专利名称：一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。
背景技术：
半纤维素酶是降解木糖、葡糖糖、甘露糖和五碳糖的一组酶的总称。木聚糖酶是 半纤维素酶的主要酶之一。木聚糖酶是一组可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶 系。由于木聚糖分子结构复杂，含有许多不同的取代基。因此，木聚糖的生物降解就 需要一个复杂的酶系统中不同组分之间的协同作用，才能将其转化为基本单糖。作用 于主链的有两种酶P -1， 4-内切木聚糖酶和e -木糖苷酶。
(1 ) e -1, 4-内切木聚糖酶f em/o- 7,4- "- Z)-xy/aray/a"o/^士o/a", 五C3.2丄&」， 一般而言，内切木聚糖酶的作用是切开木聚糖主链内的糖苷链，降低基质的聚合度。 在内切木聚糖酶作用的前期，所形成的主要产物是聚合度较大的低聚木糖，随着水解 的深入主要生成木三糖、木二糖，但一般不会生成木糖。
(2) e-木糖苷酶W-xj;/ara:j;/o/^&o/必e,EC3.27.37y) ， P-木糖苷酶，是木聚糖 的外切水解酶，主要水解短链的低聚木糖或木二糖，并从非还原性末端释放出木糖。 木二糖是此酶的最后底物，酶对低聚木糖的亲和性随聚合度的增加而降低。
作为粗纤维的一种，半纤维素广泛应用于饲料当中。但单胃动物从日粮中摄取的 半纤维素会在肠道中形成高黏性多糖，从而阻止蛋白质、脂肪的消化吸收，降低饲料 的转化率。同时高黏度多糖通过改变肠细胞转换速率、内源性酶合成速率、微生物区 系及球虫数量来影响动物的生产性能。半纤维素酶能将植物细胞壁中半纤维素分解成 葡萄糖，同时还可解除细胞壁对其他营养成分的封阻作用，所以在饲料中添加半纤维 素酶具有非常重要的意义。
由黑曲霉发酵产生的微生物半纤维素酶能够提高肉鸡对大豆粕中粗纤维的利用 率。但在相当长的历史时期内，由于生产成本高、活性低、稳定性差等问题， 一直未能进入实用阶段。随着生物技术和发酵工艺的发展，发达国家环保意识的提高，半纤 维素酵的研究和应用重新被提到议事日程上来。目前微生物半纤维素酶己在西欧和各 国广泛地用于畜禽生产。以往工业上生产的半纤维素酶是以自然界存在的微生物产生 具有高性能的自然酶为基础。现通过基因工程技术，用经选择在廉价原料中容易培养 并且发酵液中容易纯化酶的宿主微生物来生产。通过基因工程技术可在生物体间转移 基因，而且还可以修饰结构基因，从而使生产过程易进行，并可按应用要求剪接得到 具有特有性能的酶。国内外对半纤维素酶展开了大量的研究，研究的领域不断扩大， 取得了许多进展。近十几年来，人们对真菌半纤维素酶基因的克隆与表达做了大量的 研究。黑曲霉(Aspe/^iW^加^e^所产生的半纤维素酶的降解作用日益受到重视，国
内外对这方面的研究也日益增多。随着转基因技术的不断成熟，黑曲霉木聚糖酶基因 在基因工程上的应用，逐渐引起人们的关注。
粟酒裂殖酵母OS^owZ^是一种单细胞的、真核生物，拥有同高等生物极其相似的 属性染色体结构和功能、细胞循环的控制以及RNA的拼接，这些属性使S.pom^成为 生产真核蛋白的理想系统。用粟酒裂殖酵母作为宿主直到最近才引起重视，国外目前 利用裂殖酵母成功表达外源蛋白的例子很多，但国内研究报道极少。2002年2月基因组 的测序及其各基因功能的取得更有利于研究外源蛋白在粟酒裂殖酵母中的表达。 S./ww&被用来通过基因互补来克隆真核基因，意味着在S.; om&中异质基因的表达是 活跃的。利用各种表达构建大量的po(ycw^ Wmy m/t^/e-艰原、f/ze /wwaw 朋础raw6/"i7/、 Ae /z騰朋//ver e/7ox/iife /^t/ra/aye、 Ae / 謹朋Wood coagw/ario" ZTZ/a、 Ae A麵朋 /zj ocoWn /、 ra, <arg//7<xye、 ra/ M)尸-zt/waye、 /"敏/6油> -6(7丄-6)、爿ra6油戸'51 /7a/细a swgar的"5poWer ST尸7等高等真核基因，已在 5".; ow^被表达和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。 本发明所提供的重组粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建含有半纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。
本发明所提供的重组粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法是将半纤维素酶基因插入到 粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的重组粟酒裂殖酵母表达质粒导入粟 酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使半纤维素酶 基因得到分泌表达。
