸附在金纳米探针表面，保护其不被盐诱导聚集，故金纳米探针溶液呈酒红色；若待测样品中不含铅离子时，则17E型核酸酶与其底物的双链结构不会被破坏，此双链结构不与金纳米探针作用，故金纳米探针会被盐诱导聚集而呈蓝紫色。通过金纳米颜色的变化，能够实现铅离子的检测。对于铅离子的检出限为500纳摩尔每升。此种比色方法检测铅离子，选择性高、灵敏度高、操作简单、无需复杂仪器。
文档编号C12Q1/68GK101363795SQ20081005106
公开日2009年2月11日 申请日期2008年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者敬 李, 李冰凌, 汪尔康, 董绍俊, 辉 魏 申请人:中国科学院长春应用化学研究所