本发明所述的半纤维素酶基因来源于黑曲霉基因组DNA，本发明提供了适用于黑 曲霉基因组DNA的提取方法。
本发明所述的两种半纤维素酶基因内切木聚糖酶基因XYNB，其序列如SEQ ID NO.l所述；木糖苷酶基因XLND,其序列如SEQIDN0.2所述。
本发明所提供的表达半纤维素酶基因的系统为五S尸表达系统，采用pESPUC质粒作 为表达载体。这种质粒源自尸祝"^"^// 噬菌粒且由如下四部分组成(1)一个Co/五7 复制起始点和氨苄青霉素抗性基因(aw^"7/z力ww'rfa"ce.v4m/ +)，其允许在大肠杆菌克隆 时进行载体的复制和抗生素选择；(2)—个wW序列可以提供在粟酒裂殖酵母OS.pom&) 中使载体自动复制所需要的复制起始点；(3)选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母 (&cem^/ae)可以作为向粟酒裂殖酵母(S.p頻&)细胞中转化表达结构的选择标定物；(4) 一个表达盒，包括粟酒裂殖酵母(S.p画&)全长的nmtl启动子(P訓u)-终止子(T腦u)，和一 个多克隆位点(multiple cloning site,MCS)。 pESPUC物理图谱如图l所示。
本发明所述半纤维素酶XYNB基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的多克隆位 点处的XhoI和SalI限制性内切酶酶切位点之间。
本发明所述半纤维素酶XLND基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的多克隆位 点处的BamHI和NotI限制性内切酶酶切位点之间。
本发明所述筛选标记有两种， 一种为氨苄青霉素抗性基因(am/^c///^ myiWawce ^mp+)，其允许在大肠杆菌克隆时进行载体的复制和抗生素选择； 一种为选择标记基因 LEU2-d，源自酿酒酵母可以作为向粟酒裂殖酵母0S.;ww6e)细胞中转化表达结构的选择
标定物。体，构建含有XYNB基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体为 pESPUC-XYNB，获得的重组粟酒裂殖酵母工程菌为SP-Q01/pESPUC-XYNB;以 pESPUC为出发载体，构建含有XLND基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体为 pESPUC-XLND,获得的重组粟酒裂殖酵母菌株为SP-QO 1/pESPUC-XLND。
本发明所提供的半纤维素酶基因表达的方法,是将构建的含有半纤维素酶基因的重 组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-XYNB和pESPUC-XLND采用电穿孔法导入粟酒裂殖 酵母中。培养重组粟酒裂殖酵母时，无需加入诱导物，半纤维素酶基因前端自带信号 肽序列，可以使半纤维素酶基因分泌表达，重组酵母表达的时间为3-6天。
本发明具有以下优点本发明所提供了具有高半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工 程菌及其构建方法，弥补了传统半纤维素酶制备方法以及原核表达系统、其他酵母表
达系统的不足。
(1) 传统半纤维素酶制备方法采用天然和诱变菌株发酵生产，成本高；另一方面 表现在酶的有效性差，应用效果不稳定。
(2) 虽然粟酒裂殖酵母属于酵母类，但粟酒裂殖酵母与其它的酵母相比在进化上 更高级，其类似的操作技术也能应用于其它的酵母，但很多性质不同于芽殖的酿酒酵 母，如本发明所用的是含有内含子的半纤维素酶基因转入酿酒酵母中不能表达，但同 样的基因在粟酒裂殖酵母中却获得了表达，其产物表达水平高，可直接分泌到培养基 中，并具有正常的生物学活性。这样在进行工程菌构建时就不需要提取真菌总RNA在 进行反转录来克隆半纤维素酶基因，只需要提取其总基因组DNA，成本低、省时省 力。
(3) 本发明所用的粟酒裂殖酵母表达菌株是SP-QOl，是用于ESP酵母表达和纯化 系统中的单倍体菌株，含有h—交配型的和leul-32基因型，这个表达菌株包括一个变异的 LEU1基因，它编码亮氨酸生物合成必备的3-丙基脱氢酶，LEU1基因突变导致亮氨酸营 养缺陷。而选用的表达载体却含有选择标记基因LEU2-d，就可以通过基因互补直接对 转化子进行筛选，提高了筛选效率；而毕赤酵母系统需要用价格昂贵的抗生素进行筛选。
(4)本发明所获得的工程菌在进行培养使半纤维素酶基因获得表达时，无需加入 诱导物，半纤维素酶基因是否表达被培养基中硫胺(维生素B1)的浓度严格调控，当培 养基中含X).5nM硫胺时，Pnmt,就被强烈的抑制，半纤维素酶基因不表达，而当培养基
中不含硫胺时启动子的诱导率约为400倍，半纤维素酶基因高度表达。并且半纤维素酶 基因前端自带信号肽序列，可以使半纤维素酶基因分泌表达。结果如图10所示，两种 重组酵母转化子在培养96h以内的时间里有半纤维素酶酶活性，目的基因表达最高水平 出现在36-96h， SP-Q01/pESPUC-XYNB在培养0-60h间酶活逐渐升高，在培养60h达到 最高，分别为155U/mL，从60h到94h酶活逐渐降低；SP-Q01/pESPUC-XLND在培养 0-72h间酶活逐渐升高，在培养72h达到最高为86U/mL ，从72h到96h酶活逐渐降低。 此外，若将发明应用于工业化半纤维素酶的生产，则具有酶活性高，热稳定性 强，生长周期短，提取成本低的优点，从而可以提高畜禽生产性能和减少排泄物的污 染，同时也为开辟新的饲料资源、降低饲料生产成本提供了有效的途径。
图1为粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的物理图谱。
图2a为含有半纤维素酶XYNB基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体构建流程图。
图2b为含有半纤维素酶XLND基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体构建流程图。
图3为黑曲霉基因组DNA。
图4a为XYNB基因PCR扩增结果。
图4b为XLND基因PCR扩增结果。
图5a为重组克隆载体pMD18-T-XYNB的PCR和酶切鉴定。
图5b为重组克隆载体pMD18-T-XLND的PCR和酶切鉴定。
图6a为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-XYNB的PCR和酶切鉴定。
图6b为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-XLND的PCR和酶切鉴定。
图7a为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-XYNB的电穿孔转化子。图7b为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-XLND的电穿孔转化子。 图8a为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XYNB质粒DNA的PCR鉴定。 图8b为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XLND质粒DNA的PCR鉴定。 图9为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-QO 1 /pESPUC-X YNB和SP-QO1 /pESPUC-XLND和 SP-Q01/ pESPUC表达产物的SDS-PAGE分析。
图10a为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XYNB、 SP-Q01/pESPUC-XLND不同
培养时间酶活力测定结果。
图10b为重组粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XYNB、 SP-Q01/pESPUC-XLND最适
培养温度酶活力测定结果。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例l、黑曲霉半纤维素酶基因的克隆 1、黑曲霉基因组DNA的提取
察氏培养基(PH=7.2) : 30g蔗糖，3g硝酸钠,0.5g硫酸镁，0.5氯化钾，0.01 g硫酸亚 铁，lg磷酸氢二钾，13g琼脂，加蒸馏水至1L。
(1) 菌丝的培养用察氏固体培养基培养黑曲霉3-5天,然后用察氏液体培养基培 养3天，28°C、 190r/min。
(2) 离心收集菌体，收集的菌体先用蒸馏水洗涤三次，然后真空抽干。
(3) 向1.5ml离心管中加入0.3mlCTAB提取液，然后将其置于65"水浴锅中预热。
(4) 取上述干燥后的菌体0.03g，用液氮研磨迅速研磨成粉。
(5) 将冻粉迅速转入提取液中，尽快用移液枪混匀，在65。C水浴30min，期间轻 轻摇动几次(防止DNA断裂)。
(6) 取出离心管，冷至室温，每管加入等体积氯仿/异戊醇(24: 1)，轻轻颠倒 混匀，静止10min， 10000rpm、离心10min。
(7)吸取上清夜于另一新离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min，然后10000rpm、离心10min去上清。
(8) 分别用70%、 80%酒精洗涤沉淀，将沉淀吹干。
(9) 力口100plTE缓冲液回溶DNA沉淀(不要反复吸打，用手指轻弹)，同时加入终 浓度50nl/mgRNase，置37。C处理lh。
(10) 加入等体积的氯仿/异戊醇(24: 1)抽提l-3次。
(11) 吸取上清，加入l/10体积0.3mol/l的NaAc和2倍体积的无水乙醇，-20°。放置111 左右，12000rpm 、离心10min除去上清夜。
(12) 用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后，溶于30pl去离子水中形成DNA提取液。
13)抽取2111进行1%琼脂糖凝胶电泳检测浓度，结果如图3所示。
2、 引物设计
根据GenBank己发表的黑曲霉半纤维素酶基因XYNB (GenBank的登录号为 DQ174549)、 XLND (GenBank的登录号为AF108944)、 DNA序列，应用PrimerPremier5.0 引物设计软件分别设计一对特异性引物，为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物 和下游引物的5'端分别加入限制性内切酶位点和保护碱基(画线部分为加入的酶切位 点)
XYNB上游引物5'-CTA CTC GAGATG CTC ACC AAG AAC CT-3， (XhoI)
下游引物5'陽GG GTC GAC TTA CTG AAC AGT GAT GGA G-3'
(Sail)
XLND上游引物5'-TT GGA TCC ATG GCG CAC TCA ATG TCT CGT-3， (BanHI)
下游弓l物5'-TTT GCG GCC GC CTA CTC CTT CCC AGG CCA CTT-3'
(Notl)
3、 黑曲霉半纤维素酶基因的PCR扩增以黑曲霉基因组DNA为模板，通过PCR扩增黑曲霉半纤维素酶基因的DNA片段， PCR扩整的反应体系使用大连宝生物公司的LA Taq酶(含GC buffer)。
1) XYNB:
反应体系25 U 1
2XGCbufferl (5mMMg2+ Plus) 12.5 yl
dNTP Mixture (各2.5m M) 4 iU
Upper primer (50 pmol/L) 0.5 n 1
Lower primer (50 pmol/L) 0.5 y 1
Template (70ng/ u 1) 1 "
LA-Taq酶(5u/ y 1) 0.3 n 1
灭菌ddH20 up to 25 y 1
反应条件-
94。C预变性5min
94。C变性35sec
53.4。C退火35sec - 30cycles
72。C延伸lmin _
72t:延伸8min
2) XLND
反应体系25ul
2 XGC buffer I (5mMMg2+ Plus) 12.5^L dNTP Mixture (10mmol/L) 4pL Upper primer (50 pmol/L) 1 Lower primer (50 pmol/L) 1 |oL
Template (70ng/ y 1) 1 P 1
LA-Taq酶(5u/iU) 0.3pL35cycles
灭菌ddH20 up to 25 u 1
反应条件 94。C预变性5min
94°C变性55sec
58。C退火55sec
72°C延伸lmin20sec 72。C延伸10min
PCR反应结束后，全量反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，结果如图 4a、 4b所示图4a为XYNB基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量 标准)泳道l在745bp处有一条清晰条带，图4b为XLND基因电泳检测图(泳道1为DNA 分子量标准，泳道2为PCR产物)泳道2在2508bp处有一条清晰条带。
4、 重组克隆载体pMD18-T-XYNB、 pMD18-T-XLND的构建
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，采用V-gene公司的DNA Gel Extraction Kit回 收目的片断。将回收的目的片段分别克隆到pMD18-T Vector,进行蓝白斑筛选。在 Eppendor滑内配制10ul反应体系，混匀16'C反应16h。反应液直接转化大肠杆菌DH5 a 感受态细胞，用含50mg/mlAmp+的LB抗性平板37'C培养过夜进行筛选。
5、 分别对三个基因的阳性菌落进行鉴定
1) 重组克隆载体质粒DNA的提取
对于每一个连接，挑取在上述抗生素平板上长出的单菌落接于5ml含50mg/ml Amp +的液体1^培养基中，190rpm， 37t:过夜培养。次日，取400iU菌液于1.5mlL离心观 管中，加80。/o甘油存于-80。C冰箱。其余菌液用碱裂解法提取质粒DNA。
2) 重组克隆载体质粒DNA的PCR和酶切检测
以重组质粒DNA为模板，分别PCR扩增半纤维素酶基因，反应体系和反应条件同 上；同时对重组质粒DNA做限制性内切酶双酶切(XYNB: XhoI和SalI XLND: BanHI和NotI)， 酶切体系20ul，混合液置于37^反应311。反应结束后，对PCR和酶切产物进行1% Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大小。结果如图5a、 5b所示图5a 为XYNB基因电泳检测图(泳道l为酶切产物，泳道2为DNA分子量标准，泳道3为20ul PCR产物)泳道l在2700bp和745bp处各有一条清晰条带，泳道3在745bp处有一条清晰 条带，图5b为XLND基因电泳检测图(泳道1为PCR产物，泳道2为DNA分子量标准，泳 道3为酶切产物)泳道l在2508bp处有一条清晰条带，泳道3在2700bp和2508bp处各有一 条清晰条带，两个基因的电泳结果与预期结果相符，初步证明重组克隆载体构建成 功。
将PCR和酶切鉴定都正确的重组克隆载体分别命名为pMD18-T- XYNB、 PMD18-T- XLND，然后将保存的菌液送去测序，测序由北京三博远公司完成。XYNB 测序结果与GenebankDQ174549黑曲霉XYNB基因同源性达100冗，XLND与Genebank AF108944黑曲霉XLND基因同源性达967。，表明所克隆的两个半纤维素酶基因都正确， 达到预期目的。
实施例2、半纤维素酶基因重组粟酒裂殖酵母表达载体的构建
含有目的基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC- XYNB、 pESPUC- XLND的 构建过程如图2a、 2b所示,具体步骤如下
1、 重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-XYNB、 pESPUC-XLND的构建 碱裂解法大量提取重组克隆载体pMD18-T- XYNB、 pMD18-T- XLND和表达载体
pESPUC(本实验室保存)质粒DNA，然后分别双酶切重组克隆载体 !^018-^ XYNB、 pMD18-T- XLND和粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC。酶切体系20u 1， pMD18-T- XYNB 和pESPUC用限制内切酶XhoI和SalI双酶切，pMDl8-T-XLND和pESPUC用限制内切酶 BamHI和 Notl双酶切，37'C酶切3h。反应结束后，全量反应液于1%的琼脂糖凝胶电 泳，分别回收DNA。最后分别用T4DNA连接酶连接目的片段和载体，反应体系10ul， 混匀，16'C反应16h。反应液直接转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用含5011^/1111八1^+ 的LB抗性平板37'C培养过夜进行筛选。
2、 重组粟酒裂殖酵母表达载体的鉴定1) 重组粟酒裂殖酵母表达载体质粒DNA的提取
对于每一个连接，挑取在上述抗生素平板上长出的单菌落接于5ml含50mg/ml Amp +的液体!^培养基中，190rpm,37。C过夜培养。次日，取400 U l菌液于1.5mlL离心观管 中，加80。/c甘油存于-8(TC冰箱。其余菌液用碱裂解法提取质粒DNA。
2) 重组粟酒裂殖酵母表达载体PCR和酶切鉴定
以重组表达载体质粒DNA为模板，分别对重组表达载体质粒进行PCR扩增和限制 性内切酶双酶切，反应体系和反应条件同重组克隆质粒的PCR检测和酶切检测。反应 结束后，对PCR和酶切产物进行iy。 Agarose凝胶电泳，观察片段的位置和大小。结果 如图6a、 6b所示图6a为XYNB基因电泳检测图(泳道l为酶切产物，泳道2为空载体 PCR产物，泳道3为重组表达载体PCR产物，泳道4为DNA分子量标准)泳道l在8900bp 和745bp处各有一条清晰条带，泳道2在745bp处没有条带，泳道3在745bp处有一条清晰 条带；图6b为XLND基因电泳检测图(泳道1为重组表达载体PCR产物，泳道2为重组表 达载体质粒，泳道3为酶切产物，泳道4为DNA分子量标准)泳道l在2508bp处有一条清 晰条带，泳道3在8900bp和2508bp处各有一条清晰条带;两个基因的电泳结果与预期结果 相符，证明重组表达载体构建成功,将PCR和酶切鉴定都正确的为阳性菌种命名为 pESPUC-XYNB、 pESPUC-XLND。
实施例3、重组粟酒裂殖酵母表达载体的转化及鉴定
1 、碱裂解法大量提取重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-XYNB、 pESPUC-XLND的质粒DN A
2、电穿孔转化法
宿主菌SP-Q01
YCD培养基酵母浸粉10g,葡萄糖20g,水解酪蛋白2g,山梨醇218.6g溶于1L蒸馏水
中
1.2M山梨醇218.604g山梨醇溶于lL蒸熘水中。 EMM培养基(L):邻苯二甲酸氢钠 14.7mM Na2HP04 15.5mM NH4C1 93.5mM 葡萄糖 lllmM
Salts2%(v/v)50XstockVitamins 0.l%(v/v) 1000 X stock
Minerals 0.0l%(v/v) 10000 X stock
Salts (50 X stock) (L)
MgCl2' 6H200.26MCaCl2* 2H204,99mM
KC10.67MNa2S0414.1mM
Vitamins (1000X stock)
泛酸4.20mM烟酸81.2mM
肌醇55.5mM生物素40.8Um
Minerals (10000Xstock)a)
硼酸80.9mMMnS0423.7mM
ZnS04 7H2013.9mMFeCl3* 6H207.40mM
钼酸2.47 mMKI6.02mM
CuS04 5H201.60mM柠檬酸47.6mM
1)酵母感受态细胞的准备
(1) 将酵母单菌落过夜培养于10mlYCD液体培养基中3(TC， 140rpm。
(2) 次日将10ml菌液转入500mlYCD培养基中过夜培养，30°C、 250rpm至浓度为lX 1()7细胞/ml, OD6oo=0.7。
(3) 将细胞放到冰浴上15min,使其停止生长。
(4) 轻轻将细胞倒入两个灭过菌的250ml离心管中，4。C、 3000rpm、离心15min，
收集菌体。
(5) 弃上清，将收集细胞的离心管置于冰上。
(6) 每管加入50ml灭过菌的冰上预冷的1.2M山梨醇悬浮细胞沉淀，加山梨醇至 250ml， 4°C、 3000rpm、离心5min，收集菌体，弃上清。(7) 重复步骤6。
(8) 加入20ml灭过菌的冰上预冷的1.2M山梨醇悬浮沉淀,每管分装200u 1，将细胞放 到冰上,尽可能快的电击。
2)用BIO-RADMicroPluser进行电击。
(1) 将预转化的质粒DNA(约l(ig)加入到200u l感受态细胞中，混均。
(2) 将MicroPluser设为"ShS"。
(3) 将DNA细胞样品转入0.2cm已预冷的电击杯中，轻轻敲打管底悬浮液，1.5kv、 25pF、 200Q、 4.48ms电击一次。
(4) 将杯拿出，加入冰冷的1.2M山梨醇0.8ml,然后将稀释的细胞转入到灭菌的离心 管中。
(5) 室温下，将离心管室温放置40-60min，使电击细胞在1.2M山梨醇的微量培养基 中培养生长。
(6) 将液体平铺于EMM-thiamine筛选培养基平板上，3(TC培养4 6天，直到长出单 菌落。
结果如图7a、 7b所示图7a为pESPUC-XYNB筛选出的酵母转化子， 图7b为 pESPUC-XLND筛选出的酵母转化子。
3、重组粟酒裂殖酵母转化子的分子鉴定
1) 挑取EMM-thiamine筛选培养基平板上的单菌落于EMM-thiamine液体培养基 中，30'C培养2天，使用试剂盒提取酵母质粒，将质粒DNA储存于-20'C冰箱。
2) 重组粟酒裂殖酵母转化子质粒DNA的PCR鉴定
将上述提取的质粒DNA做PCR鉴定。反应条件和反应体系同重组克隆载体质粒 DNA的PCR检测。将PCR产物在P/。的琼脂糖凝胶中进行电泳分析,观察片段的位置和大 小。结果如图10a、 10b所示图8a为XYNB基因电泳检测图(泳道1为DNA分子量标 准，泳道2、为PCR产物)泳道2在745bp处有一条清晰条带，图8b为XLND基因电泳检 测图(泳道1为DNA分子量标准，泳道2为PCR产物)泳道2在2508bp处有一条清晰条带，两个基因的电泳结果与预期结果相符，证明得到重组菌株。将鉴定正确的阳性菌 株命名为SP-Q01/pESPUC-XYNB禾口SP-Q01/pESPUC-XLND 。
实施例4、半纤维素酶基因在粟酒裂殖酵母中表达的检测 1、目的蛋白的诱导表达
YES培养基酵母浸粉Q.5%(w/v) 葡萄糖3.0%(w/v) 腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸， 尿嘧啶，赖氨酸，氢氧化物50-250 mg/1
PBS缓冲液(100ml) : NaCl 0.82g KC1 0.02g
Na2HP04 0.36g KH2P04 0.025g
ESB缓冲液(可在4'C贮存数天)
80 mmol/L Tris陽HCl (pH 6.8) 10%甘油 2% SDS 1.5% 二硫基苏糖醇(DTT) O.lmg/ml溴酚蓝
1) 酵母细胞培养的准备
(1) 将含有重组质粒的酵母转化子细胞及含有空载体的酵母转化子细胞接种到5mL YES培养基中30。C、 250rpm过夜培养。
(2) 接种约lmL过夜酵母细胞于1 OmL YES培养基中过夜培养,直到006()()=0.2-0.4。
(3) 30°C 、 250rpm继续培养约5小时,使OD6ocr0.7-1.0。
(4) 将10mL的细胞分装入两个50mL的离心管中，每个5mL。用"未诱导"标志一 试管,另一试管标志"诱导"。
(5) 室温、1000rpm、离心5min，收集酵母细胞沉淀。
(6) 弃上清，每管中加入50mL的去离子水洗涤酵母细胞沉淀，室温、1000rpm、离 心5min，弃上清。
(7) 重复一次步骤F。
2) GST蛋白的诱导步骤
(1)将酵母细胞沉淀分别培养于10mL EMM培养基中，加10nL的5mM抽滤的硫铵 (VB1)于标记"未诱导"的试管中30。C 、 250rpm培养酵母细胞18-20个小时。(2) 为判断重组蛋白诱导是否成功，分别吸移lmL的菌液于1.5mL离心管中，4°C、 1000rpm离心5min，收集酵母细胞沉淀。
(3) 弃上清，保存酵母细胞沉淀于-80。C，在下一步的SDS-PAGE验证中使用。 3)酵母蛋白的提取
(1) 向GST蛋白的诱导步骤3中得到的酵母细胞沉淀中加入5OmM Tris-HCL (PH7.5)和10mM叠氮化钠溶液悬浮沉淀。
(2) 4。C、 1000rpm、离心5min收集沉淀细胞。
(3) 弃上清，用30uLESB缓冲液悬浮细胞。
(4) 10(TC保温3min，使蛋白酶失活之后，将样品存放于-20。C。
(5) 加入0.3g直径0.2mm的玻璃珠，剧烈振荡混合2min。
(6) 加入150uLESB缓冲液，稍加振荡，置10(TC保温lmin。
(7) 取5-20n L抽提液上样进行SDS凝胶电泳。
3、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
将上述所提蛋白进行SDS-PAGE,结果如图9所示(泳道l为空载转化子，泳道2为 XYNB转化子,泳道3为XLND转化子，泳道4为Marker)在约24KD和93KD处有特异蛋白 带，与己知的理论分子量一致，说明半纤维素酶基因在粟酒裂殖酵母中得到表达。
4、 DNS法(3， 5—二硝基水杨酸比色定糖法)测定重组酵母转化子 SP-QO/pESPUC-XYNB酶活
先将生长在EMM+VBl固体培养基上的重组酵母转化子SP-Q01/pESPUC-XYNB和 SP-Q01/ pESPUC分别接种于5mL EMM液体培养基中诱导培养，当重组酵母达到对数 生长期时(OD6(W=0.7-0.8),分别接入50mL的EMM液体培养基中，重组酵母经扩大诱 导培养12小时后，进行半纤维素酶酶活测定，其中SP-Q01/ pESPUC为对照。取培养后 的菌液1.5mL，离心后取lmL的上清液，采用DNS法在550nm下测定重组 SP-Q01/pESPUC-XYNB酶活，XYNB以水杨苷为底物。
l)酶活的定义5(TC时每小时产生1微克分子木糖的酶量为一个酶活力单位。 2)酶活的计算
样品木糖量(mg) —对照木糖量(mg) U/ml= X 10:'
12(h) XI (ml)
结果如图10a所示，测定了培养0-96h的重组半纤维素酶酶活，重组酵母转化子在不 同培养时间内均有酶活性，目的基因表达最高水平出现在36-96h， SP-Q01/pESPUC-XYNB在培养0-60h间酶活逐渐升高，在培养60h达到最高，为 155U/mL，从60h到96h酶活逐渐降低，说明黑曲霉半纤维素酶酶基因前部的信号肽能 够被粟酒裂殖酵母正确的识别，并借助自身的信号肽序列将绝大部分表达产物分泌到 胞外培养液中，并且重组酶在20 — 8(TC均有酶活力，最适温度分别为XYNB 50°C。
5重组酵母转化子SP-Q01/pESPUC-XLND酶活测定
先将生长在EMM+VBl固体培养基上的重组酵母转化子SP-Q01/pESPUC-XLND和 SP-Q01/ pESPUC分别接种于5mL EMM液体培养基中诱导培养，当重组酵母达到对数 生长期时(OD6W)=0.7-0.8)，分别接入50mL的EMM液体培养基中，重组酵母经扩大诱 导培养12小时后，进行半纤维素酶酶活测定，其中SP-Q01/pESPUC为对照。取培养后 的菌液lmL，离心后取0.5mL的上清液，P-木糖苷酶活性是由从底物对硝基苯酚-0-D-木糖苷(p-m'"o;7/^wj^-Z)-;^/opyramw/cfe，;W尸^^释放出对硝基苯酚的量来确定的，采 用分光光度法在410nm下测定。
1) 酶活定义
70°C， lmin内催化产生lumol的对硝基苯酚所需要的酶量。
2) 酶活的计算样品对硝基苯酚量(mg) —对照对硝基苯酚量(mg)
木糖苷酶活力-(IU/ml)
30 minx0,139 (mg/umol)x0.5 mL
结果如图10b所示，测定了培养0-96h的重组半纤维素酶酶活，重组酵母转化子在
不同培养时间内均有酶活性，目的基因表达最高水平出现在36-96h，
SP-Q01/SP-Q01/pESPUC-XLND在培养0-72h间酶活逐渐升高，在培养72h达到最高为
86U/mL，从72h到96h酶活逐渐降低，说明黑曲霉半纤维素酶酶基因前部的信号肽能够
被粟酒裂殖酵母正确的识别，并借助自身的信号肽序列将绝大部分表达产物分泌到胞
外培养液中，并且重组酶在30—9(TC均有酶活力，最适温度分别为XLND65'C。序列表
〈110〉吉林农业大学
〈120〉 一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法 〈130〉 wangpiwu200701-03 <160> 2
<170〉 Patentln version 3.2
<210> 1
〈211〉 745
〈212〉 ■
〈213〉黑曲霉
<400〉 1
1 atgctcacca agaaccttct cctctgcttc gccgcagcta aggctgttct ggccgttccc 61 cacgactctg tcgtcgagcg ttcggatgcc ttgcacaagc tctctgagcg ttcgaccccg
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〈210〉 2 〈211〉 2508 〈212〉 mRNA 〈213〉黑曲霉 〈400〉 2
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权利要求
1、一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建的含有半纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。
2、 如权利要求l所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特征 是将半纤维素酶基因插入到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的重组粟酒裂殖 酵母表达质粒导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母 使半纤维素酶基因得到分泌表达。
3、 根据权利要求l所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于重组粟酒裂殖酵母表达载体含有Pnmtl启动子、半纤维素酶基因、P咖tl终止子序列、以及筛选标志。
4、 根据权利要求3所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于重组粟酒裂殖酵母表达载体含有半纤维素酶基因为内切木聚糖酶基因XYNB，其序列如SEQ ID NO.l所述和木糖苷酶基因XLND，其序列如SEQ ID N0.2所述。
5、 根据权利要求4所述具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于内切 木聚糖酶XYNB基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESPLIC的多克隆位点处的XhoI和SalI限制性内 切酶酶切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESPUC-XYNB，获得的重组粟酒裂 殖酵母工程菌为SP-Q01/pESPUC-XYNB,所述半纤维素酶XLND基因位于粟酒裂殖酵母表达载体 pESPUC的多克隆位点处的BamHI和Notl限制性酶酶内切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表 达载体为pESPUC-XLND，获得的重组粟酒裂殖酵母菌株为SP-Q01/pESPUC-XLND。
6、 根据权利要求3所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于筛 选标志一种为氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance Amp，，其允许在大肠杆菌 (E.coli)克隆时进行载体的复制和抗生素选择；另一种为选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵 母(Saccharomy cescerevisiea)可以作为向粟酒裂殖酵母(S. pombe)细胞中转化表达结构的 选择标定物亮氨酸。
7、 根据权利要求2所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特 征在于半纤维素酶基因的表达是将构建的含有半纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载 体的质粒DNA，采用电穿孔法导入粟酒裂殖酵母SP-Q01中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母转化子使半纤维素酶基因得到分泌表达。
8、根据权利要求7所述的具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的构建方法，其特 征在于重组粟酒裂殖酵母在表达半纤维素酶基因无须加入诱导物，半纤维素酶基因前端自 带的信号肽序列可使半纤维素酶基因获得分泌表达，表达时间为2 6天。
全文摘要
本发明涉及一种具有半纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。是将是将构建的含有半纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的；构建方法是构建含有半纤维素酶基因的粟酒裂殖酵母表达载体，将其导入粟酒裂殖酵母中获得重组酵母转化子，培养重组酵母使半纤维素酶酶基因得到分泌表达。本发明弥补了传统半纤维素酶制备方法以及原核表达系统、其他酵母表达系统的不足。应用于工业化半纤维素酶的生产，则具有酶活性高，热稳定性强，生长周期短，提取成本低的优点。
文档编号C12R1/85GK101412973SQ20081005151
公开日2009年4月22日 申请日期2008年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者付永平, 静 曲, 李晓婷, 王丕武 申请人:吉林农业大学